Родной Полякриламимид Гель Электрофорез Иммуноблот Анализ эндогенной димеризации IRF5

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Описан родной западный метод поблуждения для анализа эндогенного интерферона регулятивного фактора 5 димеризации в плазмоцитной дендритной линии CAL-1. Этот протокол может быть применен и к другим клеточным линиям.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Wang, M., Hoo Lim, K., Chow, K. T. Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analysis of Endogenous IRF5 Dimerization. J. Vis. Exp. (152), e60393, doi:10.3791/60393 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Интерферон регулятивного фактора 5 (IRF5) является ключевым фактором транскрипции для регулирования иммунного ответа. Он активируется вниз по течению Toll-как рецептор миелоидной дифференциации первичного источника ответа гена 88 (TLR-MyD88) сигнальный путь. Активация IRF5 включает в себя фосфорилирование, димеризацию и последующее перемещение из цитоплазмы в ядро, что, в свою очередь, индуцирует экспрессию генов различных провоспалительных цитокинов. Для изучения функций IRF5 и соответствующих путей необходимо провести ажиотаж обнаружения активации IRF5. В этой статье описывается надежный анализ для обнаружения эндогенной активации IRF5 в плазмоцитной дендритной клетке CAL-1 человека (pDC). Протокол состоит из модифицированного анализа электрофорезов nondenaturing, который может различать IRF5 в его мономерных и димерных формах, обеспечивая тем самым доступный и чувствительный подход к анализу активации IRF5.

Introduction

Интерферон регулятивного фактора 5 (IRF5) является важным регулятором транскрипции, который играет заметную роль в регулировании иммунного ответа, особенно в выпуске провоспалительных цитокинов и интерферонов типа I (IFNs)1,2 ,3. Неправильное регулирование IRF5 является фактором, способствующим многочисленным аутоиммунным заболеваниям, о чем свидетельствуют различные полиморфизмы в локусе IRF5, связанные с системной эритематозом волчанки, рассеянным склерозом, ревматоидным артритом и т.д.4, 5,6,7,8,9,10. Таким образом, надежный детектор обнаружения эндогенного состояния активации IRF5 имеет решающее значение для понимания регуляторных путей и ниже по течению эффектов IRF5 в физиологически актуальном клеточном контексте.

IRF5 является составным образом выражается в моноцитах, дендритных клетках (ДК), В-клетках и макрофагах1,11. Как и в других факторах транскрипции семьи IRF, IRF5 находится в цитоплазме в ее скрытом состоянии. После активации IRF5 фосфорилировался и образует гомодимеры, которые затем перемещаются в ядро и связываются с определенными регуляторными элементами генов, кодирующих тип I IFNs и провоспалительных цитокинов, что в конечном итоге приводит к экспрессии этих генов1 ,2,11,12,13. IRF5 регулирует врожденные иммунные реакции вниз по течению различных платных рецепторов (TLRs), таких как TLR7, TLR 8 и TLR 9, которые локализованы в эндосомомых и используют MyD88 для сигнализации1,11,14. Эти TLRs в первую очередь признают иностранные виды нуклеиновой кислоты, такие как одноцепочечная РНК (ssRNA) и неметилированные CPG ДНК, которые являются симптомами инфекции15,16,17,18. Было показано, что IRF5 регулирует иммунные реакции против бактериальных, вирусных и грибковых инфекций19,20,21. Учитывая влиятельную и разнообразную роль IRF5 в иммунной системе, повышение или увлажнение активности IRF5 может послужить новым средством для развития терапевтических агентов22. Поэтому крайне важно разработать протокол для мониторинга состояния активации эндогенного IRF5, с тем чтобы обеспечить тщательное исследование путей и механизмов, регулирующих активность IRF5 в различных типах клеток.

Насколько нам известно, до разработки этого протокола не было опубликовано ни одного биохимического или гелевого электрофоретического анализа для эндогенной активации IRF5. Фосфорилирование было показано, что важный первый шаг активации IRF5, и фосфоспецифические антитела IRF5 был разработан, что привело к открытию и подтверждению остатков serine важно для IRF5 деятельности13. Однако, в то время как антитела четко обнаруживает фосфорилированный IRF5, когда иммунопроцирование или overexpressed23, он не может обнаружить IRF5 фосфорилирования в целом лизат клеток в наших руках (данные не показаны). Димеризация является следующим шагом активации IRF5, и многие важные исследования на сегодняшний день расследование этого шага опирался на переэкспрессию эпитоп-тегами IRF5, часто в нерелевантных типов клеток, которые обычно не выражают IRF511,12 ,24,25. Предыдущие исследования показали, что димеризированный IRF5 не всегда может трансвесироваться в ядро и, следовательно, не обязательно полностью активирован25,26. Анализ эндогенной локализации ядерной энергии IRF5 был разработан для оценки активации IRF5 с помощью цитометрии потока изображений27. Этот ассеия была применена в исследованиях, которые имеют решающее значение для понимания активности IRF5, особенно в первичных или редких типах клеток28,29 и значительно продвинули знания в этой области. Однако этот асси опирается на специализированный инструмент, который не пользуется широкой доступностью для исследователей. Кроме того, часто необходимо исследовать начальные этапы активации при вскрытии регуляторных путей IRF5 и выявлении восходящих регуляторов и компонентов путей. Это исследование обеспечивает надежный и надежный биохимический анализ для ранних событий активации IRF5, которые могут быть выполнены в лабораториях, оснащенных молекулярной биологией инструментов. Описанный здесь протокол будет очень полезен при изучении путей и механизмов действий IRF5, особенно в сочетании с ортогональными ассиями, такими как цитометрический анализ циклометрического анализа ядерных локализации IRF523, 27,28,30.

Родной полиакриламид гель электрофорез (родной PAGE) является широко используемым методом для анализа белковых комплексов31,32. В отличие от натрия dodecylsulfate полиакриламид гель электрофоресис (SDS-PAGE), родной PAGE отделяет белки на основе их формы, размера и заряда. Он также сохраняет родную структуру белка без денатурации31,33,34,35. Представленный протокол использует эти особенности родного PAGE и обнаруживает как мономерные, так и димерические формы IRF5. Этот метод особенно важен для обнаружения ранних событий активации, поскольку нет подходящих коммерчески доступных антител, которые могут обнаружить эндогенные фосфорилированные IRF5. Ранее несколько опубликованных исследований использовали родной PAGE для оценки iRF5 димеризации. Тем не менее, большинство из этих исследований зависело от переэкспрессии экзогенных эпитопных меток IRF5 для анализа состояния активации2,13,24,36,37 . Эта работа представляет пошаговый протокол для анализа эндогенных IRF5 димеризации с помощью модифицированной родной техники PAGE в плазмоцитной дендритной клетки человека (pDC) линии, где IRF5 деятельности было показано, что решающее значение для его функции1, 38,39,40. Этот же метод был применен к другим клеточным линиям23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: В описанном здесь протоколе используется линия клеток CAL-1 pDC, обработанная resiquimod (R848), агонистом для TLR7/8. Этот протокол был применен к другим типам человеческих и муринных клеток, в ключая RAW 264.7 (линия макрофагов, THP-1 (линия моноцитарных клеток человека), BJAB (человеческая линия B клеток), Рамос (человеческая линия B- клеток) и MUT-3 (линия клеток человека dendritic)23.

1. Стимулирование клеток CAL-1

  1. Поддержание клеточных культур CAL-1 в колбе T75 при 37-C и 5% CO2 при стерильных условиях с 20-25 мл среды RPMI 1640, содержащей 5% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 25 мМ HEPES и 1x меркаптотетанол (т.е. полный RPMI 1640 средний).
  2. Перенесите клетки в коническую трубку 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки CAL-1 не являются придерживаться. Для типов клеток адептов, стандартная трипсизация может быть выполнена для сбора клеток.
  3. Центрифуги клетки на 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Удалить супернатант и resuspend клеточной гранулы в 8 мл полного RPMI 1640 среды для получения однородной одноклеточной подвески.
  4. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Семена клеток при плотности 1 х 106 клеток на хорошо в 6 хорошо пластины с 4 мл предварительно разогретой полной RPMI 1640 среды в каждом колодце. Инкубировать на 20-24 ч при 37 градусах Цельсия и 5% CO2, чтобы позволить блике достичь 90%-95% (что соответствует примерно 1,5 х 106 ячеек).
  5. Стимулировать клетки, добавляя 4 л 1 мг/мл R848 на скважину 6 хорошо пластины (окончательная концентрация 1 мкг/мл). Также установить нестимулированный контроль хорошо с клетками без лечения R848.
  6. Убедитесь, что R848 равномерно рассеивается, мягко раскачивая пластину из стороны в сторону. Затем инкубировать клетки в течение 2-16 ч в инкубаторе при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2.

2. Извлечение клеточных белков

  1. Перенесите клеточные суспензии из 6 скважинной пластины в центрифугные трубки 5 мл.
  2. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин на RT. Удалите супернатант и resuspend клеточной гранулы в 1 мл фосфат-буферного соления (PBS) для получения однородной одноклеточной подвески.
  3. Перенесите суспензию клетки в центрифугу мощностью 1,5 мл.
  4. Спин вниз кратко на 12000 х г в течение 0,5 х 1 мин при 4 градусах Цельсия и тщательно удалить супернатант.
  5. Подготовьте буфер лисиса, содержащий 6,25 мл 1 М Tris-HCl pH 7.4 (окончательная концентрация 25 мМ), 7,5 мл 5 М НКЛ (окончательная концентрация 150 мМ), 0,5 мл 0,5 М ЭДТА (окончательная концентрация 1 мМ), 2,5 мл NP-40 (окончательная концентрация 1%) и 7,5 мл глицерола (окончательная концентрация 5%) в 250 мл деионированной воды (ddH2O). Добавьте 100x ингибитор протеазы одноразовый коктейль к окончательной концентрации 1x в буфер лиза непосредственно перед использованием. Держите подготовленный буфер лисиса на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер лисиса без протеаза может храниться при 4 градусах Цельсия.
  6. Приостановите действие клеточных гранул в 30 зликатледяного буфера лиза и смешайте путем трубоукладки вверх и вниз.
  7. Инкубировать на льду в течение 15-20 мин.
  8. Уточните лизат путем центрифуга при 12000 х г в течение 15-20 мин при 4 градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую центрифугу длиной 1,5 мл. Храните экстракты на льду в любое время.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сотовые лисаты могут храниться при -20 градусах или -80 градусов по Цельсию. Не кипятите образцы.
  9. Измерьте концентрацию белка с помощью реагента Брэдфорда.

3. Анализ димеризации IRF5 по родным PAGE

  1. Подготовьте верхние (-) и нижние (я) камерные электрофорусные буферы. Буфер верхней камеры состоит из 0,3% дезоксихолата натрия (NaDOC) в 1x родном беговом буфере PAGE, а нижняя палата состоит только из 1x родного бегового буфера PAGE.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте свежий буфер верхней камеры для каждого нового запуска.
  2. Промыть 3%-12% родной ГЕЛЬ PAGE тщательно с водой, не искажая скважины. Установите гель в мини-гель танк и удалить гребень. Prerun гель в холодной комнате 4 градуса цельсия или на льду при 150 В в течение 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Prerunning удаляет чрезмерное аммиака и ионов persulfate, которые могут помешать запуску геля.
  3. Во время prerun, подготовить образцы для загрузки путем смешивания клеточных белков, хранящихся на льду с 4x родной образец буфера.
  4. После предварительного запуска нагрузите 10–15 мкг белка с окончательным объемом 10–15 л на образец.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перегрузка белка может привести к размазывания.
  5. Выполнить гель на 85 V в течение 30 мин, затем 150 V в течение 2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая различия в оборудовании и клеточных линиях, используемых в различных лабораториях, незначительные изменения в концентрации образцов белка, напряжения и времени работы могут быть целесообразными для оптимизации этого протокола. Снижение предварительного запуска и бегового напряжения при увеличении времени работы может помочь улучшить разрешение димера и привести к согласованности.
  6. Замочите гель в SDS работает буфер (25 мм Tris pH 8,3, 250 мм Глицин, 0,1% SDS) в течение 30 минут на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Агитация не требуется. Иногда интенсивность полосы не может быть пропорциональна количеству белка, загруженного из-за неэффективной передачи в присутствии дезоксихолата (DOC), который в основном влияет на мономерную форму IRF5. Замачивание геля в SDS работает буфер до передачи решает эту проблему. Гель хрупкий. Ручка с крайней осторожностью снизу (т.е. более высокий процент) конец геля.

4. Иммуноблот Анализ IRF5

  1. Активируйте мембрану дифлуорид поливилиден (PDVF), замачивая ее в метаноле в течение примерно 5 мин.
  2. Сделайте разрез на одном углу мембраны, чтобы указать его ориентацию. Соберите сэндвич с передачей в соответствии с последовательным порядком, описанным в протоколе производителя, с дополнительной осторожностью, чтобы гарантировать, что пузырьки воздуха не оказались в ловушке внутри.
  3. Поместите кассету передачи в бак и перенесите при 20 В на 1 ч на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все инкубации и стирки в последующих шагах с качания шейкер.
  4. Удалить мембрану из кассеты с помощью пластиковых щипцы после передачи завершена. Блокируйте мембрану в блокирующем буфере (TBS) в течение 45 минут на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер TBS с 5% BSA также может быть использован в качестве блокирующего буфера.
  5. Инкубировать мембрану с первичным антителом, перечисленным в таблице 1. Вымойте мембрану с 1x TBST стиральный буфер (20 мм Tris, рН 7.0, 150 mM NaCl и 0,1% Tween 20) в течение 3 мин во время качания. Повторите мыть 2x.
Диллутия Буфер диллитии Инкубации Комментарии
Первичные антитела (Anti-IRF5) 1/1,000 Блокирующий буфер TBS Ночевка при 4 c или 2 h на RT Разбавленные антитела можно повторно использовать несколько раз при хранении при 4 градусах Цельсия при наличии 0,02% азида натрия.
Вторичные антитела (Анти-кролик) 1/10,000 Блокирующий буфер TBS 45 мин на RT Разбавленные антитела можно повторно использовать несколько раз при хранении при 4 градусах Цельсия при наличии 0,02% азида натрия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавление необходимо оптимизировать, так как оно варьируется между производителями.

Таблица 1: Спецификации антител, используемых в иммуноблоттинге.

  1. Инкубировать мембрану вторичными антителами, перечисленными в таблице 1. Вымойте мембраны в течение 3 мин в 1x TBST стирального буфера. Повторите мыть 2x.
  2. Сканирование подьение с помощью соответствующей системы документации геля.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Иммуноблот (IB) с антителами против IRF5 был выполнен на клетках CAL-1 без стимуляции или стимулировали с 1 мкг/мл R848 для 2 ч(Рисунок 1). Были подготовлены клеточные лисаты, и был выполнен родной PAGE. В нестимулированных клетках CAL-1 IRF5 был обнаружен как единая полоса на родном PAGE, соответствующая его мономической форме. При лечении клеток CAL-1 с R848 на 2 ч уровень момера IRF5 снижался с одновременным увеличением накопления медленно мигрирующей полосы, что соответствовало димерической форме IRF5.

Figure 1
Рисунок 1: Эндогенные IRF5 димеризованы в клетках CAL-1 при стимуляции с агонистом TLR7/8. Клетки CAL-1 не лечились или лечились R848 в указанное время. Образцы белков были решены родным PAGE и затем IB с помощью анти-IRF5 антитела. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Иммуноблот с антителами IRF5 был выполнен на IRF5-overexpressing 293T-клеток untransfected и трансфицируется с различными конструкциями. Сотовые лисаты были подготовлены и родной PAGE была выполнена(Рисунок 2). IRF5 не было обнаружено в нетрансинфицированных 293T-клетках, демонстрирующих специфику антитела IRF5. Одна полоса, соответствующая мономерному IRF5, была обнаружена только в 293T-клетках, перевыражающих IRF5. При построении кодирования IRF5-активирующих белков, включая NRIG (в обязательно мейлирующее RIG-I), MAVS и IKK, были котрансфицированы, появилась медленно мигрирующая полоса, соответствующая димерической форме IRF5. Тем не менее, NMDA5 (в обязательном порядке активный MDA5), связанный с RIG-I, не вызывал димеризации IRF5 при котрансезации.

Figure 2
Рисунок 2: Котрансфекция iRF5-активизирующие факторы индуцированные IRF5 димеризации в 293T клеток. 293T-клетки были нетрансфицировали (полоса 1) или трансфицировали с Помощью IRF5 (полоса 2) вместе с различными регуляторами IRF5 (полосы 3'6). Образцы белков были решены родным PAGE и затем IB с помощью анти-IRF5 антитела. NRIG - N-терминал RIG-I; NMDA5 - N-терминал MDA5. (Первоначально опубликовано в журнале иммунологии. KT Чоу, C Уилкинс, M Нарита, R Грин, M Нолл, YM Loo и M Гейл младший 2018. Дифференциальные и перекрывающиеся иммунные программы, регулируемые IRF3 и IRF5 в плазмоцитоидных дендритных клетках. J. Иммунол. 201 (10) 3036-3050. Авторское право © 2018 Американская ассоциация иммунологов, Inc23). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Описанный здесь протокол представляет собой модифицированный родной PAGE, который отличает как мономерные, так и димерические формы эндогенных IRF5. Там было несколько исследований, сообщающих об обнаружении эндогенной активации IRF5 с использованием специализированных методов цитометрии потока изображений23,27,28,30. Этот протокол использует общий метод и обычные реагенты и инструменты для оценки эндогенного состояния активации IRF5 во время ранних событий активации. Протокол предполагает простые изменения в стандартный родной протокол PAGE, позволяющий проводить различие между мономерными и димерическими формами IRF5. Он может быть легко адаптирован к исследованиям с использованием других клеточныхлиний 23. Этот модифицированный родной протокол PAGE может решить эндогенные IRF5 в двух формах четко без неспецифических белковых помех(рисунок 2). Эндогенный IRF5 из нестимулированных клеток был обнаружен как четкая единая полоса в этой гель-системе, в то время как лечение R848 для 2 ч привело к появлению полосы, соответствующей димерам IRF5(рисунок 1).

Родной PAGE димеризации асссы для IRF3, аналогичный фактор транскрипции IRF5 в той же семье, был разработан и широко используется в последние два десятилетия32. Несмотря на обширные испытания и устранение неполадок, мы не смогли применить тот же протокол, в котором используется система Laemmli Tris-glycine для решения проблемiii iRF5 monomer и dimer. Протокол, описанный в этой статье, использует гели градиента Bis-Tris, которые имеют очень различную химию к гелям Tris-glycine один процент используемых в протоколе IRF3. Различные рН и химический состав электрофоретических систем геля могут иметь решающее значение для различения различных форм IRF3 и IRF5. Действительно, IRF3 и IRF5, хотя и похожи, имеют различные свойства (например, изоэлектрические точки и места модификации), вероятно, приводят к различному поведению при разделении на различных гелевых системах.

1x родной PAGE работает буфер, содержащий DOC был использован для геля перспективе. Буфер должен быть подготовлен свежим или храниться в чистой и без белковой среде, чтобы избежать появления белых осадков, омрачающих раствор в верхней камере в результате doc осаждая неспецифические белки. Настоятельно рекомендуется, чтобы извлеченные эндогенные образцы IRF5 были подвергнуты родной PAGE КАК можно скорее, предпочтительно в течение недели с минимальными циклами замораживания оттепели. В противном случае может быть значительная деградация белка. Деградация наблюдается при хранении как при -80, так и в -20 градусов. Кроме того, pH буфера SDS и буфера стирки TBST должны быть скорректированы на RT.

Идеальный окончательный объем образца, загруженного в каждую скважину, составлял 10–15 л, но в зависимости от различных типов клеток могут потребоваться небольшие корректировки. После первоначального запуска на 85 V в течение 30 минут, рекомендуется продолжать работать гель на 150 V в течение примерно 2 до 3 ч для достижения четкого разделения и разрешения IRF5 мономер и димер. После завершения запуска, крайне важно обрабатывать гель тщательно из его нижней части из-за его дифференциальных уровней плотности, начиная от 3% в верхней части и увеличение до 12% в нижней части. В этом случае предпочтительнее удалить гель из пластины, погрузив его в использованный бегущий буфер, который действует как ударная подушка, чтобы свести к минимуму трение и позволяет гелю уплыть от пластины, чтобы избежать поломки.

Некоторые незначительные недостатки этого протокола включают ограниченный выбор гелей, доступных для достижения желаемых результатов. Домашние гели и несколько других марок коммерчески доступных гелей были протестированы безуспеха. В наших руках использование коммерческого бегущего буфера и гелевой системы способствовало надежности и воспроизводимости этого протокола, хотя масштабное тестирование самодельных буферов не проводилось. Внимание к деталям имеет важное значение, и опыт является ключом к успеху в получении четких результатов. Наконец, для того, чтобы получить идеальное разделение мономера и димера, потребовалось долгое время (т.е. 2,3 ч). Дальнейшее совершенствование и внесение изменений в будущем может повысить эффективность и свести к минимуму недостатки этого протокола.

В заключение, этот протокол является надежным ассеаром для обнаружения эндогенных iRF5 мономер и димер. Он подходит для применения в различных типах человеческих и муринных клеток, выражающих эндогенные IRF5. Это будет ценным инструментом для изучения регулятивных путей IRF5 и сигнальных компонентов в различных типах клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Работа была поддержана финансированием из Фонда Краучера и стартап-фондов Городского университета. Мы благодарим всех сотрудников лаборатории Чоу за помощь в эксперименте и критическое чтение рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Life Technologies, HK 21985023
300 W/250 V power supply 230 V AC Life Technologies, HK PS0301
Anti-IRF5 antibody Bethyl Laboratories, USA A303-385
BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) EcoLife, HK MR-12
EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4x 100 mL Life Technologies 15575020
Glycerol 500 mL Life Technologies 15514011
Glycine Life Technologies, HK 15527013
Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody LAB-A-PORTER/Rockland, HK 610-145-002-0.5
Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody LAB-A-PORTER/Rockland, HK 611-145-002-0.5
Halt protease inhibitor cocktail (100x) Thermo Fisher Scientific, HK 78430
HEPES Life Technologies, HK 15630080
LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) Gene Company, HK 927-50000
Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories Life Technologies, HK NW2000
NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit Life Technologies, HK BN1001BOX
NativePAGE Running Buffer 20x Life Technologies, HK BN2001
NativePAGE Sample Buffer 4x Life Technologies, HK BN2003
NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol Tin Hang/Calbiochem, HK #492016-100ML
PBS 7.4 Life Technologies, HK 10010023
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Bio-gene/Merck Millipore, HK IPFL00010
Protein assay kit II (BSA) Bio-Rad, HK 5000002
R848 Invivogen, HK tlrl-r848
RPMI 1640 Life Technologies, HK 61870127
Sodium Chloride ThermoFisher BP358-1
Sodium deoxycholate ≥97% (titration) Tin Hang/Sigma, HK D6750-100G
Tris Life Technologies, HK 15504020
TWEEN 20 Tin Hang/Sigma, HK #P9416-100ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takaoka, A., et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 434, (7030), 243-249 (2005).
  2. Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. IKKbeta is an IRF5 kinase that instigates inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (49), 17438-17443 (2014).
  3. Negishi, H., Taniguchi, T., Yanai, H. The Interferon (IFN) Class of Cytokines and the IFN Regulatory Factor (IRF) Transcription Factor Family. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 10, (11), (2018).
  4. Clark, D. N., et al. Four Promoters of IRF5 Respond Distinctly to Stimuli and are Affected by Autoimmune-Risk Polymorphisms. Frontiers in Immunology. 4, 360 (2013).
  5. Bo, M., et al. Rheumatoid arthritis patient antibodies highly recognize IL-2 in the immune response pathway involving IRF5 and EBV antigens. Scientific Reports. 8, (1), 1789 (2018).
  6. Duffau, P., et al. Promotion of Inflammatory Arthritis by Interferon Regulatory Factor 5 in a Mouse Model. Arthritis and Rheumatolpgy. 67, (12), 3146-3157 (2015).
  7. Feng, D., et al. Irf5-deficient mice are protected from pristane-induced lupus via increased Th2 cytokines and altered IgG class switching. European Journal of Immunology. 42, (6), 1477-1487 (2012).
  8. Richez, C., et al. IFN regulatory factor 5 is required for disease development in the FcgammaRIIB-/-Yaa and FcgammaRIIB-/- mouse models of systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 184, (2), 796-806 (2010).
  9. Tada, Y., et al. Interferon regulatory factor 5 is critical for the development of lupus in MRL/lpr mice. Arthritis and Rheumatology. 63, (3), 738-748 (2011).
  10. Weiss, M., et al. IRF5 controls both acute and chronic inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (35), 11001-11006 (2015).
  11. Schoenemeyer, A., et al. The interferon regulatory factor, IRF5, is a central mediator of toll-like receptor 7 signaling. Journal of Biological Chemistry. 280, (17), 17005-17012 (2005).
  12. Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. Functional regulation of MyD88-activated interferon regulatory factor 5 by K63-linked polyubiquitination. Molecular and Cellular Biology. 28, (24), 7296-7308 (2008).
  13. Lopez-Pelaez, M., et al. Protein kinase IKKβ-catalyzed phosphorylation of IRF5 at Ser462 induces its dimerization and nuclear translocation in myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (49), 17432-17437 (2014).
  14. McGettrick, A. F., O'Neill, L. A. Localisation and trafficking of Toll-like receptors: an important mode of regulation. Current Opinion Immunology. 22, (1), 20-27 (2010).
  15. Baccala, R., Hoebe, K., Kono, D. H., Beutler, B., Theofilopoulos, A. N. TLR-dependent and TLR-independent pathways of type I interferon induction in systemic autoimmunity. Nature Medicine. 13, (5), 543-551 (2007).
  16. Gilliet, M., Cao, W., Liu, Y. J. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases. Nature Reviews Immunology. 8, (8), 594-606 (2008).
  17. Kawai, T., Akira, S. Toll-like Receptors and Their Crosstalk with Other Innate Receptors in Infection and Immunity. Immunity. 34, (5), 637-650 (2011).
  18. Liu, Z., Davidson, A. Taming lupus-a new understanding of pathogenesis is leading to clinical advances. Nature Medicine. 18, (6), 871-882 (2012).
  19. del Fresno, C., et al. Interferon-beta production via Dectin-1-Syk-IRF5 signaling in dendritic cells is crucial for immunity to C. albicans. Immunity. 38, (6), 1176-1186 (2013).
  20. Wang, X., et al. Expression Levels of Interferon Regulatory Factor 5 (IRF5) and Related Inflammatory Cytokines Associated with Severity, Prognosis, and Causative Pathogen in Patients with Community-Acquired Pneumonia. Medical Science Monitor. 24, 3620-3630 (2018).
  21. Zhao, Y., et al. Microbial recognition by GEF-H1 controls IKKepsilon mediated activation of IRF5. Nature Communications. 10, (1), 1349 (2019).
  22. Almuttaqi, H., Udalova, I. A. Advances and challenges in targeting IRF5, a key regulator of inflammation. FEBS Journal. 286, (9), 1624-1637 (2019).
  23. Chow, K. T., et al. Differential and Overlapping Immune Programs Regulated by IRF3 and IRF5 in Plasmacytoid Dendritic Cells. The Journal of Immunology. 201, (10), 3036-3050 (2018).
  24. Cheng, T. F., et al. Differential Activation of IFN Regulatory Factor (IRF)-3 and IRF-5 Transcription Factors during Viral Infection. The Journal of Immunology. 176, (12), 7462-7470 (2006).
  25. Chang Foreman, H. C., Van Scoy, S., Cheng, T. F., Reich, N. C. Activation of interferon regulatory factor 5 by site specific phosphorylation. PLoS One. 7, (3), 33098 (2012).
  26. Lin, R., Yang, L., Arguello, M., Penafuerte, C., Hiscott, J. A CRM1-dependent nuclear export pathway is involved in the regulation of IRF-5 subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 280, (4), 3088-3095 (2005).
  27. Stone, R. C., et al. Interferon regulatory factor 5 activation in monocytes of systemic lupus erythematosus patients is triggered by circulating autoantigens independent of type I interferons. Arthritis and Rheumatology. 64, (3), 788-798 (2012).
  28. De, S., et al. B Cell-Intrinsic Role for IRF5 in TLR9/BCR-Induced Human B Cell Activation, Proliferation, and Plasmablast Differentiation. Frontiers in Immunology. 8, 1938 (2017).
  29. Fabie, A., et al. IRF-5 Promotes Cell Death in CD4 T Cells during Chronic Infection. Cell Reports. 24, (5), 1163-1175 (2018).
  30. Cushing, L., et al. IRAK4 kinase activity controls Toll-like receptor-induced inflammation through the transcription factor IRF5 in primary human monocytes. Journal of Biological Chemistry. 292, (45), 18689-18698 (2017).
  31. Li, C., Arakawa, T. Application of native polyacrylamide gel electrophoresis for protein analysis: Bovine serum albumin as a model protein. International Journal of Biological Macromolecules. 125, 566-571 (2019).
  32. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells. 6, (4), 375-388 (2001).
  33. Subhadarshanee, B., Mohanty, A., Jagdev, M. K., Vasudevan, D., Behera, R. K. Surface charge dependent separation of modified and hybrid ferritin in native PAGE: Impact of lysine 104. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1865, (10), 1267-1273 (2017).
  34. Reynolds, J. A., Tanford, C. Binding of Dodecyl Sulfate to Proteins at High Binding Ratios - Possible Implications for State of Proteins in Biological Membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66, (3), 1002 (1970).
  35. Manning, M., Colon, W. Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure. Biochemistry. 43, (35), 11248-11254 (2004).
  36. Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. IKKalpha negatively regulates IRF-5 function in a MyD88-TRAF6 pathway. Cellular Signalling. 22, (1), 117-127 (2010).
  37. Paun, A., et al. Functional characterization of murine interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and its role in the innate antiviral response. Journal of Biological Chemistry. 283, (21), 14295-14308 (2008).
  38. Yasuda, K., et al. Murine dendritic cell type I IFN production induced by human IgG-RNA immune complexes is IFN regulatory factor (IRF)5 and IRF7 dependent and is required for IL-6 production. The Journal of Immunology. 178, (11), 6876-6885 (2007).
  39. Steinhagen, F., et al. IRF-5 and NF-kappaB p50 co-regulate IFN-beta and IL-6 expression in TLR9-stimulated human plasmacytoid dendritic cells. European Journal of Immunology. 43, (7), 1896-1906 (2013).
  40. Gratz, N., et al. Type I interferon production induced by Streptococcus pyogenes-derived nucleic acids is required for host protection. PLoS Pathogens. 7, (5), 1001345 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics