लाइव सेल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी उपसेलुलर प्रोटीन स्थानीयकरण और बैक्टीरिया में सेल आकृति विज्ञान परिवर्तन की जांच करने के लिए

Immunology and Infection

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Summary

यह लेख प्रोटीन उप-कोशिकीय स्थानीयकरण गतिशीलता की जांच करने और बैसिलस सबटिलिस और स्टेफिलोकोकस ऑरियस में उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके रूपात्मक परिवर्तनों की निगरानी करने के लिए एक कदम-दर-कदम गाइड प्रदान करता है।

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Brzozowski, R. S., White, M. L., Eswara, P. J. Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria. J. Vis. Exp. (153), e59905, doi:10.3791/59905 (2019).

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Abstract

कोशिका विभाजन और बैक्टीरिया में सेल आकार को प्रभावित करने वाले कारकों की जांच आमतौर पर उच्च संकल्प फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में की जाती है क्योंकि जनसंख्या स्तर पर की गई टिप्पणियां वास्तव में प्रतिबिंबित नहीं हो सकती हैं कि एक ही कोशिका स्तर पर क्या होता है। लाइव-सेल टाइमलैप्स माइक्रोस्कोपी जांचकर्ताओं को सेल डिवीजन या सेल आकृति विज्ञान में परिवर्तनों की निगरानी करने की अनुमति देती है जो प्रोटीन के उपसेलुलर स्थानीयकरण और जीन अभिव्यक्ति के समय के बारे में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, जैसा कि ऐसा होता है, महत्वपूर्ण जैविक प्रश्नों का उत्तर देने में संभावित सहायता करने के लिए। यहां, हम एक उच्च संकल्प डेकोनोलुयूशन माइक्रोस्कोप का उपयोग करबैसिलस सबटिलिस और स्टेफिलोकोकस ऑरियस में फेनोटाइपिक परिवर्तनों की निगरानी करने के लिए अपने प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस रिपोर्ट का उद्देश्य एक सरल और स्पष्ट प्रोटोकॉल प्रदान करना है जिसे अन्य जांचकर्ताओं द्वारा बैक्टीरिया के साथ-साथ अन्य जीवों में विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के संचालन में रुचि रखते हैं ।

Introduction

बैक्टीरियल सेल बायोलॉजी के क्षेत्र में माइक्रोस्कोपी तकनीक 1,2में हाल की प्रगति से काफी बढ़ाया गया है । अन्य उपकरणों में, माइक्रोस्कोप जो टाइमलैप्स फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी प्रयोगों का संचालन करने में सक्षम हैं, एक मूल्यवान उपकरण बने हुए हैं। जांचकर्ता फ्लोरोसेंट प्रोटीन जैसे हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) -आधारित ट्रांसक्रिप्शन और ट्रांसलेशनल रिपोर्टर फ्यूजन, फ्लोरोसेंट डी-अमीनो एसिड (एफडीएए)3का उपयोग करके वास्तविक समय में विभिन्न शारीरिक घटनाओं की निगरानी कर सकते हैं, या सेल वॉल, झिल्ली और डीएनए को लेबल करने के लिए अन्य दाग का उपयोग कर सकते हैं। इसलिए यह कोई आश्चर्य की बात नहीं है कि फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी माइक्रोबियल सेल जीवविज्ञानियों के बीच लोकप्रिय बनी हुई है । बस अंत फेनोटाइप दिखाने के अलावा, यह जानकारी प्रदान करते हैं कि टाइमलैप्स माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखे गए फेनोटाइप कैसे उत्पन्न होते हैं, निष्कर्षों में महत्वपूर्ण मूल्य जोड़ सकते हैं और संभावित रूप से सुराग प्रदान करते हैं कि संभावित दवा उम्मीदवारों द्वारा सेलुलर प्रक्रियाओं को क्या लक्षित किया जा रहाहै।

एक पूरी तरह से मोटर चालित, उल्टे, चौड़े क्षेत्र फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग कर उच्च संकल्प इमेजिंग का संचालन करने के लिए प्रोटोकॉल (सामग्री की तालिकादेखें) इस लेख में प्रदान किए गए हैं । इन प्रोटोकॉलों को अन्य फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप की जरूरतों के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है जो टाइमलैप्स माइक्रोस्कोपी आयोजित करने में सक्षम हैं। यद्यपि यहां चर्चा किए गए सॉफ़्टवेयर विशिष्ट निर्माता-आपूर्ति किए गए सॉफ़्टवेयर से मेल खाता है जैसा कि सामग्री की तालिकामें इंगित किया गया है, आमतौर पर अन्य माइक्रोस्कोप निर्माताओं या स्वतंत्र रूप से उपलब्ध इमेजजे5द्वारा आपूर्ति किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर में माइक्रोस्कोपी डेटा का विश्लेषण करने के लिए समकक्ष उपकरण हैं। उन स्थितियों के लिए जहां टाइमलैप्स अनुकूल नहीं है, इस लेख में वर्णित समय-पाठ्यक्रम प्रयोग किए जा सकते हैं। बी सबटिलिस और एस ऑरियस: यहां वर्णित प्रोटोकॉल दो अलग-अलग बैक्टीरियल प्रजातियों में फेनोटाइपिक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत गाइड प्रदान करते हैं। उपयोग किए जाने वाले उपभेदों के लिए टेबल 1 देखें।

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Protocol

1. सामान्य विकास की स्थिति

  1. उचित विकास माध्यम के 2 मिलील टीका एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक (जहां आवश्यक हो) तनाव (ओं) के एक ही कॉलोनी के साथ छवि हो । इन बीज संस्कृतियों को एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 22 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस लेख में उपयोग की जाने वाली विशिष्ट जीवाणु विकास स्थितियां प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग के तहत प्रदान की जाती हैं।
  2. एक १२५ mL फ्लास्क में ताजा मीडिया में रातोंरात संस्कृतियों 1:20 पतला, एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक (जहां आवश्यक हो) ।
  3. मध्य logarithmic चरण (OD600 = 0.5) तक एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति (एस) बढ़ें।
    नोट: प्रेरक या अवरोधक को उचित विकास चरण में बढ़ती संस्कृति (एस) में सीधे जोड़ा जा सकता है।
  4. माइक्रोस्कोपी नमूना तैयारकरने के लिए वांछित संस्कृति की स्थिति में फसल कोशिकाओं के रूप में निम्नलिखित अनुभाग में वर्णित है।

2. नमूना तैयारी

  1. 0.25 ग्राम आणविक जीव विज्ञान ग्रेड, कम ईईओ, एगरोज के साथ 25 मिलीग्राम विकास माध्यम के साथ 1% अगारोज तैयार करें जो टाइमलैप्स माइक्रोस्कोपी या बाँझ पानी के लिए उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं (जहां आवश्यक हो) के साथ पूरक हैं। मिश्रण को लगभग 30 एस के लिए माइक्रोवेव की मदद से गर्म करें और इसे बाँझ 100 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश में डालें और इसे जमना दें।
  2. जरूरत के आधार पर सेल कल्चर का 5-50 माइक्रोन एलिकोट लें और कोशिकाओं पर दाग दें। इस स्तर पर उपयुक्त रंगों के साथ दाग कोशिकाओं (उदाहरण के लिए, एक प्रयोग(चित्रा 1)के लिए फ्लोरोसेंट रंगी FM4-64 (झिल्ली दाग) जोड़ें ।
    1. एक 35 मिमी ग्लास बॉटम कल्चर डिश (14 मिमी माइक्रोवेल व्यास और अनकोटेड नंबर 1.5 कवरस्लिप के साथ) के नीचे चित्रित करने के लिए संस्कृति नमूना या दाग दार नमूना का 5 μL aliquot पिपेट करें; सामग्री की तालिकादेखें)।
      सावधानी: विशेष रूप से टाइमलैप्स माइक्रोस्कोपी के लिए पॉली-एल-लाइसिन कोटेड कवरस्लिप का उपयोग न करें क्योंकि वे विभिन्न विकास पैटर्न को प्रेरित कर सकते हैं (हमने इसे पॉली-डी-लाइसिन के साथ भी देखा है; डेटा नहीं दिखाया गया है) और/या प्रोटीन गतिशीलता6को प्रभावित करें ।
    2. रंगों के उपयोग को कम करने के लिए, दाग 3-4 μL सेल निलंबन (ओडी600 = 0.5 पर काटा; लगभग 2.7 x 107 और 3.4 x 107 बी सबटिलिस और एस ऑरियस प्रति 1 मिलीग्राम संस्कृति के लिए) सीधे ग्लास बॉटम डिश पर।
    3. एक पूर्व कट अगारोज स्लैब (व्यास में 11 मिमी या किसी भी वांछित आकार के कवरस्लिप के क्षेत्र को ओवरलैप करने के लिए रखें; नमूने के शीर्ष पर बाँझ ट्यूब या रेजर ब्लेड के खुले छोर का उपयोग करके कट करें और यह सुनिश्चित करने के लिए धीरे से टैप करें कि अगारोज स्लैब कवरस्लिप के खिलाफ सपाट पड़ा हुआ है।
  3. इमेजिंग के बाद (निम्नलिखित अनुभाग देखें), यदि देखने के क्षेत्र में कोशिकाओं की संख्या वांछनीय नहीं है, तो केंद्रीकरण द्वारा कमजोर पड़ने या एकाग्रता के माध्यम से नमूने के सेल घनत्व को समायोजित करें और आवश्यक रूप से विकास माध्यम/बफर का उपयोग करके नमूने में कोशिकाओं के अनुपात को बदल दें ।
    नोट: संस्कृति माध्यम से निकलने वाले ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करने के लिए, कोशिकाओं को बफर में धोया जा सकता है (उदाहरण के लिए मानक 1x फॉस्फेट बफर खारा में) और इमेजिंग से पहले बफर की उचित मात्रा में फिर से निलंबित किया जा सकता है। यह संभव है कि इस चरण में छोटी कोशिकाओं या वेसिकल्स को केंद्रीकरण के बाद बरकरार नहीं रखा जा सकता है और इसलिए खो जाएगा।
  4. आगारोज पैड को सुखाने से रोकने के लिए संस्कृति डिश (कवरस्लिप के आसपास) के अंदर की जगह पर एक पिपेट (~ 5 μL बूंदें) का उपयोग करके पानी जोड़ें, और छवि अधिग्रहण के दौरान आर्द्रता बनाए रखने में मदद करने के लिए, विशेष रूप से टाइमलैप्स प्रयोगों के लिए।
  5. संस्कृति व्यंजन को ऊष्मायन कक्ष के अंदर तापमान के लिए समतुल्य करने की अनुमति दें, निर्माता द्वारा प्रदान किया गया एक अंतर्निहित अपारदर्शी डिब्बे, 15-20 न्यूनतम के लिए माइक्रोस्कोप का।
    नोट: हीटिंग तत्व चालू करें और इमेजिंग से कई घंटे पहले इन्क्यूबेशन चैंबर को वांछित तापमान पर सेट करें। यह सुनिश्चित करेगा कि हार्डवेयर नए तापमान को स्थिर करता है। लंबे समय तक टाइमलैप्स इमेजिंग के लिए, आर्द्रता बनाए रखने के लिए कार्य क्षेत्र से दूर माइक्रोस्कोप कक्ष के अंदर पानी के साथ बीकर या फ्लास्क रखें।

3. इमेजिंग

  1. प्रयोग के दिन माइक्रोस्कोप सिस्टम चालू करें। डेस्कटॉप पर उपयुक्त आइकन पर क्लिक करके इमेजिंग सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) शुरू करें। सॉफ्टवेयर के स्टार्ट-अप डायलॉग बॉक्स पर इनिप्लिज़ माइक्रोस्कोप ऑप्शन (उस पर माइक्रोस्कोप के साथ दर्शाया गया बटन) पर क्लिक करके माइक्रोस्कोप को शुरू करें। सुनिश्चित करें कि प्रारंभिक से पहले माइक्रोस्कोप मोटे समायोजन का उपयोग करके उद्देश्य को पूरी तरह से कम किया जाता है।
    नोट: आरंभीकरण के बाद स्टार्ट मेनू के अलावा तीन अतिरिक्त संवाद बॉक्स दिखाई देने चाहिए: समाधान 3D, डेटा संग्रह और फ़िल्टर मॉनिटर।
  2. निर्माता द्वारा आपूर्ति किए गए 100x तेल विसर्जन उद्देश्य पर 1.517 (अपवर्तक सूचकांक) तेल की एक बूंद रखें (संख्यात्मक एपर्चर = 1.4, वर्किंग डिस्टेंस = 0.12 मिमी; सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: जिस तापमान पर इमेजिंग आयोजित की जाती है, उसके लिए उचित विसर्जन तेल का चयन करना महत्वपूर्ण है।
  3. धातु आवास (ताबूत) में नमूना युक्त ग्लास बॉटम डिश लोड करें और धीरे-धीरे चरण क्लैंप में स्लाइड करें।
  4. मोटे समायोजन घुंडी का उपयोग करने के लिए उद्देश्य बढ़ाने के लिए जब तक तेल पकवान के गिलास नीचे के साथ संपर्क करता है । नमूना को ध्यान में लाने के लिए आंख के टुकड़े और ठीक समायोजन घुंडी का उपयोग करें। एक बार कोशिकाओं को ध्यान में कर रहे है पलक आंख टुकड़ा से कैमरा मोड के लिए स्लाइड चयनकर्ता स्विच बाईं ओर माइक्रोस्कोप शरीर के सामने स्थित ले जाकर ।
  5. इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रयोग शुरू करें। resolve3D विंडो पर, एक फ्लास्क द्वारा चित्रित डिजाइन/रन प्रयोग आइकन का चयन करें। एक नया संवाद बॉक्स डिजाइन/रन प्रयोगका हकदार दिखाई देना चाहिए ।
    1. डिजाइन का उपयोग करजेड-स्टैक और नमूना मोटाई की संख्या निर्धारित करें और फिर डिजाइन/रन प्रयोग संवाद बॉक्स पर टैब को अनुभागित करें।
      नोट: प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में प्रयोगों के लिए, अभी भी छवियों के लिए 200 एनएम अंतराल पर 17 जेड-स्टैक और टाइमलैप्स माइक्रोस्कोपी के लिए 200 एनएम अंतराल पर चार जेड-स्टैक का उपयोग किया गया था।
    2. नमूने में कोशिकाओं की मोटाई को मापने के लिए, संकल्प 3डी संवाद बॉक्स पर ऊपर और नीचे तीर का उपयोग करके जेड-प्लेन को संवर्द्धित रूप से समायोजित करें। मार्क जहां कोशिकाओं को छवि अधिग्रहण के लिए ऊपरी और निचली सीमा के रूप में बाहर जाने का ध्यान केंद्रित । प्रयोग चलाने से पहले इस जानकारी को आयात करें।
    3. टाइमलैप्स इमेजिंग के दौरान फोटोटॉक्सिकिटी और फोटोब्लीचिंग को कम करने में मदद करने के लिए, जेड-स्टैक की संख्या को कम करने और छवि अधिग्रहण के लिए कोशिकाओं के मध्य-विमान का चयन करें।
  6. डिजाइन का उपयोग कर प्रयोग के लिए उपयुक्त फ़िल्टर सेट का चयन करें और फिर डिजाइन/रन प्रयोग संवाद बॉक्स (TRITC: पूर्व 542/27) पर चैनल टैब; EM 597/45; FITC/GFP: पूर्व 475/28; EM 525/48; mCherry: पूर्व 575/25; EM 632/60; Cy5: पूर्व 632/22; EM 676/34) ।
    1. इसके अलावा, पीओएल/डीआईसी जानकारी के संग्रह के लिए एक संदर्भ का चयन करें । संकल्प 3डी संवाद बॉक्स पर उपयुक्त विकल्पों का चयन करके इमेजिंग से पहले चयनित व्यक्तिगत चैनलों के लिए प्रतिशत संचरण (प्रकाश तीव्रता) और एक्सपोजर की अवधि समायोजित करें।
      नोट: प्रयोग परीक्षण इन सेटिंग्स के लिए विचार नहीं किए जाने वाले परीक्षण क्षेत्र में यह पहचानने के लिए कि क्या चयनित पैरामीटर कमजोर संकेत को याद किए बिना या इसे ओवरसैचुरेटेड किए बिना सार्थक फ्लोरेसेंस डेटा प्राप्त करते हैं। फिर इन मापदंडों को प्रायोगिक सेट अप के लिए आयात करें।
  7. संकल्प 3D संवाद बॉक्स पर अंक सूची बटन का चयन करअंक सूची खोलें। एक नया संवाद बॉक्स हकदार अंक सूचीदिखाई देना चाहिए । माइक्रोस्कोप स्टेज नियंत्रण का उपयोग करके और अंक सूची संवाद बॉक्स पर मार्क पॉइंट विकल्प का चयन करके प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले दृश्य के कई क्षेत्रों को चिह्नित करें।
    नोट: एक जगह बिंदु हर बार माइक्रोस्कोप अंक सूची में एक बिंदु पर refocused है का चयन किया जाना होगा । यह सूची में उचित बिंदु पर माइक्रोस्कोप ध्यान केंद्रित करके और फिर जगह बिंदु बटन का चयन करके किया जा सकता है। पुनर्फोकस करते समय एनालॉग मोटे/फाइन एडजस्टमेंट नॉब को न छूना महत्वपूर्ण है; फोकस को समायोजित करने के लिए केवल सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।
  8. पहले डिजाइन का चयन करके टाइमलैप्स पैरामीटर सेट करें और फिर डिजाइन/रन एक्सपेरिमेंट डायलॉग बॉक्स पर टाइमलैप्स टैब करें । टाइमलैप्स चेक बॉक्स का चयन करें। टाइमलैप्स इमेज/टोटल टाइम के हिसाब से उचित टाइमलैप्स पैरामीटर ्सटर करें।
  9. सेट अंक पहले डिजाइन का चयन करके अंक सूची से चित्रित किया जा करने के लिए और फिर डिजाइन पर अंक टैब/ यात्रा अंक सूची विकल्प का चयन करें और अंक दर्ज करने के लिए अल्पविराम या हाइफेन्स द्वारा अलग पाठ बॉक्स में छवि हो अगर यह एक पूरा अनुक्रम है ।
  10. प्रयोग शुरू करने से पहले, डिजाइन/रन डायलॉग बॉक्स पर रन टैब का उपयोग करके फ़ाइल नामों और फ़ाइल स्थानों को संपादित करें। सेटिंग्स बटन का चयन करके, डेटा फ़ोल्डर का चयन करके और तब तक उपयुक्त फ़ोल्डर का चयन करके या नया बनाकर फ़ाइल स्थान बदला जा सकता है। इमेज फाइल नाम टेक्स्ट बॉक्स में नई फाइल नाम डालकर फाइल नाम बदलें।
  11. शुरू प्रयोग संवाद बॉक्स पर प्ले बटन का चयन करके प्रयोग शुरू करें।
    नोट: timelapse के लिए, लगातार डीआईसी सेटिंग का उपयोग कर प्रयोग भर में देखने के प्रत्येक क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित की जांच (अनावश्यक फोटोब्लीचिंग से बचने के लिए) और refocus और अंक सूची में जानकारी अद्यतन के रूप में कोशिकाओं को समय के साथ ध्यान से बाहर जाना करते हैं ।

4. इमेज प्रोसेसिंग

  1. आंकड़ों की पीढ़ी के लिए वांछित कच्चे (R3D) छवि फ़ाइलों को खोलें।
    नोट: हाल ही में सहेजी गई फाइलें इमेजिंग सॉफ्टवेयर के स्टार्ट-अप डायलॉग बॉक्स पर डेटा फ़ोल्डर बटन का उपयोग करके स्थित की जा सकती हैं।
  2. एक डेकोवोल्व्ड D3D छवि फ़ाइल का उत्पादन करने के लिए, आउट-ऑफ-फोकस फ्लोरेसेंस लाइट7,8को हटाने के लिए, डेकोवोलुशन प्रोग्राम चलाएं। स्टार्ट-अप डायलॉग बॉक्स पर प्रोसेस टैब का चयन करें, और फिर डेकोवोलवका चयन करें। एक नया डायलॉग बॉक्स डेकोवोलेवका हकदार दिखाई देगा ।
    1. उचित छवि संख्या (प्रत्येक छवि फ़ाइल के ऊपरी बाएं हाथ के कोने में स्थित) को डेकोनोलुयूशन संवाद बॉक्स पर इनपुट पर खींचकर डेकोनोलुयूशन पैरामीटर सेट करें। डेकोवोन्यूशन डायलॉग बॉक्स पर, अधिक विकल्प बटन का चयन करें, और चेक बॉक्स प्रसंस्करण के बाद फसल सीमा रोलऑफ का चयन करें (अन्यथा छवियों को संबंधित डीआईसी फ़ाइल पर आरोपित नहीं किया जा सकता है)।
    2. कच्ची छवि फ़ाइल को कम करने के लिए डेकोवोलुयूशन डायलॉग बॉक्स पर करें बटन।
      नोट: डेकोvolोशन मापदंडों को समायोजित किया जा सकता है जैसा कि वांछित परिणामों के लिए सॉफ्टवेयर निर्माता के मार्गदर्शन मैनुअल द्वारा इंगित किया गया है।
  3. यदि आवश्यक हो, तो किसी भी या सभी तरंगदैर्ध्य (रंग) चैनलों में मैनुअल बैकग्राउंड शोर घटाव और चमक/विपरीत समायोजन करें। डिकोवोर्व्ड इमेज फाइल पर कंट्रास्ट एडजस्टमेंट बटन का चयन करके ऐसा करें।
  4. D3D डायलॉग बॉक्स के शीर्ष पर फ़ाइल विकल्प का चयन करके छवि को झगड़ा फ़ाइल के रूप में सहेजें। फिर सेव को झगड़ा के रूप में चुनें, उचित जेड-स्टैक (जो ध्यान के भीतर हैं), वांछित फ़िल्टर सेट का चयन करें या अचयनित हों।
  5. किसी भी निर्माता द्वारा आपूर्ति किए गए सॉफ़्टवेयर या इमेजजे5जैसे स्वतंत्र रूप से उपलब्ध कार्यक्रमों का उपयोग करके डेटा क्वाटिफिकेशन करें।
    1. सेल साइज क्वांटिफिकेशन के लिए उपयुक्त D3D इमेज फ़ाइल पर टूल टैब पर क्लिक करें, और फिर उपाय दूरी विकल्प का चयन करें। बाएं क्लिक के माध्यम से माउस का उपयोग करके वांछित छवि फ़ाइल पर स्टार्ट और एंड पॉइंट्स का चयन करके दूरी मापें।
      नोट: सेल साइज क्वांटिफिकेशन के दौरान इमेज को ज़ूम इन करना सबसे अच्छा है।
    2. फ्लोरेसेंस सिग्नल क्वांटिफिकेशन के लिए उपयुक्त D3D इमेज फ़ाइल पर टूल टैब के तहत डेटा इंस्पेक्टर विकल्प का उपयोग करें।
      नोट: छवि पर ज़ूम इन करना और फ्लोरेसेंस सिग्नल क्वाटिफिकेशन पूरा करते समय केवल प्रासंगिक फ़िल्टर चुनना सबसे अच्छा है।
    3. फ्लोरेसेंस सिग्नल की मात्रा निर्धारित करने के लिए, विशिष्ट आयाम के लिए सेट कॉलम/पंक्ति विकल्प के साथ एक बॉक्स ड्रा करें । मात्रा निर्धारित करने और मूल्य रिकॉर्ड करने के लिए संकेत के साथ एक क्षेत्र का चयन करें। कोशिकाओं के तुरंत बाहर एक क्षेत्र का चयन करने के लिए एक ही आकार बॉक्स का उपयोग करके पृष्ठभूमि संकेत उपाय। सेल के भीतर प्राप्त फ्लोरेसेंस सिग्नल से दर्ज मूल्य से पृष्ठभूमि मूल्य को घटाएं।

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Representative Results

जीपीएसबी फेनोटाइप
पहले हमने दिखाया है कि एसए-जीपीएसबी एक आवश्यक प्रोटीन है क्योंकि जीपीएसबी की कमी सेल लाइसिस9में एंटीसेंस आरएनए परिणामों का उपयोग कररही है। यहां हम वर्णन करते हैं कि इस लेख में वर्णित टाइमलैप्स माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल का उपयोग करके विभिन्न सेल डिवीजन फेनोटाइप और प्रोटीन स्थानीयकरण में परिवर्तन के उद्भव को कैसे कैप्चर किया जा सकता है। इस उद्देश्य के लिए, एस ऑरियस उपभेदों RB143 [SH1000 शरण pEPSA5 (खाली वेक्टर)] और GGS8 [SH1000 शरण pGG59(पीजाइल-gpsBएंटीसेंसबला बिल्ली)]पहले9की सूचना दी, इस प्रकार के रूप में उगाया गया । उपभेदों RB143 और GGS8 एक 15 मीटर परीक्षण ट्यूब में 5 μg/mL क्लोरम्फेनिकोल (क्लोर) के साथ पूरक ट्रिप्टिक सोया शोरबा (TSB) के 2 mL में टीका लगाया गया था और मिलाते हुए 22 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेटेड थे । रातोंरात संस्कृतियों को 125 मिलीग्राम फ्लास्क में ताजा टीएसबी + क्लोर के 10 मिलील में 1:20 पतला किया गया था और मध्य-लॉगरिथम चरण (ओडी600 = 0.5) तक मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर उगाया गया था। प्रेरक, 1% जाइलोज, संस्कृति माध्यम में जोड़ा गया था gpsB के एंटीसेंस आरएनए की अभिव्यक्ति को ट्रिगर करने के लिए और संस्कृति एक और 3 एच के लिए उगाया गया था कोशिकाओं को तो फ्लोरोसेंट रंगी FM4-64 (झिल्ली दाग), जहां आवश्यक के साथ दाग थे, एक 10 μg/FM4 के mL स्टॉक के ०.५ μL के अलावा द्वारा सीधे 5 माइक्रोस्कोप पर संस्कृति के l aliquot वर्णित जैसा कि चित्र 1 और वीडियो 1में दिखाया गया है, जीजीएस8 तनाव को प्रेरित करने के लिए जाइलोस के अलावा एक "बीमार" सेल फेनोटाइप के परिणामस्वरूप, जैसा कि पहले9वर्णित है, जबकि खाली वेक्टर नियंत्रण (RB143) हमारे नियंत्रण के समान दिखाई दिया- प्रेरक की अनुपस्थिति में उगाई जाने वाली कोशिकाएं।

हमारे समूह ने यह भी बताया कि एस ऑरियस जीपीएसबी (एसए-जीपीएसबी) का अधिक उत्पादन बी सबटिलिस9में सेल डिवीजन को बाधित करता है । हम इस अतिअभिव्यक्ति फेनोटाइप का उपयोग यहां वर्णित प्रोटोकॉल को प्रदर्शित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में करते हैं। इस उद्देश्य के लिए, एक बी सबटिलिस तनाव GG9(amyE::Pहाइपरस्पैंक-gpsBएसएएसपीसी; ftsAZ:: ftsAZ-gfpΩerm)9इस्तेमाल किया गया था । फ्लोरोसेंटी-लेबल वाले एफटीएसजेड का उपसेलुलर स्थानीयकरण, एक प्रमुख सेल डिवीजन प्रोटीन जो सेल डिवीजन साइटों10,11को चिह्नित करता है, का उपयोग सेल डिवीजन की स्थिति की निगरानी के लिए किया गया था। माइक्रोस्कोपी के लिए सैंपल इस प्रकार तैयार किया गया। जीजी9 की एक एकल कॉलोनी को 2 मिलीएल लुरिया-बर्टानी (एलबी) मीडियम में टीका लगाया गया और इनक्यूबेटर शेकर में 22 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेटेड किया गया । रातोंरात संस्कृतियों ताजा पौंड के 10 mL में 1:20 थे, और मध्य logarithmic चरण (OD600 = 0.5) तक मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर उगाया. जीजी9 कोशिकाओं (5 μL aliquot) इमेज्ड होने के लिए एक ग्लास बॉटम कल्चर डिश के तल पर रखा गया था और एलबी के साथ बने 1% अगारोज पैड के साथ कवर किया गया था जो isopropyl-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) के साथ पूरक है ताकि एसए-जीपीएसबी (चित्रा 2 और वीडियो 2)की अभिव्यक्ति को प्रेरित किया जा सके । प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित टाइमलैप्स माइक्रोस्कोपी और सेल लेंथ क्वांटिफिकेशन किया गया था।

एफटीएसजेड का अवरोध
FtsZ, सेल डिवीजन के लिए आवश्यक प्रोटीन होने के नाते, एक आकर्षक दवा लक्ष्य माना जाता है और कई समूहों के एक तरह से नए एंटीबायोटिक दवाओं12विकसित करने के रूप में FtsZ अवरोधकविकसित कर रहे हैं । FtsZ के स्थानीयकरण पैटर्न या इसके साथ जुड़े प्रोटीन में से एक, जैसे ZapA, एक रिपोर्टर के रूप में अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और/ हम यहां प्रदान किए गए प्रोटोकॉल का उपयोग एस ऑरियस RB197 [SH1000 शरण pRB42(पीसीडी-जैपासा-gfp bla erm)]9 और बी सबटिलिस PE92(ftsAZ::ftsAZ-gfpΩerm)13 उपभेदों का उपयोग कर इस दृष्टिकोण को प्रदर्शित करने के लिए । RB197 और PE92 उपभेदों के रूप में TSB में ऊपर वर्णित किया गया (5 μg/mL erythromycin युक्त; और १.२५ μM CdCl2 क्रमशः zapa-gfpकी अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए) और पौंड । मध्य logarithmic चरण में, एक अच्छी तरह से विशेषता FtsZ अवरोधक, PC19072314,15,2 μg/mL अंतिम एकाग्रता पर जोड़ा गया था और एस ऑरियस और बी सबटिलिस कोशिकाओं पर इसके प्रभाव अलग समय अंतराल पर माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर निगरानी की गई(चित्रा 3 और चित्रा 4)एस ऑरियस के सेल व्यास और बी सबटिलिस की सेल लंबाई का परिमाणीकरण प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: बीमार फेनोटाइप प्रदर्शित एस ऑरियस कोशिकाओं के उच्च संकल्प माइक्रोग्राफ।  एस ऑरियस के फ्लोरेसेंस माइक्रोग्राफ या तो खाली वेक्टर (बाएं) को पनाह देते हैं; RB143) या gpsBएसए के एंटीसेंस आरएनए की एक प्रेरक प्रति (दाएं; जीजीएस8) उपस्थिति और 1% जाइलोज (प्रेरक) की अनुपस्थिति में। कोशिकाओं को FM4-64 झिल्ली दाग (बाँझ पानी में भंग स्टॉक) और TRITC फिल्टर सेट का उपयोग कर छवि के साथ दाग थे । स्केल बार: 1 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: बी सबटिलिसमें सेल डिवीजन अवरोध दिखा प्रतिनिधि डेटा । (A)डीआईसी/जीईसी चैनलों का उपयोग करके 120 मिन के लिए 20-मीन अंतराल पर प्राप्त छवियों के साथ बी सबटिलिस स्ट्रेन जीजी9 के टाइमलैप्स माइक्रोग्राफ। एफटीएसजेड-जीएफपी (ग्रीन) के फ्लोरेसेंस डेटा दिखाए गए हैं। तीर पूरे प्रयोग में एक कोशिका का पालन करते हैं। स्केल बार: 1 μm.(B)सभी समय बिंदुओं पर सेल लंबाई का परिमाणीकरण। मानक विचलन (एन = 50) का संकेत त्रुटि सलाखों के साथ औसत सेल लंबाई दिखाई जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एस ऑरियसमें सेल डिवीजन अवरोध की टाइम कोर्स जांच । (क)तनाव RB197 अनुपचारित (ऊपर) या इलाज (नीचे) FtsZ अवरोधक (PC190723) के साथ इलाज (नीचे) के मध्य logarithmic चरण कोशिकाओं, 30 मिन वृद्धि के बाद, बढ़ती संस्कृतियों के aliquots ९० मिन के लिए हर 10 min लिया गया और डीआईसी और FITC फिल्टर सेट का उपयोग कर छवि । जैपा-जीएफपी से फ्लोरेसेंस दिखाया गया है। स्केल बार: 1 μm.(B)माइक्रोस्कोपी डेटा का क्वांटिफिकेशन। त्रुटि सलाखों के साथ औसत सेल चौड़ाई मानक विचलन (एन = 50) और उचित जैपा-जीएफपी स्थानीयकरण (मध्य-सेल और परिधि) प्रदर्शित करने वाली कोशिकाओं (एन = 50) का प्रतिशत दिखाया गया है। अवरोधक के साथ इलाज कोशिकाओं के डेटा अंक लाल रंग में दिखाए जाते हैं। हरी रूपरेखा के साथ आकार सही वाई-एक्सिस से मेल खाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: बी सबटिलिसमें एक सिंथेटिक अवरोधक द्वारा सेल डिवीजन अवरोध की जांच ।  बी सबटिलिस तनाव PE92 या तो अनुपचारित या मध्य logarithmic चरण में एक FtsZ अवरोधक (PC190723) के साथ इलाज किया गया था और बाद में ९० min के लिए निगरानी की गई । बढ़ती संस्कृतियों के Aliquots माइक्रोस्कोपी के लिए हर 10 मिन लिया गया और छवियों को डीआईसी/FITC चैनलों का उपयोग कर प्राप्त किए गए । एफटीएसजेड-जीएफपी से फ्लोरेसेंस दिखाया गया है। स्केल बार: 1 μm.(B)माइक्रोस्कोपी डेटा का क्वांटिफिकेशन। त्रुटि सलाखों के साथ औसत सेल लंबाई मानक विचलन (एन = 50) और उचित मध्य-सेल एफटीएसजेड-जीएफपी स्थानीयकरण प्रदर्शित करने वाली कोशिकाओं (एन = 50) का प्रतिशत दिखाया गया है। अवरोधक के साथ इलाज कोशिकाओं के डेटा अंक लाल रंग में दिखाए जाते हैं। हरी रूपरेखा के साथ आकार सही वाई-एक्सिस से मेल खाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 1: बीमार फेनोटाइप विकसित करने वाले एस ऑरियस कोशिकाओं की टाइमलैप्स माइक्रोस्कोपी। तनाव GGS8(gpsB एंटीसेंस) 1% जाइलोज के साथ इलाज किया। कोशिकाओं को FM4-64 झिल्ली दाग के साथ दाग दिया गया था और प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में TRITC चैनल का उपयोग कर ६० मिन के लिए 10 मिन अंतराल पर छवि । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 2: एसए-जीपीएसबी की अतिअभिव्यक्ति बी सबटिलिसमें सेल डिवीजन के अवरोध की ओर ले जाती है। जीजी9 में एफटीएसजेड-जीएफपी स्थानीयकरण में तंतंऔर परिवर्तन दिखा टाइमलैप्स वीडियो। डीआईसी और फिटसी चैनलों का उपयोग करके 120 मिन के लिए 20 मिन अंतराल पर छवियां ली गई थीं। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रजातियां तनाव जीनोटाइप संदर्भ
एस ऑरियस आरबी143 SH1000 pEPSA5, बला, बिल्ली एश्वर एट अल, 2018
एस ऑरियस जीजीएस8 SH1000 pGG59 (pEPSA5 रीढ़) पीजाइल-gpsBएंटीसेंस,बला, बिल्ली एश्वर एट अल, 2018
एस ऑरियस आरबी197 SH1000 pRB42 (pJB67रीढ़) पी सीडी-जैपा एसए-gfp, बला, बिल्ली एश्वर एट अल, 2018
B. सबटिलिस जीजी9 amyE: :Pहाइपरस्पैनक-gpsBएसए spc; ftsAZΩftsAZ-gfp erm एश्वर एट अल, 2018
B. सबटिलिस पीई92 ftsAZ::ftsAZ-gfpΩerm ब्राज़ोजोवस्की एट अल, 2019

तालिका 1: उपयोग किए जाने वाले उपभेद।

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Discussion

माइक्रोबायोमाइक्रोयल जीवों से संबंधित अध्ययनों में एक मुख्य आधार बना हुआ है। उनके माइक्रोन-स्केल सेल आकार को देखते हुए, एकल सेल स्तर के अध्ययनों ने पारंपरिक रूप से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) पर भरोसा किया है। हालांकि EM हाल के वर्षों में काफी शक्तिशाली तकनीक बन गया है, यह सीमित उपयोगकर्ता का उपयोग16के अलावा अपनी आंतरिक सीमाएं हैं । फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी तकनीकों में सुधार और एफडीएए3जैसे विभिन्न फ्लोरोसेंट जांच के विकास ने लाइव कोशिकाओं में विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए उपकरणों की एक विशाल सरणी के साथ माइक्रोबियल सेल जीव विज्ञानियों को प्रदान किया है। शोधकर्ता भी सक्रिय रूप से परिवर्तनों की निगरानी के लिए फ्लोरोसेंट उपकरण ों का निर्माण कर रहे हैं, उदाहरण के लिए अन्य लोगों के बीच सी-डी-जीएमपी जैसे संकेत अणुओं के स्तर में, जीवित कोशिकाओं में17,18। इसके अलावा, उच्च संकल्प टाइमलैप्स फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी जांचकर्ताओं को परिवर्तनों की निगरानी करने और प्रासंगिक फेनोटाइप का अध्ययन करने की अनुमति देता है।

हमने उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ माइक्रोस्कोपी प्रयोगों का संचालन करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किए हैं। हालांकि, उपयोगकर्ता और इस्तेमाल किए गए माइक्रोस्कोप की जरूरतों को फिट करने के लिए प्रोटोकॉल में कदमों को बदला जा सकता है। हम एस ऑरियस और बी सबटिलिस का उपयोग हमारे मॉडल जीवों के रूप में करते हैं ताकि यह दिखाया जा सके कि विभिन्न सेल डिवीजन फेनोटाइप की निगरानी कैसे की जाए, प्रोटीन स्थानीयकरण में परिवर्तन को ट्रैक किया जा सके, और डेटा की मात्रा निर्धारित की जा सके। इसके अलावा, उन मामलों के लिए जहां टाइमलैप्स अनुकूल नहीं है, हम एक फीटजेड अवरोधक की मदद से दिखाते हैं, एक समय पाठ्यक्रम प्रयोग कैसे स्थापित करें।

फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ अंतर्निहित सीमा विवर्तन सीमा द्वारा निर्धारित संकल्प है, जिसे उन्नत सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी तकनीक19,20की सहायता से कुछ हद तक दूर किया जा सकता है। फोटोटॉक्सिकिटी और फोटोब्लीचिंग जैसे अन्य मुद्दों को कम जेड-स्टैक इकट्ठा करके या लेजर के संपर्क की अवधि और/या आवृत्ति को कम करके दरकिनार किया जा सकता है । लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी के लिए विशिष्ट अन्य मार्गदर्शन सामग्री21उपलब्ध हैं । ग्राम-सकारात्मक जीवों बी सबटिलिस और एस ऑरियसके अलावा, इस सेट अप का उपयोग करके, हमने ग्राम-नकारात्मक जीवाणु एस्चेरिचिया कोलाई,खमीर सैचारोमाइसेस सेरेविसियाऔर नेमाटोड कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस को सफलतापूर्वक चित्रित किया है।

यहां वर्णित प्रयोगों के अलावा, इसी तरह के तरीकों का उपयोग उन यौगिकों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो उच्च-थ्रूपुट फैशन में विशिष्ट सेलुलर प्रक्रियाओं को लक्षित करते हैं। क्वांटिफिकेशन प्रक्रिया को स्वचालित करने वाले एल्गोरिदम को बड़े डेटासेट22,23के लिए भी शामिल किया जा सकता है । एंटीबायोटिक प्रतिरोध संकट को दूर करने के लिए विभिन्न जीवाणु प्रजातियों का अध्ययन करने की अपार आवश्यकता है और बुनियादी जैविक प्रक्रियाओं के तंत्र को समझने और उपन्यास चिकित्सीय यौगिकों की पहचान करने के लिए अधिक अध्ययन की आवश्यकता है । विभिन्न फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी तकनीकों ने अन्य लोगों के बीच इन चुनौतियों से निपटने में शोधकर्ताओं की सहायता करने के लिए शक्ति और गति प्राप्त की है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस लेख पर उनकी टिप्पणी के लिए हमारे प्रयोगशाला सदस्यों का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को यूनिवर्सिटी ऑफ साउथ फ्लोरिडा (पीई) से स्टार्ट-अप ग्रांट से फंड दिया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Fisher BioReagents BP160-100 Molecular Biology Grade - Low EEO
DAPI Invitrogen D3571 Microscopy
FM4-64 Invitrogen T3166 Microscopy
Glass bottom dish MatTek P35G-1.5-14-C Microscopy
IPTG Fisher BioReagents BP1755-10 Dioxane-free
Microscope GE DeltaVision Elite Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber - opaque.
PC190723 MilliporeSigma 3445805MG FtsZ inhibitor
SoftWorx GE Manufacturer-supplied imaging software

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References

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