Native polyakrylamid gel elektroforese Immunoblot analyse av endogene IRF5 Dimerization

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En innfødt Western Blot metode for å analysere endogene interferon regulatoriske faktor 5 dimerization i CAL-1 plasmacytoid dendrittiske cellelinjen er beskrevet. Denne protokollen kan også brukes på andre cellelinjer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Wang, M., Hoo Lim, K., Chow, K. T. Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analysis of Endogenous IRF5 Dimerization. J. Vis. Exp. (152), e60393, doi:10.3791/60393 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Interferon regulerings faktor 5 (IRF5) er en nøkkel transkripsjon faktor for å regulere immunresponsen. Det er aktivert nedstrøms av toll-lignende reseptor myelogen differensiering primære respons gen 88 (TLR-MyD88) signalering veien. IRF5 aktivering innebærer fosforylering, dimerization, og påfølgende translokasjon fra cytoplasma inn i kjernen, som igjen induserer genet uttrykk for ulike Pro-inflammatorisk cytokiner. En deteksjon analysen for IRF5 aktivering er viktig å studere IRF5 funksjoner og relevante veier. Denne artikkelen beskriver en robust analysen til å oppdage endogene IRF5 aktivering i CAL-1 Human plasmacytoid dendrittiske celle (pDC) linje. Protokollen består av en modifisert nondenaturing elektroforese analysen det kanne skjelne IRF5 i sin monomer og dimer blankett, således skaffer en affordable og følsom adgang å analysere IRF5 aktivisering.

Introduction

Interferon regulatoriske faktor 5 (IRF5) er en viktig transkripsjon regulator som spiller en fremtredende rolle i å regulere immunresponsen, spesielt i utgivelsen av Pro-inflammatorisk cytokiner og type I interferoner (IFNs)1,2 ,3. Misregulation av IRF5 er en medvirkende faktor i mange autoimmune sykdommer, som tydelig av ulike polymorfismer i IRF5 geometriske steder som er forbundet med systemisk lupus erythematosus, multippel sklerose, revmatoid artritt, etc.4, 5,6,7,8,9,10. Derfor, en robust oppdagelsen analysen for endogene IRF5 aktivisering begrunne er avgjørende for forståelse det regulere trasé og nedstrøms virkninger av IRF5 inne en fysiologisk relevant Cellular sammenheng.

IRF5 er constitutively uttrykt i monocytter, dendrittiske celler (DCs), B-celler og makrofager1,11. Som med andre IRF familien transkripsjon faktorer, IRF5 bor i cytoplasma i sin latente tilstand. Ved aktivering, IRF5 er fosforylert og danner homodimers, som deretter translocate inn i kjernen og binder seg til spesifikke regulatoriske elementer av gener koding type jeg IFNs og Pro-inflammatorisk cytokiner, til slutt indusere uttrykk for disse genene1 ,2,11,12,13. IRF5 regulerer medfødte immunresponser nedstrøms av ulike bompenger-lignende reseptorer (TLRs), slik som TLR7, TLR 8, og TLR 9, som er lokalisert i endosomes og bruke MyD88 for signalnettverk1,11,14. Disse TLRs anerkjenner først og fremst utenlandske nukleinsyre yre arter som single-strandet RNA (ssRNA) og metylerte CpG DNA som er symptomatisk for en infeksjon15,16,17,18. IRF5 har vist å regulere immunresponser mot bakteriell, viral, og fungal infeksjoner19,20,21. Vurderer IRF5's innflytelsesrike og mangfoldig rolle i immunforsvaret, styrke eller dempe IRF5 aktivitet kan tjene som en roman Avenue for utvikling av terapeutiske agenter22. Derfor er det avgjørende å utvikle en protokoll for å overvåke aktiveringsstatus endogene IRF5 å tillate grundig undersøkelse av veier og mekanismer som regulerer IRF5 aktivitet i ulike celletyper.

Etter beste av vår kunnskap, ingen biokjemiske eller gel Elektroforetiske analysen for endogene IRF5 aktivisering har blitt publisert før utviklingen av denne protokollen. Fosforylering har vist seg å være et viktig første trinn i IRF5-aktiveringen, og et phosphospecific IRF5-antistoff ble utviklet som førte til oppdagelsen og bekreftelsen av en Serine rester som var viktig for IRF5 aktivitet13. Men mens antistoff klart oppdager fosforylert IRF5 når immunoprecipitated eller overexpressed23, den ikke klarer å oppdage IRF5 fosforylering i en hel celle lysat i våre hender (data ikke vist). Dimerization er neste trinn i IRF5 aktivisering, og mange viktige studier til dato gransker dette trinnet var avhengig av overuttrykte av epitope-Tagged IRF5, ofte i irrelevante celletyper som ikke normalt uttrykker IRF511,12 ,24,25. Tidligere studier har vist at dimerized IRF5 kan ikke alltid translocate inn i kjernen og dermed er ikke nødvendigvis fullt aktivert25,26. En analysen for endogene IRF5 kjernefysiske lokalisering ble utviklet for å vurdere IRF5 aktivering av Imaging Flow flowcytometri27. Denne analysen har vært brukt i studier som var avgjørende for å forstå IRF5 aktivitet, spesielt i primære eller sjeldne celletyper28,29 og i stor grad avanserte kunnskapen i feltet. Imidlertid er denne analysen avhengig av et spesialisert instrument som ikke er allment tilgjengelig for forskere. Videre er det ofte nødvendig å undersøke de innledende trinnene for aktivisering mens dissekere IRF5 regulatoriske trasé og identifisere oppstrøms regulatorer og Pathway komponenter. Denne studien gir en robust og pålitelig biokjemiske analysen for tidlig aktivering hendelser av IRF5 som kan utføres i laboratorier utstyrt med molekylærbiologi verktøy. Protokollen som er beskrevet her vil være svært nyttig i å undersøke veier og mekanismer for IRF5 handlinger, spesielt når kombinert med ortogonale analyser som Imaging Flow analytiske analyse av IRF5 kjernefysiske lokalisering23, 27,28,30.

Native polyakrylamid gel elektroforese (Native side) er en mye brukt metode for å analysere protein komplekser31,32. I motsetning til natrium dodecylsulfate polyakrylamid gel-elektroforese (SDS-PAGE), skiller den innfødte siden proteiner på grunnlag av sin form, størrelse og ladning. Den beholder også native protein struktur uten denaturering31,33,34,35. Protokollen forevist utnytter disse vise egenskaper av innfødt side og merker begge to monomere og dimeric blankett av IRF5. Denne metoden er spesielt viktig for å oppdage tidlige aktiverings hendelser fordi det ikke er egnet kommersielt tilgjengelig antistoff som kan oppdage endogene fosforylert IRF5. Tidligere brukte flere publiserte studier native PAGE for å vurdere IRF5 dimerization. Men de fleste av disse studiene var avhengig av overuttrykte av eksogene epitope-merket IRF5 å analysere aktiveringsstatus2,13,24,36,37 . Dette arbeidet presenterer en steg-for-trinn protokoll for å analysere endogene IRF5 dimerization via en modifisert native PAGE teknikk i en menneskelig plasmacytoid dendrittiske celle (pDC) linje, der IRF5 aktivitet har vist seg å være avgjørende for sin funksjon1, 38,39,40. Den samme teknikken har blitt brukt på andre cellelinjer23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Protokollen som beskrives her bruker CAL-1 pDC-cellelinje behandlet med resiquimod (R848), en Agonistiske for TLR7/8. Denne protokollen har blitt brukt til andre menneskelige og murine celletyper, inkludert RAW 264,7 (murine macrophage linje), THP-1 (Human monocyttisk cellelinje), BJAB (Human B cellelinje), Ramos (Human B cellelinje), og MUTZ-3 (Human dendrittiske cellelinje)23.

1. stimulering av CAL-1-celler

  1. Oppretthold CAL-1 cellekulturer i en T75 kolbe ved 37 ° c og 5% CO2 under sterile forhold med 20 − 25 mL RPMI 1640 medium som inneholder 5% fosterets storfe serum (FBS), 25 mm HEPES og 1x mercaptoethanol (dvs. komplett RPMI 1640 medium).
  2. Overfør cellene til et 50 mL konisk rør.
    Merk: CAL-1-celler er ikke-tilhenger. For tilhenger celletyper kan standard trypsinization utføres for å høste celler.
  3. Sentrifuger cellene ved 200 x g i 5 min ved romtemperatur (RT). Fjern supernatanten og resuspend celle pellet i 8 mL av hele RPMI 1640 medium for å oppnå en homogen enkelt celle suspensjon.
  4. Tell cellene ved hjelp av en hemocytometer. Seed cellene i en tetthet på 1 x 106 celler per brønn i en 6 brønn plate med 4 ml FORVARMET komplett RPMI 1640 medium i hver brønn. Ruge for 20 − 24 timer ved 37 ° c og 5% CO2 slik at confluency kan nå 90% − 95% (tilsvarende ca. 1,5 x 106 celler).
  5. Stimulere cellene ved å tilsette 4 μL av 1 mg/mL R848 per brønn av den 6 brønn platen (siste konsentrasjon på 1 μg/mL). Også sette opp en unstimulated kontroll godt med celler uten R848 behandling.
  6. Sørg for at R848 er jevnt fordelt ved å riste platen forsiktig fra side til side. Deretter ruge cellene for 2 − 16 t i inkubator ved 37 ° c og 5% CO2.

2. ekstraksjon av cellulære proteiner

  1. Overfør celle suspensjonen fra 6 brønn platen til 5 mL sentrifugerør.
  2. Sentrifuger på 200 x g i 5 min ved RT. Fjern supernatanten og resuspend celle pellet i 1 ml fosfat-bufret saltvann (PBS) for å oppnå en homogen enkelt celle suspensjon.
  3. Overfør celle fjæringen til et 1,5 mL sentrifugerør.
  4. Snurr kort ned ved 12 000 x g for 0,5 − 1 min ved 4 ° c og fjern forsiktig supernatanten.
  5. Klargjør lyseringsbufferen som inneholder 6,25 mL 1 M Tris-HCl pH 7,4 (siste konsentrasjon på 25 mM), 7,5 mL 5 M NaCl (endelig konsentrasjon på 150 mM), 0,5 mL av 0,5 M EDTA (siste konsentrasjon på 1 mM), 2,5 mL NP-40 (siste konsentrasjon på 1%) og 7,5 mL glyserol (siste konsentrasjon på 5%) i 250 mL deionisert vann (ddH2O). Legg til 100 x protease hemmer en gangs cocktail til en endelig konsentrasjon på 1x til lyseringsbufferen like før bruk. Hold forberedt lyseringsbuffer på isen.
    Merk: Lyseringsbufferen uten protease kan oppbevares ved 4 ° c.
  6. Resuspend celle pellet i 30 μL av iskald lyseringsbuffer og bland med pipettering opp og ned.
  7. Ruge på is i 15 − 20 min.
  8. Klargjør lysat ved å sentrifugering ved 12 000 x g i 15 − 20 min ved 4 ° c. Overfør supernatanten til en ny prechilled 1,5 mL sentrifuge slange. Hold ekstrakter på isen til enhver tid.
    Merk: Celle lysater kan oppbevares ved-20 ° c eller-80 ° c. Ikke kok prøvene.
  9. Mål protein konsentrasjonen ved hjelp av Bradford reagens.

3. analyse av IRF5 Dimerization av Native PAGE

  1. Klargjør de øvre (-) og nedre (+) kammer elektroforese buffere. Den øvre kammer buffer består av 0,3% natrium natriumdeoksykolat (NaDOC) i 1x native PAGE kjører buffer, og det nedre kammeret består av bare 1x native PAGE kjører buffer.
    Merk: Forbered en frisk øvre kammer buffer for hver nye løpe.
  2. Skyll en 3% − 12% naturlig side gel grundig med vann uten å forvrenge brønnene. Sett gelen inn i mini gel tanken og fjern kammen. Prerun gelen i en 4 ° c kaldt rom eller på is ved 150 V i 30 min.
    Merk: Prerunning fjerner overdreven ammoniakk og persulfate ioner som kan forstyrre driften av gelen.
  3. Under Prerun, forberede prøvene for lasting ved å blande de cellulære proteiner holdt på isen med 4X native sample buffer.
  4. Etter Prerun, Last 10 − 15 mikrogram protein med et endelig volum på 10 − 15 μL per prøve.
    Merk: Overbelastning av protein kan forårsake flekker.
  5. Kjør gel på 85 V i 30 min, deretter 150 V for 2 t.
    Merk: Vurderer forskjeller i utstyr og cellelinjer som brukes av ulike laboratorier, mindre endringer i konsentrasjonen av protein prøver, spenning og kjøretid kan være hensiktsmessig å optimalisere denne protokollen. Senking pre-running og kjører spenning mens økende kjøretid kan bidra til å forbedre dimer oppløsning og resultat konsistens.
  6. Sug gelen i SDS kjører buffer (25 mM Tris pH 8,3, 250 mM Glycine, 0,1% SDS) i 30 min ved RT.
    Merk: Ingen agitasjon er nødvendig. Noen ganger, intensiteten av bandet kan ikke være proporsjonal med mengden protein lastet på grunn av ineffektiv overføring i nærvær av natriumdeoksykolat (DOC), som i hovedsak påvirker monomere form av IRF5. Soaking gelen i SDS kjører buffer før overføringen løser dette problemet. Gelen er skjør. Håndtak med ekstrem forsiktighet fra bunnen (dvs. høyere prosent) slutten av gelen.

4. Immunoblot analyse av IRF5

  1. Aktiver Polyvinylidene polyvinylidenfluorid (PDVF) membranen ved soaking den i metanol i ca 5 min.
  2. Lag et kutt på et hjørne av membranen for å indikere dens orientering. Monter overførings smørbrødet i henhold til den sekvensielle rekkefølgen som er beskrevet i produsentens protokoll, med ekstra forsiktighet for å sikre at ingen luftbobler er fanget inne.
  3. Plasser overførings kassetten i tanken og Overfør ved 20 V for 1 time på is.
    Merk: Utfør alle incubations og vasker i påfølgende trinn med en rocking shaker.
  4. Fjern membranen fra kassetten med plast tang etter at overføringen er fullført. Blokker membranen i blokkerende buffer (TBS) for 45 min ved RT.
    Merk: TBS-buffer med 5% BSA kan også brukes som blokkerings buffer.
  5. Ruge membranen med det primære antistoff som er listet opp i tabell 1. Vask membranen med 1x TBST vaskebuffer (20 mM Tris, pH 7,0, 150 mM NaCl og 0,1% mellom 20) i 3 minutter mens du rocker. Gjenta vasken 2x.
Kamuflering Kamuflering buffer Inkubasjon Kommentarer
Primært antistoff (anti-IRF5) 1/1000 TBS blokkerer buffer Over natten ved 4 ° c eller 2 timer ved RT Utvannet antistoffer kan gjenbrukes flere ganger hvis det oppbevares ved 4 ° c i nærvær av 0,02% natrium Natriumazid.
Sekundær antistoff (anti-kanin) 1/10000 TBS blokkerer buffer 45 min for RT Utvannet antistoffer kan gjenbrukes flere ganger hvis det oppbevares ved 4 ° c i nærvær av 0,02% natrium Natriumazid.
Merk: Fortynning må optimaliseres ettersom det varierer mellom produsentene.

Tabell 1: spesifikasjoner for Antistoffene som brukes i proteinimmunoblotting prosedyren.

  1. Ruge membranen med det sekundære antistoff oppført i tabell 1. Vask membraner for 3 min i 1x TBST vaskebuffer. Gjenta vasken 2x.
  2. Skann blot ved hjelp av et passende gel dokumentasjons system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunoblot (IB) med et anti-IRF5 antistoff ble utført på CAL-1-celler unstimulated eller stimulert med 1 μg/mL R848 for 2 t (figur 1). Celle lysater ble klargjort, og den opprinnelige siden ble utført. I unstimulated CAL-1-celler ble IRF5 gjenkjent som et enkelt bånd på den opprinnelige siden, tilsvarende det monomere skjemaet. Ved behandling av CAL-1-celler med R848 for 2 t, nivået av IRF5 monomer redusert med en samtidig økning i akkumulering av en langsomt migrerer band som tilsvarte den dimeric form av IRF5.

Figure 1
Figur 1: ENDOGENE IRF5 dimerized i Cal-1 celler ved stimulering med TLR7/8 Agonistiske. CAL-1-celler ble ubehandlet eller behandlet med R848 for angitt tid. Protein prøver ble løst av Native PAGE og etterfulgt av IB ved hjelp av anti-IRF5 antistoff. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Immunoblot med anti-IRF5-antistoff ble utført på IRF5-overexpressing 293T-celler untransfected og transfekterte med ulike konstruksjoner. Celle lysater ble klargjort og Opprinnelig side ble utført (figur 2). Ingen IRF5 ble påvist i untransfected 293T celler, som demonstrerer spesifisitet av anti-IRF5 antistoff. Et enkelt band som tilsvarer monomere IRF5 ble bare oppdaget i 293T-cellene overexpressing IRF5. Når konstruerer koding IRF5-aktivering proteiner, inkludert NRIG (constitutively aktiv RIG-I), MAVS og IKKβ var cotransfected, en langsomt migrerer band som tilsvarer den dimeric form av IRF5 dukket opp. Men NMDA5 (constitutively aktiv MDA5), et beslektet protein til RIG-I, ikke indusere IRF5 dimerization når cotransfected.

Figure 2
Figur 2: Cotransfection av IRF5-aktivering faktorer indusert IRF5 dimerization i 293T celler. De 293T cellene ble untransfected (Lane 1) eller transfekterte med IRF5 (Lane 2) sammen med ulike IRF5 regulatorer (baner 3 − 6). Protein prøver ble løst av Native PAGE og etterfulgt av IB ved hjelp av anti-IRF5 antistoff. NRIG = N-Terminal av RIGG-I; NMDA5 = N-Terminal av MDA5. (Opprinnelig publisert i Journal of immunologi. KT Chow, C Wilkins, M Narita, R Green, M haugen, YM LoO og M gale Jr 2018. Differensial og overlappende immune programmer regulert av IRF3 og IRF5 i Plasmacytoid dendrittiske Cells. J. Immunol. 201 (10) 3036-3050. Copyright © 2018 The American Association of Immunologer, Inc.23). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen som er beskrevet her er en modifisert innfødt side som skiller både monomere og dimeric former for endogene IRF5. Det har vært få studier som rapporterer påvisning av endogene IRF5 aktivering ved hjelp av spesialiserte Imaging Flow flowcytometri Technique23,27,28,30. Denne protokollen bruker en felles teknikk og vanlig reagenser og verktøy for å vurdere den endogene IRF5 aktiveringstilstand under de tidlige hendelsene i aktiveringen. Protokollen medfører enkel modifiseringer å en målestokk innfødt side protokollen å sette i stand skillet imellom monomere og dimeric blankett av IRF5. Det kan lett tilpasses til studier ved hjelp av andre cellelinjer23. Denne modifiserte native PAGE protokollen kan løse endogene IRF5 i sine to former klart uten ikke-spesifikke protein forstyrrelser (figur 2). Endogene IRF5 fra unstimulated celler ble påvist som et klart enkelt band i dette gel systemet, mens behandling med R848 for 2 h resulterte i utseendet på et band som tilsvarer IRF5 dimers (figur 1).

En innfødt PAGE dimerization analysen for IRF3, en lignende transkripsjon faktor til IRF5 i samme familie, har blitt utviklet og mye brukt i de siste to ti årene32. Til tross for omfattende testing og feilsøking, kunne vi ikke bruke den samme protokollen som sysselsetter Laemmli Tris-Glycine system for å løse IRF5 monomer og dimer. Protokollen som er beskrevet i denne artikkelen bruker BIS-Tris gradient gels, som har en helt annen kjemi til Tris-Glycine enkelt prosent gels brukes i IRF3 protokollen. De ulike pH og kjemiske sammensetning av gel Elektroforetiske systemer kan være avgjørende for å skille de ulike formene for IRF3 og IRF5. Faktisk, IRF3 og IRF5, mens lignende, har forskjellige egenskaper (f. eks, isoelectric poeng og modifikasjon nettsteder) sannsynligvis resulterer i ulike atferd samtidig som det skilles på ulike gel systemer.

En 1x innfødt side som kjører buffer som inneholder DOC ble brukt for gel Run. Bufferen må tilberedes friskt eller oppbevares i et rent og protein fritt miljø for å unngå at det oppstår hvite precipitates clouding løsningen i det øvre kammeret som et resultat av DOC-fremskynde ikke-spesifikke proteiner. Det anbefales sterkt at den utpakkede endogene IRF5 prøvene bli utsatt for den opprinnelige siden så snart som mulig, fortrinnsvis innen en uke med minimal fryse-tine sykluser. Ellers kan det være betydelig protein degradering. Nedbrytningen er observert med lagring ved begge-80 ° c og-20 ° c. I tillegg bør pH-verdien i SDS som kjører buffer og TBST vaskebuffer justeres ved RT.

Det ideelle endelige volumet av prøven lastet i hver brønn var 10 − 15 μL, men små justeringer kan være nødvendig avhengig av ulike celletyper. Etter den første kjøre på 85 V i 30 min, er det anbefalt å fortsette å kjøre gel på 150 V for ca 2 til 3 h for å oppnå distinkte separasjon og oppløsning av IRF5 monomer og dimer. Etter kjøringen er ferdig, er det av største viktighet å håndtere gel omhyggelig fra bunn enden på grunn av sin differensial nivåer av tetthet, alt fra 3% på toppen og øke mot 12% nederst. I dette tilfellet er det best å fjerne gelen fra platen ved å senke den i den brukte kjører buffer, som fungerer som en innvirkning pute for å minimere friksjon og gjør at gelen til å flyte bort fra platen for å unngå brudd.

Noen mindre ulemper med denne protokollen inkluderer begrenset utvalg av gels tilgjengelig for å oppnå de ønskede resultater. Hjemmelaget gels og noen andre merker av kommersielt tilgjengelige gels har blitt testet uten å lykkes. I våre hender, bruk av en kommersiell kjører buffer og gel system bidratt til robusthet og reproduserbarhet av denne protokollen, selv om omfattende testing av hjemmelagde buffere ikke har blitt utført. Oppmerksomhet på detaljer er viktig, og erfaring er nøkkelen til suksess i å oppnå klare resultater. Endelig krevde oppløsningen av IRF5 lang tid (dvs. 2 − 3 t) for å få en ideell separasjon av monomer og dimer. Ytterligere forbedring og modifikasjoner i fremtiden kan forbedre effektiviteten og minimere ulempene med denne protokollen.

Avslutningsvis er denne protokollen en robust analysen for påvisning av endogene IRF5 monomer og dimer. Det er egnet for applikasjoner i ulike menneskelige og murine celletyper uttrykke endogene IRF5. Det vil være et verdifullt verktøy for å studere IRF5 regulatoriske trasé og signalering komponenter i ulike celletyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Arbeidet ble støttet av finansiering fra Croucher Foundation og City University oppstart midler. Vi takker alle medlemmer av Chow laboratoriet for hjelp med eksperimentet og kritisk lesning av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Life Technologies, HK 21985023
300 W/250 V power supply 230 V AC Life Technologies, HK PS0301
Anti-IRF5 antibody Bethyl Laboratories, USA A303-385
BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) EcoLife, HK MR-12
EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4x 100 mL Life Technologies 15575020
Glycerol 500 mL Life Technologies 15514011
Glycine Life Technologies, HK 15527013
Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody LAB-A-PORTER/Rockland, HK 610-145-002-0.5
Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody LAB-A-PORTER/Rockland, HK 611-145-002-0.5
Halt protease inhibitor cocktail (100x) Thermo Fisher Scientific, HK 78430
HEPES Life Technologies, HK 15630080
LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) Gene Company, HK 927-50000
Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories Life Technologies, HK NW2000
NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit Life Technologies, HK BN1001BOX
NativePAGE Running Buffer 20x Life Technologies, HK BN2001
NativePAGE Sample Buffer 4x Life Technologies, HK BN2003
NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol Tin Hang/Calbiochem, HK #492016-100ML
PBS 7.4 Life Technologies, HK 10010023
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Bio-gene/Merck Millipore, HK IPFL00010
Protein assay kit II (BSA) Bio-Rad, HK 5000002
R848 Invivogen, HK tlrl-r848
RPMI 1640 Life Technologies, HK 61870127
Sodium Chloride ThermoFisher BP358-1
Sodium deoxycholate ≥97% (titration) Tin Hang/Sigma, HK D6750-100G
Tris Life Technologies, HK 15504020
TWEEN 20 Tin Hang/Sigma, HK #P9416-100ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takaoka, A., et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 434, (7030), 243-249 (2005).
  2. Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. IKKbeta is an IRF5 kinase that instigates inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (49), 17438-17443 (2014).
  3. Negishi, H., Taniguchi, T., Yanai, H. The Interferon (IFN) Class of Cytokines and the IFN Regulatory Factor (IRF) Transcription Factor Family. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 10, (11), (2018).
  4. Clark, D. N., et al. Four Promoters of IRF5 Respond Distinctly to Stimuli and are Affected by Autoimmune-Risk Polymorphisms. Frontiers in Immunology. 4, 360 (2013).
  5. Bo, M., et al. Rheumatoid arthritis patient antibodies highly recognize IL-2 in the immune response pathway involving IRF5 and EBV antigens. Scientific Reports. 8, (1), 1789 (2018).
  6. Duffau, P., et al. Promotion of Inflammatory Arthritis by Interferon Regulatory Factor 5 in a Mouse Model. Arthritis and Rheumatolpgy. 67, (12), 3146-3157 (2015).
  7. Feng, D., et al. Irf5-deficient mice are protected from pristane-induced lupus via increased Th2 cytokines and altered IgG class switching. European Journal of Immunology. 42, (6), 1477-1487 (2012).
  8. Richez, C., et al. IFN regulatory factor 5 is required for disease development in the FcgammaRIIB-/-Yaa and FcgammaRIIB-/- mouse models of systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 184, (2), 796-806 (2010).
  9. Tada, Y., et al. Interferon regulatory factor 5 is critical for the development of lupus in MRL/lpr mice. Arthritis and Rheumatology. 63, (3), 738-748 (2011).
  10. Weiss, M., et al. IRF5 controls both acute and chronic inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (35), 11001-11006 (2015).
  11. Schoenemeyer, A., et al. The interferon regulatory factor, IRF5, is a central mediator of toll-like receptor 7 signaling. Journal of Biological Chemistry. 280, (17), 17005-17012 (2005).
  12. Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. Functional regulation of MyD88-activated interferon regulatory factor 5 by K63-linked polyubiquitination. Molecular and Cellular Biology. 28, (24), 7296-7308 (2008).
  13. Lopez-Pelaez, M., et al. Protein kinase IKKβ-catalyzed phosphorylation of IRF5 at Ser462 induces its dimerization and nuclear translocation in myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (49), 17432-17437 (2014).
  14. McGettrick, A. F., O'Neill, L. A. Localisation and trafficking of Toll-like receptors: an important mode of regulation. Current Opinion Immunology. 22, (1), 20-27 (2010).
  15. Baccala, R., Hoebe, K., Kono, D. H., Beutler, B., Theofilopoulos, A. N. TLR-dependent and TLR-independent pathways of type I interferon induction in systemic autoimmunity. Nature Medicine. 13, (5), 543-551 (2007).
  16. Gilliet, M., Cao, W., Liu, Y. J. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases. Nature Reviews Immunology. 8, (8), 594-606 (2008).
  17. Kawai, T., Akira, S. Toll-like Receptors and Their Crosstalk with Other Innate Receptors in Infection and Immunity. Immunity. 34, (5), 637-650 (2011).
  18. Liu, Z., Davidson, A. Taming lupus-a new understanding of pathogenesis is leading to clinical advances. Nature Medicine. 18, (6), 871-882 (2012).
  19. del Fresno, C., et al. Interferon-beta production via Dectin-1-Syk-IRF5 signaling in dendritic cells is crucial for immunity to C. albicans. Immunity. 38, (6), 1176-1186 (2013).
  20. Wang, X., et al. Expression Levels of Interferon Regulatory Factor 5 (IRF5) and Related Inflammatory Cytokines Associated with Severity, Prognosis, and Causative Pathogen in Patients with Community-Acquired Pneumonia. Medical Science Monitor. 24, 3620-3630 (2018).
  21. Zhao, Y., et al. Microbial recognition by GEF-H1 controls IKKepsilon mediated activation of IRF5. Nature Communications. 10, (1), 1349 (2019).
  22. Almuttaqi, H., Udalova, I. A. Advances and challenges in targeting IRF5, a key regulator of inflammation. FEBS Journal. 286, (9), 1624-1637 (2019).
  23. Chow, K. T., et al. Differential and Overlapping Immune Programs Regulated by IRF3 and IRF5 in Plasmacytoid Dendritic Cells. The Journal of Immunology. 201, (10), 3036-3050 (2018).
  24. Cheng, T. F., et al. Differential Activation of IFN Regulatory Factor (IRF)-3 and IRF-5 Transcription Factors during Viral Infection. The Journal of Immunology. 176, (12), 7462-7470 (2006).
  25. Chang Foreman, H. C., Van Scoy, S., Cheng, T. F., Reich, N. C. Activation of interferon regulatory factor 5 by site specific phosphorylation. PLoS One. 7, (3), 33098 (2012).
  26. Lin, R., Yang, L., Arguello, M., Penafuerte, C., Hiscott, J. A CRM1-dependent nuclear export pathway is involved in the regulation of IRF-5 subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 280, (4), 3088-3095 (2005).
  27. Stone, R. C., et al. Interferon regulatory factor 5 activation in monocytes of systemic lupus erythematosus patients is triggered by circulating autoantigens independent of type I interferons. Arthritis and Rheumatology. 64, (3), 788-798 (2012).
  28. De, S., et al. B Cell-Intrinsic Role for IRF5 in TLR9/BCR-Induced Human B Cell Activation, Proliferation, and Plasmablast Differentiation. Frontiers in Immunology. 8, 1938 (2017).
  29. Fabie, A., et al. IRF-5 Promotes Cell Death in CD4 T Cells during Chronic Infection. Cell Reports. 24, (5), 1163-1175 (2018).
  30. Cushing, L., et al. IRAK4 kinase activity controls Toll-like receptor-induced inflammation through the transcription factor IRF5 in primary human monocytes. Journal of Biological Chemistry. 292, (45), 18689-18698 (2017).
  31. Li, C., Arakawa, T. Application of native polyacrylamide gel electrophoresis for protein analysis: Bovine serum albumin as a model protein. International Journal of Biological Macromolecules. 125, 566-571 (2019).
  32. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells. 6, (4), 375-388 (2001).
  33. Subhadarshanee, B., Mohanty, A., Jagdev, M. K., Vasudevan, D., Behera, R. K. Surface charge dependent separation of modified and hybrid ferritin in native PAGE: Impact of lysine 104. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1865, (10), 1267-1273 (2017).
  34. Reynolds, J. A., Tanford, C. Binding of Dodecyl Sulfate to Proteins at High Binding Ratios - Possible Implications for State of Proteins in Biological Membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66, (3), 1002 (1970).
  35. Manning, M., Colon, W. Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure. Biochemistry. 43, (35), 11248-11254 (2004).
  36. Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. IKKalpha negatively regulates IRF-5 function in a MyD88-TRAF6 pathway. Cellular Signalling. 22, (1), 117-127 (2010).
  37. Paun, A., et al. Functional characterization of murine interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and its role in the innate antiviral response. Journal of Biological Chemistry. 283, (21), 14295-14308 (2008).
  38. Yasuda, K., et al. Murine dendritic cell type I IFN production induced by human IgG-RNA immune complexes is IFN regulatory factor (IRF)5 and IRF7 dependent and is required for IL-6 production. The Journal of Immunology. 178, (11), 6876-6885 (2007).
  39. Steinhagen, F., et al. IRF-5 and NF-kappaB p50 co-regulate IFN-beta and IL-6 expression in TLR9-stimulated human plasmacytoid dendritic cells. European Journal of Immunology. 43, (7), 1896-1906 (2013).
  40. Gratz, N., et al. Type I interferon production induced by Streptococcus pyogenes-derived nucleic acids is required for host protection. PLoS Pathogens. 7, (5), 1001345 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics