Inheemse polyacrylamidegel elektroforese immunoblot analyse van endogene IRF5 Dimerization

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Een native Western Blot-methode voor het analyseren van endogene interferon regulatoire factor 5 door dimerisatie in de CAL-1 plasmacytoïde dendritische cellijn wordt beschreven. Dit protocol kan ook worden toegepast op andere cellijnen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Wang, M., Hoo Lim, K., Chow, K. T. Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analysis of Endogenous IRF5 Dimerization. J. Vis. Exp. (152), e60393, doi:10.3791/60393 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Interferon regulerend factor 5 (IRF5) is een belangrijke transcriptiefactor voor het reguleren van de immuunrespons. Het is stroomafwaarts van de tol-achtige receptor myeloïde differentiatie primaire reactie Gene 88 (TLR-MyD88) signalering traject. IRF5 activering omvat fosforylering, dimerization, en daaropvolgende translocatie van het cytoplasma in de Nucleus, die op zijn beurt induceert de genexpressie van verschillende pro-inflammatoire cytokines. Een detectie test voor IRF5 activatie is essentieel voor het bestuderen van IRF5 functies en de bijbehorende trajecten. Dit artikel beschrijft een robuuste assay voor het detecteren van endogene IRF5 activering in de CAL-1 Human plasmacytoid dendritische Cell (pDC) regel. Het protocol bestaat uit een gemodificeerde nondenaturerende elektroforese test die IRF5 kan onderscheiden in zijn monomeer en dimeer vormen, waardoor een betaalbare en gevoelige aanpak wordt geboden om IRF5 activatie te analyseren.

Introduction

Interferon Regulatory factor 5 (IRF5) is een belangrijke transcriptie regulator die een prominente rol speelt bij het reguleren van de immuunrespons, met name bij de afgifte van pro-inflammatoire cytokinen en type I-interferonen (IFNs)1,2 ,3. Misregulatie van IRF5 is een bijdragende factor in talrijke auto-immuunziekten, zoals blijkt uit verschillende polymorfismen in de IRF5 Locus die geassocieerd zijn met systemische lupus erythematosus, multiple sclerose, reumatoïde artritis, etc.4, 5,6,7,8,9,10. Daarom is een robuuste detectie test voor endogene IRF5 activeringsstatus cruciaal voor het begrijpen van de regelgevings trajecten en downstream-effecten van IRF5 in een fysiologisch relevante cellulaire context.

IRF5 wordt constitutief uitgedrukt in monocyten, dendritische cellen (Dc's), B-cellen en macrofagen1,11. Net als bij andere IRF familie transcriptiefactoren, IRF5 verblijft in het cytoplasma in zijn latente toestand. Na activering, IRF5 is fosforyleerd en vormt homodimers, die vervolgens translocate in de Nucleus en binden aan specifieke regelgevende elementen van genen coderen type I IFNs en pro-inflammatoire cytokines, uiteindelijk induceren van de uitdrukking van deze genen1 ,2,11,12,13. IRF5 regelt de aangeboren immuunresponsen stroomafwaarts van verschillende tolachtige receptoren (tlrs), zoals TLR7, TLR 8, en TLR 9, die zijn gelokaliseerd in endosomes en gebruik MyD88 voor signalering1,11,14. Deze tlr's herkennen voornamelijk vreemde nucleïnezuur soorten zoals enkelvoudig-streng RNA (ssrna) en niet-gemethyleerd CPG-DNA dat symptomatisch is voor een infectie15,16,17,18. IRF5 is aangetoond dat het reguleren van immuunresponsen tegen bacteriële, virale, en schimmelinfecties19,20,21. Gezien IRF5's invloedrijke en diverse rol in het immuunsysteem, verbetering of demping IRF5 activiteit kan dienen als een roman Avenue voor de ontwikkeling van therapeutische agenten22. Daarom is het van cruciaal belang om een protocol te ontwikkelen om de activeringsstatus van endogene IRF5 te bewaken, om grondig onderzoek te kunnen doen naar de trajecten en mechanismen die IRF5 activiteit in verschillende celtypen reguleren.

Naar beste weten is er geen biochemische of gel-elektrofortische test voor endogene IRF5-activering gepubliceerd voorafgaand aan de ontwikkeling van dit protocol. Fosforylering is aangetoond als een belangrijke eerste stap van IRF5 activatie, en een fosfospecifieke IRF5 antilichaam werd ontwikkeld dat leidde tot de ontdekking en bevestiging van een serine residu belangrijk voor IRF5 activiteit13. Terwijl het antilichaam echter duidelijk fosforyleerd IRF5 detecteert bij immunoprecipitated of overexpressie23, het niet detecteert IRF5 fosforylering in een hele cel lysaat in onze handen (gegevens niet weergegeven). Dimerization is de volgende stap van IRF5 activatie, en vele belangrijke studies tot nu toe het onderzoeken van deze stap was gebaseerd op overexpressie van epitope-Tagged IRF5, vaak in irrelevante celtypen die normaalgesproken niet uitdrukken IRF511,12 ,24,25. Eerdere studies hebben aangetoond dat dimerized IRF5 niet altijd kan translokaliseren in de Nucleus en dus niet noodzakelijkerwijs volledig geactiveerd25,26. Een test voor endogene IRF5 nucleaire lokalisatie werd ontwikkeld om IRF5 activering te beoordelen door Imaging flow flowcytometrieonderzoeken27. Deze test is toegepast in studies die cruciaal waren voor het begrijpen van IRF5 activiteit, vooral in primaire of zeldzame celtypen28,29 en sterk gevorderd de kennis in het veld. Deze test is echter gebaseerd op een gespecialiseerd instrument dat niet algemeen beschikbaar is voor onderzoekers. Verder is het vaak nodig om de initiële stappen van activering te onderzoeken terwijl het ontleden van IRF5 regelgevings trajecten en het identificeren van upstream regulators en traject componenten. Deze studie biedt een robuuste en betrouwbare biochemische test voor de vroege activeringsgebeurtenissen van IRF5 die kunnen worden uitgevoerd in laboratoria die zijn uitgerust met moleculaire biologie tools. Het hier beschreven protocol zal zeer nuttig zijn bij het onderzoeken van de trajecten en mechanismen van IRF5 acties, vooral in combinatie met orthogonale assays zoals de beeldvormings stroom cytometrische analyse van IRF5 nucleaire lokalisatie23, 27,28,30.

Inheemse polyacrylamidegel elektroforese (native page) is een veelgebruikte methode voor het analyseren van eiwitcomplexen31,32. In tegenstelling tot natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE) scheidt inheemse pagina eiwitten op basis van hun vorm, grootte en lading. Het behoudt ook inheemse eiwitstructuur zonder denaturatie31,33,34,35. Het protocol gepresenteerd maakt gebruik van deze functies van de inheemse pagina en detecteert zowel monomere en dimeer vormen van IRF5. Deze methode is vooral belangrijk voor het opsporen van vroege activeringsgebeurtenissen, omdat er geen geschikte commercieel beschikbare antilichamen zijn die endogene fosforyleerd IRF5 kunnen detecteren. Eerder, verschillende gepubliceerde studies gebruikt inheemse pagina om te beoordelen IRF5 dimerization. De meerderheid van deze studies hing echter af van de overexpressie van exogene epitope-Tagged IRF5 om de activeringsstatus te analyseren2,13,24,36,37 . Dit werk presenteert een stap-voor-stap protocol voor het analyseren van endogene IRF5 door dimerisatie via een gemodificeerde inheemse pagina techniek in een menselijke plasmacytoïde dendritische cel (pDC) lijn, waar IRF5 activiteit is aangetoond dat cruciaal zijn voor zijn functie1, 38,39,40. Deze zelfde techniek is toegepast op andere cellijnen23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: Het hier beschreven protocol gebruikt CAL-1 pDC-cellijn behandeld met resiquimod (R848), een agonist voor TLR7/8. Dit protocol is toegepast op andere menselijke en muriene celtypen, met inbegrip van RAW 264,7 (Murine macrofaag lijn), thp-1 (humane monocytische cellijn), bjab (menselijke b cellijn), Ramos (humane b cellijn), en mutz-3 (humane dendritische cellijn)23.

1. stimulatie van CAL-1-cellen

  1. Houd CAL-1 celculturen in een T75 kolf bij 37 °C en 5% CO2 onder steriele condities met 20 − 25 ml rpmi 1640 medium met 5% foetaal runderserum (FBS), 25 mm Hepes en 1x mercapto ethanol (d.w.z. complete rpmi 1640 medium).
  2. Breng de cellen over in een conische buis van 50 mL.
    Opmerking: CAL-1-cellen zijn niet-aanhandig. Voor aanhandige celtypen kan standaard trypsinisatie worden uitgevoerd om cellen te oogsten.
  3. Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Verwijder supernatant en reresumeer de celpellet in 8 mL van het volledige RPMI 1640 medium om een homogene suspensie met één cel te verkrijgen.
  4. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Zaai de cellen met een dichtheid van 1 x 106 cellen per put in een 6-put plaat met 4 ml voorverwarmde complete rpmi 1640 medium in elke put. Inbroed voor 20 − 24 uur bij 37 °C en 5% CO2 , zodat de confluentie 90% − 95% kan bereiken (overeenkomend met ongeveer 1,5 x 106 cellen).
  5. Stimuleer de cellen door toevoeging van 4 μL van 1 mg/mL R848 per put van de 6 goed plaat (eindconcentratie van 1 μg/mL). Ook het opzetten van een ongestimuleerde controle goed met cellen zonder de R848 behandeling.
  6. Zorg ervoor dat de R848 gelijkmatig wordt gedispergeerd door de plaat aan de zijkant zachtjes te schommelen. Incuberen de cellen vervolgens 2 − 16 uur in de incubator bij 37 °C en 5% CO2.

2. extractie van cellulaire eiwitten

  1. Breng de celsuspensies van de 6-put plaat over in 5 mL centrifugebuizen.
  2. Centrifugeer op 200 x g gedurende 5 minuten bij RT. Verwijder de supernatant en rebreng de celpellet in 1 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) om een homogene eencelsuspensie te verkrijgen.
  3. Breng de celsuspensie over in een centrifugebuis van 1,5 mL.
  4. Draai kort op 12.000 x g voor 0,5 − 1 minuut bij 4 °c en verwijder voorzichtig het supernatant.
  5. Bereid de lysisbuffer met 6,25 mL van 1 M Tris-HCl pH 7,4 (eindconcentratie van 25 mM), 7,5 mL 5 M NaCl (eindconcentratie van 150 mM), 0,5 mL 0,5 M EDTA (eindconcentratie van 1 mM), 2,5 mL NP-40 (eindconcentratie van 1%) en 7,5 mL glycerol (eindconcentratie van 5%) in 250 mL gedeïoniseerd water (ddH2O). Voeg 100x protease inhibitor eenmalig gebruik cocktail toe aan een uiteindelijke concentratie van 1x naar de lysisbuffer vlak voor gebruik. Houd de bereide lysisbuffer op ijs.
    Opmerking: De lysisbuffer zonder protease kan bij 4 °C worden bewaard.
  6. Rebreng de celpellet in 30 μL ijskoude lysisbuffer en meng door pipetteren op en neer.
  7. Incuberen op ijs gedurende 15 − 20 min.
  8. Het lysaat wordt verduidelijkt door centrifugeren op 12.000 x g gedurende 15 − 20 min bij 4 °c. Breng het supernatant over in een nieuwe, voorgekoelde 1,5 mL centrifugebuis. Houd de extracten op het ijs te allen tijde.
    Opmerking: Cellysaten kunnen bij-20 °C of-80 °C worden bewaard. Kook de monsters niet.
  9. Meet de eiwitconcentratie met Bradford-reagens.

3. analyse van IRF5 Dimerization door native PAGE

  1. Bereid de bovenste (-) en onderste (+) kamer elektroforese buffers. De bovenste kamer buffer bestaat uit 0,3% natrium deoxycholaat (nadoc) in 1x native page Running buffer, en de onderste kamer bestaat uit slechts 1x native page Running buffer.
    Opmerking: Bereid een frisse bovenste kamer buffer voor elke nieuwe run.
  2. Spoel een 3% − 12% native PAGE gel grondig af met water zonder de putjes te verstoren. Zet de gel in de mini-gel tank en verwijder de kam. Prerun de gel in een koude kamer van 4 °C of op ijs bij 150 V gedurende 30 min.
    Opmerking: Prerunning verwijdert overmatige ammoniak en persulfate ionen die kunnen interfereren met het functioneren van de gel.
  3. Tijdens de prerun, bereid de monsters voor het laden door het mengen van de cellulaire eiwitten aangehouden op ijs met 4x native sample buffer.
  4. Na de prerun laadt u 10 − 15 μg eiwit met een eindvolume van 10 − 15 μL per monster.
    Opmerking: Overbelasting van eiwitten kan smearing veroorzaken.
  5. Run gel op 85 V voor 30 min, dan 150 V voor 2 h.
    Opmerking: Gezien de verschillen in apparatuur en cellijnen die door verschillende laboratoria worden gebruikt, kunnen kleine wijzigingen in de concentratie van eiwit monsters, spanning en looptijd geschikt zijn om dit protocol te optimaliseren. Het verlagen van de pre-running en loop spanning terwijl het verhogen van de looptijd kan helpen om de dimeer resolutie en resultaat consistentie te verbeteren.
  6. Week de gel in SDS-Running buffer (25 mM tris pH 8,3, 250 mM Glycine, 0,1% SDS) gedurende 30 minuten bij RT.
    Opmerking: Er is geen agitatie vereist. Af en toe kan de intensiteit van de band niet evenredig zijn met de hoeveelheid eiwit geladen als gevolg van inefficiënte overdracht in de aanwezigheid van deoxycholaat (DOC), die voornamelijk de monomerische vorm van IRF5 beïnvloedt. De gel onderdompelen in SDS Running buffer voorafgaand aan de overdracht lost dit probleem op. De gel is kwetsbaar. Handvat met uiterste zorg van de bodem (dat wil zeggen, hogere percentage) einde van de gel.

4. immunoblot analyse van IRF5

  1. Activeer het polyvinylideendifluoride (PDVF) membraan door het gedurende ongeveer 5 minuten in methanol te weken.
  2. Maak een snede op één hoek van het membraan om de oriëntatie ervan aan te geven. Monteer de transfer sandwich volgens de sequentiële volgorde gedetailleerd in het Protocol van de fabrikant met extra zorg om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen binnen zitten.
  3. Plaats de transfer cassette in de tank en breng deze over op 20 V voor 1 uur op ijs.
    Opmerking: Voer alle incubaties en wast in de daaropvolgende stappen met een schommel Shaker.
  4. Verwijder het membraan van de cassette met een plastic Tang nadat de overbrenging is voltooid. Blokkeer het membraan in blokkerende buffer (TBS) voor 45 min bij RT.
    Opmerking: TBS-buffer met 5% BSA kan ook worden gebruikt als blokkerende buffer.
  5. Inincuberen van het membraan met het primaire antilichaam vermeld in tabel 1. Was het membraan met 1x TBST wasbuffer (20 mM Tris, pH 7,0, 150 mM NaCl en 0,1% Tween 20) gedurende 3 minuten tijdens het schommelen. Herhaal de Wash 2x.
DilluTioN DilluTioN buffer Incubatie Opmerkingen
Primair antilichaam (anti-IRF5) 1/1000 TBS blokkerende buffer Overnachting bij 4 °C of 2 uur bij RT Verdunde antilichamen kunnen meerdere malen worden hergebruikt als ze bij 4 °C worden bewaard in de aanwezigheid van 0,02% natrium azide.
Secundair antilichaam (anti-konijn) 1/10000 TBS blokkerende buffer 45 min bij RT Verdunde antilichamen kunnen meerdere malen worden hergebruikt als ze bij 4 °C worden bewaard in de aanwezigheid van 0,02% natrium azide.
Opmerking: Verdunning moet worden geoptimaliseerd omdat het varieert tussen fabrikanten.

Tabel 1: specificaties van de antilichamen die worden gebruikt in de immunoblotting-procedure.

  1. Inincuberen van het membraan met het secundaire antilichaam vermeld in tabel 1. Was de membranen 3 min in 1x TBST wasbuffer. Herhaal de Wash 2x.
  2. Scan de vlek met behulp van een geschikt gel-documentatiesysteem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De immunoblot (IB) met een anti-IRF5 antilichaam werd uitgevoerd op CAL-1 cellen ongeprikkeld of gestimuleerd met 1 μg/mL R848 voor 2 uur (Figuur 1). Er zijn cellysaten voorbereid en de oorspronkelijke pagina is uitgevoerd. In ongestimuleerde CAL-1-cellen werd IRF5 gedetecteerd als een enkele band op de oorspronkelijke pagina, overeenkomend met zijn monomerische vorm. Bij de behandeling van CAL-1-cellen met R848 voor 2 uur daalde het niveau van IRF5 monomeer met een gelijktijdige toename van de accumulatie van een langzaam migrerende band die overeenstemde met de dimere vorm van IRF5.

Figure 1
Figuur 1: ENDOGENE IRF5 gedimeriseerd in CAL-1 cellen wanneer gestimuleerd met TLR7/8 agonist. CAL-1-cellen werden voor de aangegeven tijd onbehandeld of behandeld met R848. Eiwit monsters werden opgelost door de oorspronkelijke pagina en gevolgd door IB met behulp van de anti-IRF5-antilichamen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

De immunoblot met anti-IRF5-antilichamen werd uitgevoerd op IRF5-overexpressie van 293T cellen, niet getransffecteerd en met verschillende constructies getransfunteerd. Celllysates werden voorbereid en de oorspronkelijke pagina werd uitgevoerd (Figuur 2). Er werd geen IRF5 aangetroffen in niet-getransfunteerde 293T-cellen, die de specificiteit van het anti-IRF5 antilichaam aantonen. Een enkele band overeenkomend met monomerische IRF5 werd alleen gedetecteerd in de 293T cellen die IRF5 overexpressie. Wanneer constructies coderen IRF5-activeren van eiwitten, met inbegrip van NRIG (constitutief actieve RIG-I), MAVS, en IKKβ werden cotransfgeteerd, een langzaam migrerende band corresponderend met de dimere vorm van IRF5 verscheen. Echter, NMDA5 (constitutief actieve MDA5), een verwant eiwit om rig-I, induceerde niet IRF5 door dimerisatie wanneer gecotransffecteerd.

Figure 2
Figuur 2: cotransfectie van IRF5-activerende factoren geïnduceerde IRF5 door dimerisatie in 293t cellen. De 293T cellen waren niet-getransfunteerd (Lane 1) of getransffecteerd met IRF5 (Lane 2) samen met verschillende IRF5 regelgevers (rijstroken 3 − 6). Eiwit monsters werden opgelost door de oorspronkelijke pagina en gevolgd door IB met behulp van de anti-IRF5-antilichamen. NRIG = N-terminal van RIG-I; NMDA5 = N-terminal van MDA5. (Oorspronkelijk gepubliceerd in het Journal of Immunology. KT Chow, C Wilkins, M Narita, R Green, M Knoll, YM Loo en M Gale Jr. 2018. Differentiële en overlappende immune Programma's gereguleerd door IRF3 en IRF5 in Plasmacytoïde dendritische cellen. J. immunol. 201 (10) 3036-3050. Copyright © 2018 de Amerikaanse vereniging van immunologen, Inc.23). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het protocol beschreven hier is een gemodificeerde inheemse pagina die zowel monomere en dimeer vormen van endogene IRF5 onderscheidt. Er zijn weinig studies die melden van de detectie van endogene IRF5 activering met behulp van de gespecialiseerde Imaging flow cytometrie techniek23,27,28,30. Dit protocol maakt gebruik van een veelgebruikte techniek en gebruikte reagentia en hulpmiddelen om de endogene IRF5 activeringsstatus te beoordelen tijdens de vroege gebeurtenissen van activering. Het protocol omvat eenvoudige wijzigingen in een standaard native PAGE-protocol om onderscheid te kunnen maken tussen de monomerische en dimere vormen van IRF5. Het kan gemakkelijk worden aangepast aan studies met behulp van andere cellijnen23. Deze gemodificeerde native PAGE protocol kan endogene IRF5 in zijn twee vormen op te lossen duidelijk zonder niet-specifieke eiwit interferenties (Figuur 2). Endogene IRF5 van ongestimuleerde cellen werd gedetecteerd als een duidelijke enkelvoudige band in dit gel-systeem, terwijl behandeling met R848 voor 2 h resulteerde in het uiterlijk van een band die overeenkomt met IRF5 Dimeren (Figuur 1).

Een inheemse pagina door dimerisatie assay voor IRF3, een soortgelijke transcriptiefactor IRF5 in dezelfde familie, is ontwikkeld en op grote schaal gebruikt in de afgelopen twee decennia32. Ondanks uitgebreide testen en probleemoplossing konden we niet hetzelfde protocol toepassen dat het Laemmli tris-Glycine-systeem gebruikt om IRF5 monomeer en dimer op te lossen. Het in dit artikel beschreven protocol maakt gebruik van bis-tris Gradient gels, die een heel andere chemie hebben dan de Tris-Glycine single percent gels die in het IRF3 protocol worden gebruikt. De verschillende pH-en chemische samenstelling van de gel-elektrofortische systemen kunnen van cruciaal belang zijn om de verschillende vormen van IRF3 en IRF5 te onderscheiden. Inderdaad, IRF3 en IRF5, hoewel vergelijkbaar, hebben verschillende eigenschappen (bijv. ISO punten en modificatie plaatsen) die waarschijnlijk resulteren in verschillend gedrag, terwijl ze worden gescheiden op verschillende gelsystemen.

Voor de gel-run is een 1x native PAGE-buffer met DOC gebruikt. De buffer moet vers worden bereid of bewaard in een schone en eiwit vrije omgeving om te voorkomen dat witte neerslag de oplossing in de bovenste kamer vertroebelt als gevolg van DOC precipiteert niet-specifieke eiwitten. Het wordt sterk aanbevolen dat de geëxtraheerde endogene IRF5 monsters zo snel mogelijk worden onderworpen aan de oorspronkelijke pagina, bij voorkeur binnen een week met minimale bevriezing-dooi cycli. Anders kan er aanzienlijke eiwit degradatie zijn. De afbraak wordt waargenomen bij opslag bij zowel-80 °C als-20 °C. Bovendien moet de pH van de SDS-loop buffer en de TBST-wasbuffer bij RT worden aangepast.

Het ideale eindvolume van het in elke put geladen monster was 10 − 15 μL, maar afhankelijk van de verschillende celtypen kunnen kleine aanpassingen nodig zijn. Na de initiële run bij 85 V gedurende 30 minuten, wordt het aanbevolen om de gel op 150 V te blijven draaien voor ongeveer 2 tot 3 uur om een duidelijke scheiding en resolutie van het IRF5 monomeer en dimer te bereiken. Nadat de uitvoering is voltooid, is het van het grootste belang om de gel minutieus van de bodem af te handelen vanwege de differentiële niveaus van dichtheid, variërend van 3% aan de bovenkant en een verhoging naar 12% aan de onderkant. In dit geval is het beter om de gel van de plaat te verwijderen door deze onder te dompelen in de gebruikte loop buffer, die fungeert als een impact kussen om wrijving te minimaliseren en zorgt ervoor dat de gel weg van de plaat kan zweven om breuk te voorkomen.

Enkele kleine nadelen van dit protocol zijn de beperkte selectie gels die beschikbaar zijn om de gewenste resultaten te behalen. Zelfgemaakte gels en enkele andere merken van in de handel verkrijgbare gels zijn zonder succes getest. In onze handen droeg het gebruik van een commerciële loop buffer en gel-systeem bij aan de robuustheid en reproduceerbaarheid van dit protocol, hoewel er geen uitgebreide tests van zelfgemaakte buffers zijn uitgevoerd. Aandacht voor detail is essentieel en ervaring is de sleutel tot succes bij het verkrijgen van duidelijke resultaten. Tot slot, de resolutie van IRF5 vereist een lange tijd (dat wil zeggen, 2 − 3 h) om een ideale scheiding van het monomeer en dimer te krijgen. Verdere verbeteringen en aanpassingen in de toekomst kunnen de efficiëntie verbeteren en de nadelen van dit protocol minimaliseren.

Concluderend, dit protocol is een robuuste assay voor de detectie van endogene IRF5 monomeer en dimeer. Het is geschikt voor toepassingen in verschillende menselijke en muriene celtypen uitdrukken van endogene IRF5. Het zal een waardevol hulpmiddel zijn om de IRF5 regelgevende trajecten en signalering van componenten in verschillende celtypen te bestuderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Het werk werd gesteund door de financiering van de Croucher Foundation en de Startup fondsen van de City University. We danken alle leden van het Chow Laboratory voor hulp bij het experiment en het kritisch lezen van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Life Technologies, HK 21985023
300 W/250 V power supply 230 V AC Life Technologies, HK PS0301
Anti-IRF5 antibody Bethyl Laboratories, USA A303-385
BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) EcoLife, HK MR-12
EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4x 100 mL Life Technologies 15575020
Glycerol 500 mL Life Technologies 15514011
Glycine Life Technologies, HK 15527013
Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody LAB-A-PORTER/Rockland, HK 610-145-002-0.5
Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody LAB-A-PORTER/Rockland, HK 611-145-002-0.5
Halt protease inhibitor cocktail (100x) Thermo Fisher Scientific, HK 78430
HEPES Life Technologies, HK 15630080
LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) Gene Company, HK 927-50000
Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories Life Technologies, HK NW2000
NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit Life Technologies, HK BN1001BOX
NativePAGE Running Buffer 20x Life Technologies, HK BN2001
NativePAGE Sample Buffer 4x Life Technologies, HK BN2003
NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol Tin Hang/Calbiochem, HK #492016-100ML
PBS 7.4 Life Technologies, HK 10010023
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Bio-gene/Merck Millipore, HK IPFL00010
Protein assay kit II (BSA) Bio-Rad, HK 5000002
R848 Invivogen, HK tlrl-r848
RPMI 1640 Life Technologies, HK 61870127
Sodium Chloride ThermoFisher BP358-1
Sodium deoxycholate ≥97% (titration) Tin Hang/Sigma, HK D6750-100G
Tris Life Technologies, HK 15504020
TWEEN 20 Tin Hang/Sigma, HK #P9416-100ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takaoka, A., et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 434, (7030), 243-249 (2005).
  2. Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. IKKbeta is an IRF5 kinase that instigates inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (49), 17438-17443 (2014).
  3. Negishi, H., Taniguchi, T., Yanai, H. The Interferon (IFN) Class of Cytokines and the IFN Regulatory Factor (IRF) Transcription Factor Family. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 10, (11), (2018).
  4. Clark, D. N., et al. Four Promoters of IRF5 Respond Distinctly to Stimuli and are Affected by Autoimmune-Risk Polymorphisms. Frontiers in Immunology. 4, 360 (2013).
  5. Bo, M., et al. Rheumatoid arthritis patient antibodies highly recognize IL-2 in the immune response pathway involving IRF5 and EBV antigens. Scientific Reports. 8, (1), 1789 (2018).
  6. Duffau, P., et al. Promotion of Inflammatory Arthritis by Interferon Regulatory Factor 5 in a Mouse Model. Arthritis and Rheumatolpgy. 67, (12), 3146-3157 (2015).
  7. Feng, D., et al. Irf5-deficient mice are protected from pristane-induced lupus via increased Th2 cytokines and altered IgG class switching. European Journal of Immunology. 42, (6), 1477-1487 (2012).
  8. Richez, C., et al. IFN regulatory factor 5 is required for disease development in the FcgammaRIIB-/-Yaa and FcgammaRIIB-/- mouse models of systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 184, (2), 796-806 (2010).
  9. Tada, Y., et al. Interferon regulatory factor 5 is critical for the development of lupus in MRL/lpr mice. Arthritis and Rheumatology. 63, (3), 738-748 (2011).
  10. Weiss, M., et al. IRF5 controls both acute and chronic inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (35), 11001-11006 (2015).
  11. Schoenemeyer, A., et al. The interferon regulatory factor, IRF5, is a central mediator of toll-like receptor 7 signaling. Journal of Biological Chemistry. 280, (17), 17005-17012 (2005).
  12. Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. Functional regulation of MyD88-activated interferon regulatory factor 5 by K63-linked polyubiquitination. Molecular and Cellular Biology. 28, (24), 7296-7308 (2008).
  13. Lopez-Pelaez, M., et al. Protein kinase IKKβ-catalyzed phosphorylation of IRF5 at Ser462 induces its dimerization and nuclear translocation in myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (49), 17432-17437 (2014).
  14. McGettrick, A. F., O'Neill, L. A. Localisation and trafficking of Toll-like receptors: an important mode of regulation. Current Opinion Immunology. 22, (1), 20-27 (2010).
  15. Baccala, R., Hoebe, K., Kono, D. H., Beutler, B., Theofilopoulos, A. N. TLR-dependent and TLR-independent pathways of type I interferon induction in systemic autoimmunity. Nature Medicine. 13, (5), 543-551 (2007).
  16. Gilliet, M., Cao, W., Liu, Y. J. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases. Nature Reviews Immunology. 8, (8), 594-606 (2008).
  17. Kawai, T., Akira, S. Toll-like Receptors and Their Crosstalk with Other Innate Receptors in Infection and Immunity. Immunity. 34, (5), 637-650 (2011).
  18. Liu, Z., Davidson, A. Taming lupus-a new understanding of pathogenesis is leading to clinical advances. Nature Medicine. 18, (6), 871-882 (2012).
  19. del Fresno, C., et al. Interferon-beta production via Dectin-1-Syk-IRF5 signaling in dendritic cells is crucial for immunity to C. albicans. Immunity. 38, (6), 1176-1186 (2013).
  20. Wang, X., et al. Expression Levels of Interferon Regulatory Factor 5 (IRF5) and Related Inflammatory Cytokines Associated with Severity, Prognosis, and Causative Pathogen in Patients with Community-Acquired Pneumonia. Medical Science Monitor. 24, 3620-3630 (2018).
  21. Zhao, Y., et al. Microbial recognition by GEF-H1 controls IKKepsilon mediated activation of IRF5. Nature Communications. 10, (1), 1349 (2019).
  22. Almuttaqi, H., Udalova, I. A. Advances and challenges in targeting IRF5, a key regulator of inflammation. FEBS Journal. 286, (9), 1624-1637 (2019).
  23. Chow, K. T., et al. Differential and Overlapping Immune Programs Regulated by IRF3 and IRF5 in Plasmacytoid Dendritic Cells. The Journal of Immunology. 201, (10), 3036-3050 (2018).
  24. Cheng, T. F., et al. Differential Activation of IFN Regulatory Factor (IRF)-3 and IRF-5 Transcription Factors during Viral Infection. The Journal of Immunology. 176, (12), 7462-7470 (2006).
  25. Chang Foreman, H. C., Van Scoy, S., Cheng, T. F., Reich, N. C. Activation of interferon regulatory factor 5 by site specific phosphorylation. PLoS One. 7, (3), 33098 (2012).
  26. Lin, R., Yang, L., Arguello, M., Penafuerte, C., Hiscott, J. A CRM1-dependent nuclear export pathway is involved in the regulation of IRF-5 subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 280, (4), 3088-3095 (2005).
  27. Stone, R. C., et al. Interferon regulatory factor 5 activation in monocytes of systemic lupus erythematosus patients is triggered by circulating autoantigens independent of type I interferons. Arthritis and Rheumatology. 64, (3), 788-798 (2012).
  28. De, S., et al. B Cell-Intrinsic Role for IRF5 in TLR9/BCR-Induced Human B Cell Activation, Proliferation, and Plasmablast Differentiation. Frontiers in Immunology. 8, 1938 (2017).
  29. Fabie, A., et al. IRF-5 Promotes Cell Death in CD4 T Cells during Chronic Infection. Cell Reports. 24, (5), 1163-1175 (2018).
  30. Cushing, L., et al. IRAK4 kinase activity controls Toll-like receptor-induced inflammation through the transcription factor IRF5 in primary human monocytes. Journal of Biological Chemistry. 292, (45), 18689-18698 (2017).
  31. Li, C., Arakawa, T. Application of native polyacrylamide gel electrophoresis for protein analysis: Bovine serum albumin as a model protein. International Journal of Biological Macromolecules. 125, 566-571 (2019).
  32. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells. 6, (4), 375-388 (2001).
  33. Subhadarshanee, B., Mohanty, A., Jagdev, M. K., Vasudevan, D., Behera, R. K. Surface charge dependent separation of modified and hybrid ferritin in native PAGE: Impact of lysine 104. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1865, (10), 1267-1273 (2017).
  34. Reynolds, J. A., Tanford, C. Binding of Dodecyl Sulfate to Proteins at High Binding Ratios - Possible Implications for State of Proteins in Biological Membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66, (3), 1002 (1970).
  35. Manning, M., Colon, W. Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure. Biochemistry. 43, (35), 11248-11254 (2004).
  36. Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. IKKalpha negatively regulates IRF-5 function in a MyD88-TRAF6 pathway. Cellular Signalling. 22, (1), 117-127 (2010).
  37. Paun, A., et al. Functional characterization of murine interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and its role in the innate antiviral response. Journal of Biological Chemistry. 283, (21), 14295-14308 (2008).
  38. Yasuda, K., et al. Murine dendritic cell type I IFN production induced by human IgG-RNA immune complexes is IFN regulatory factor (IRF)5 and IRF7 dependent and is required for IL-6 production. The Journal of Immunology. 178, (11), 6876-6885 (2007).
  39. Steinhagen, F., et al. IRF-5 and NF-kappaB p50 co-regulate IFN-beta and IL-6 expression in TLR9-stimulated human plasmacytoid dendritic cells. European Journal of Immunology. 43, (7), 1896-1906 (2013).
  40. Gratz, N., et al. Type I interferon production induced by Streptococcus pyogenes-derived nucleic acids is required for host protection. PLoS Pathogens. 7, (5), 1001345 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics