पौधे रोगजनकों के स्रावित प्रभावकों से आरएनए को बंद करने वाले दमनकर्ताओं की स्क्रीनिंग और पहचान

Genetics

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Summary

यहां, हम एक संशोधित स्क्रीनिंग विधि पेश करते हैं जिसका उपयोग पौधे रोगजनकों में दबाने वालों को जल्दी से स्क्रीन करने के लिए बड़े पैमाने पर किया जा सकता है।

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Shi, J., Jia, Y., Fang, D., He, S., Zhang, P., Guo, Y., Qiao, Y. Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens. J. Vis. Exp. (156), e60697, doi:10.3791/60697 (2020).

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Abstract

आरएनए चुप्पी एक विकासवादी संरक्षित, अनुक्रम विशिष्ट जीन विनियमन तंत्र है। कई पौधे रोगजनकों ने मेजबान संयंत्र आरएनए को रोकने के मार्ग को बाधित करने की क्षमता के साथ प्रोटीन विकसित किया है। वायरस प्रभावक प्रोटीन के विपरीत, केवल कई स्रावित प्रभावक प्रोटीन ने बैक्टीरियल, ऊमाइसेट और फंगल रोगजनकों में आरएनए को दबाने की क्षमता दिखाई है, और अधिकांश प्रभावकों के आणविक कार्य काफी हद तक अज्ञात रहते हैं। यहां, हम विस्तार से सह घुसपैठ परख का एक थोड़ा संशोधित संस्करण का वर्णन है कि आरएनए चुप्पी देख और संयंत्र रोगजनकों द्वारा स्रावित प्रभावक प्रोटीन की विशेषता के लिए एक सामांय विधि के रूप में काम कर सकता है । दृष्टिकोण के प्रमुख कदम स्वस्थ और पूरी तरह से विकसित पत्तियों का चयन कर रहे हैं, ६०० एनएम पर उचित ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) के लिए बैक्टीरिया संस्कृति का समायोजन, और घुसपैठ पर इष्टतम समय पर हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) फ्लोरेसेंस देख कमजोर दमन गतिविधि के साथ प्रभावकों को छोड़ने से बचने के लिए छोड़ देता है। यह बेहतर प्रोटोकॉल आरएनए के दमन को बंद करने में तेजी से, सटीक और व्यापक स्क्रीनिंग में योगदान देगा और इन प्रोटीनों के आणविक कार्यों की जांच के लिए एक उत्कृष्ट प्रारंभिक बिंदु के रूप में काम करेगा।

Introduction

पिछले दो दशकों में, पौधों की बीमारियों का कारण बनने वाले सूक्ष्मजीवों के जीनोम अनुक्रमण में त्वरण के कारण अनुक्रम की जानकारी और एन्कोडेड प्रोटीन के जैविक कार्यों के बीच लगातार बढ़ते ज्ञान का अंतर पैदा हुआ है अनुक्रमण परियोजनाओं द्वारा प्रकट अणुओं में प्रभावक अणु हैं जो सहज प्रतिरक्षा को दबाते हैं और मेजबान उपनिवेशीकरण की सुविधा प्रदान करते हैं; इन कारकों को विनाशकारी पौधे रोगजनकों द्वारा स्रावित किया जाता है, जिसमें बैक्टीरिया, सूत्रकृमि और तंतु रोगाणु शामिल हैं। इन खतरों का जवाब देने के लिए, मेजबान पौधों ने उपन्यास रिसेप्टर्स विकसित किए हैं जो इन प्रभावकों को पहचानते हैं, जिससे प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की बहाली को सक्षम किया जा सके। इसलिए, प्रभावक विभिन्न चयनात्मक दबावों के अधीन होते हैं, जिससे रोगजनक वंश 2 के बीच प्रभावक प्रदर्शनों का विविधीकरणहोताहै। हाल के वर्षों में, पौधे रोगजनकों के ख्यात प्रभावकों को विभिन्न तरीकों से रोगाणुओं को लाभ पहुंचाने के लिए मेजबान सेलुलर प्रक्रियाओं को बाधित करके पौधों की सहज प्रतिरक्षा को बाधित करने केलिए दिखाया गया है, जिसमें सिग्नलिंग पाथवे, ट्रांसक्रिप्शन, इंट्रासेलुलर परिवहन, साइटोस्केलेटन स्थिरता, वेसिकल ट्रैफिकिंग और आरएनए को3,4,5का डिस्रेगुलेशन शामिल है । हालांकि, रोगजनक प्रभावकों के विशाल बहुमत, विशेष रूप से तंतुओं रोगजनकों से उन, रहस्यपूर्ण बने हुए हैं ।

आरएनए साइलेनिंग एक होमोलॉजी-मध्यस्थता जीन निष्क्रियता मशीनरी है जिसे यूकेरियोट्स के बीच संरक्षित किया जाता है। यह प्रक्रिया लंबे समय से डबल-फंसे आरएनए (dsRNA) से शुरू होती है और एक अनुक्रम-विशिष्ट तरीके से एक प्रकार का शब्दका हुआ आरएनए (ssRNA) को लक्षित करती है, और यह एंटीवायरल रक्षा6सहित जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में हेरफेर करती है। मेजबान की सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को पार करने के लिए, कुछ वायरस आरएनए साइलेंटिंग को ऑफसेट करने के लिए विकसित हुए हैं, जिसमें इंट्रासेलर डिब्बों के अंदर दोहराने या मुंह में पुनर्गठित संकेत से बचने की क्षमता शामिल है। फिर भी, सबसे सामान्य रणनीति जिसके द्वारा वायरस जीन फ़ंक्शन के आरएनए के खिलाफ अपने जीनोम की रक्षा करते हैं, वह विशिष्ट प्रोटीन को एन्कोड करना है जो आरएनए को7,8को दबादेता है। आरएनए सिलेक्टिंग (वीआरएस) के वायरल दमनकों को स्क्रीन और विशेषता देने के लिए कई मशीनी रूप से अलग-अलग दृष्टिकोण स्थापित किए गए हैं, जिनमें एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफैक्यूप्स संस्कृतियों की सह-घुसपैठ, परिवर्तनीय दमनक, ग्राफ्टिंग और सेल संस्कृति9,10,11,12, 13को व्यक्त करना शामिल है।

इन परखों में से प्रत्येक के फायदे और नुकसान हैं, और अपने अलग तरीके से वीआरएस की पहचान करता है। सबसे आम दृष्टिकोणों में से एक व्यक्तिगत ए tmuefaciens संस्कृतियों के सह घुसपैठ पर आधारित है संभावित वायरल प्रोटीन और एक रिपोर्टर जीन (आम तौर पर हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन [GFP]) निकोतियाना बेंथमियाना 16c पौधों पर संविलियन फूलगोभी पच्चीकारी वायरस 35S प्रमोटर के नियंत्रण में GFP व्यक्त । एक सक्रिय वायरल मुंह दबाने के अभाव में, GFP मेजबान कोशिकाओं द्वारा बहिर्जात के रूप में पहचानकी जाती है और घुसपैठ के बाद (डीपीआई) 3 दिनों के भीतर खामोश है। इसके विपरीत, यदि वायरल प्रोटीन दमन गतिविधि के पास है, तो जीएफपी का अभिव्यक्ति स्तर 3−9 डीपीआई9से परे स्थिर रहता है। यह सह घुसपैठ परख सरल और तेजी से है; हालांकि, यह न तो अत्यधिक स्थिर है और न ही संवेदनशील है। फिर भी, परख कई आरएनए वायरस7,8में विविध प्रोटीन दृश्यों और संरचनाओं के साथ कई VSRs की पहचान की है ।

हाल ही में, कई प्रभावक प्रोटीन जो सेलुलर आरएनए को बाधित कर सकते हैं, बैक्टीरियल, ऊमाइसेट और फंगल प्लांटरोगजनक14,15,16से विशेषता है। इन निष्कर्षों का मतलब है कि आरएनए को दमन करना संक्रमण को सुविधाजनक बनाने के लिए एक आम रणनीति है जिसका उपयोग अधिकांश राज्यों में रोगजनकों द्वारा किया जाता है। सिद्धांत रूप में, कई, यदि सभी नहीं हैं, तो प्रभावकआरएनए को दबाने वालों (आरएसएसएस) को एन्कोड कर सकते हैं; आज तक, हालांकि, केवल कुछ की पहचान की गई है, मुख्य रूप से विश्वसनीय और सामान्य स्क्रीनिंग रणनीति की कमी के कारण। इसके अलावा, आरएनए के दमन की जांच17पौधे रोगजनकों के विशाल बहुमत में नहीं की गई है।

इस रिपोर्ट में, हम संयंत्र रोगजनक प्रभावकों की पहचान करने के लिए एक अनुकूलित और सामान्य प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो कृषि घुसपैठ परख का उपयोग करके स्थानीय और प्रणालीगत आरएनए को दबा सकता है। इस अध्ययन का सबसे महत्वपूर्ण उद्देश्य प्रोटोकॉल के प्रमुख पहलुओं पर जोर देना और चरणों का विस्तार से वर्णन करना था, जिससे एक स्क्रीनिंग परख प्रदान करना था जो पौधे रोगजनकों के लगभग सभी प्रभावकों के लिए उपयुक्त है।

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Protocol

नोट: प्रक्रिया के सभी कदम कमरे के तापमान (आरटी) पर आयोजित किया जाना चाहिए ।

सावधानी: रोगजनक रोगाणुओं युक्त सभी मीडिया जमा करें, साथ ही पौधों और पौधों के ऊतकों को परख में इस्तेमाल किया, उचित अपशिष्ट कंटेनरों में और त्यागने से पहले autoclave ।

1. ख्यात प्रभावकों वाले प्लाज्मिड निर्माण ों की तैयारी

  1. संक्रमण के दौरान अत्यधिक व्यक्त किए जाने वाले ख्यात स्रावित प्रभावकों का चयन करें, जैसा कि आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-एसईक्यू) द्वारा निर्धारित किया गया है, और आगे मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) तकनीक द्वारा।
  2. सिग्नलपी18जैसे सॉफ्टवेयर टूल का उपयोग करके प्रत्येक प्रभावक के सिग्नल पेप्टाइड क्लीवेज साइट का निर्धारण करें।
  3. डिजाइन प्राइमर और उच्च निष्ठा डीएनए बहुलक का उपयोग करब्याज के प्रभावक को एन्कोडिंग जीन को बढ़ाना करने के लिए पीसीआर प्रदर्शन करते हैं। पीसीआर उत्पाद की जांच करने के लिए अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस करें, फिर लिगेशन-फ्री क्लोनिंग किट(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग करके गेटवे एंट्री वेक्टर pQBV3 में एम्प्लिकन का क्लोन करें, और बाद में एलआर पुनर्संयोजन प्रतिक्रिया19का उपयोग करके गंतव्य अभिव्यक्ति वेक्टर pEG100 में।
  4. एलआर रिएक्शन मिश्रण के 3−5 माइक्रोन को सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं (जैसे, TOP10, DH5α) के 100 माइक्रोन में बदलें, लुरिया-बर्टानी (एलबी) एगर मीडियम पर परिवर्तित बैक्टीरियल कोशिकाओं को 50 ग्राम/एमएल कनामाइसिन के साथ पूरक करें, और 16−20 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: सकारात्मक ट्रांसफॉर्मेंट की पहचान कॉलोनी पीसीआर20 द्वारा की जा सकती है और आगे प्लाज्मिड मिनीप्रेप और अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है।
  5. रासायनिक रूप से सक्षम ए ट्यूमेफैक्सियंस कोशिकाओं (जैसे, GV3101 या C58C1) के 100 माइक्रोन में प्रभावक प्रोटीन ले जाने वाले रिकॉम्बिनेंट प्लाज्मिड्स के 50−100 एनजी को पेश करें, धीरे-धीरे मिलाएं, और फिर 1 मिन के लिए तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें। 5 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में कोशिकाओं को पिघलाएं।
  6. कोमल झटकों के साथ 4−6 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर एलबी शोरबा और इनक्यूबेट के 500 माइक्रोन जोड़ें, और फिर 2 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 50 μg/mL kanamycin और 50 μ/mL रिफामपिसिन के साथ पूरक एलबी एगर मीडियम पर सभी एग्रोबैक्टीरिया कोशिकाओं को स्थानांतरित और फैलाएं।
    नोट: कॉलोनी पीसीआर द्वारा सकारात्मक क्लोन सत्यापित किया जा सकता है।
  7. कृषि घुसपैठ प्रयोगों के लिए एक ही रूप में बदली हुई कॉलोनी का उपयोग करें जब तक कि अन्यथा निर्देशित न हो।
    नोट: वर्तमान शोध में, परीक्षण किए गए प्रभावक जीनमें से कोई भी भविष्यवाणी किए गए इंट्रॉन शामिल नहीं है; प्रत्येक जीन सीधे फाइटोफथोरा सोजाए के जीनोमिक डीएनए से परिलक्षित होता था। बिना किसी टैग के गेटवे प्लांट एक्सप्रेशन वेक्टर की सिफारिश की जाती है, लेकिन जरूरी नहीं है।

2. एन बेंथमियाना 16c पौधों की तैयारी

  1. पॉटिंग मिट्टी घोला जा सकता है (मात्रा से) 50% पीट काई, 30% perlite, और 20% वर्मीक्यूलाइट, और 20% सिंदूर, और 20 min के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेव से मिलकर तैयार करें।
  2. ऑटोक्लेव मिट्टी को पौधे उर्वरक समाधान (1 ग्राम/एल) के साथ भिगोएं और उन्हें एक बड़ी ट्रे (540 मिमी x 285 मिमी x 60 मिमी) में संग्रहित छोटे बर्तनों (80 मिमी x 80 मिमी x 75 मिमी) में उप-पैकेज करें।
  3. प्रत्येक बर्तन की मिट्टी की सतह पर एन बेंथमियाना 16c के एक या दो बीज बोएं। ट्रे को प्लास्टिक के गुंबद से ढककर बीज ों को अंकुरित होने दें।
  4. ट्रे को प्रकाश और तापमान नियंत्रित विकास कक्षों के नीचे रखें, जिसका तापमान 23−25 डिग्री सेल्सियस, 50−60% सापेक्ष आर्द्रता, और एक लंबे दिन का फोटोपीरियड (14 घंटे हल्का/10 घंटे अंधेरा, 130−150μEm-2s-1)पर रोशनी के साथ।
  5. बीज अंकुरित होने के बाद प्लास्टिक गुंबद को बंद कर दें और अंकुरण चरण के लिए उपयोग की जाने वाली समान परिस्थितियों में रोपण को बढ़ने दें।
  6. पानी की एक उचित मात्रा में जोड़ें, मिट्टी नम रखते हुए, लेकिन भिगोने नहीं, हर 2−3 दिनों; आगे की वृद्धि को बढ़ावा देने के लिए हर 10 दिनों में उर्वरक जोड़ें। सामान्य परिस्थितियों में एन बेंथमियाना 16c पौधों को बनाए रखें जब तक कि वे उपयोग के लिए तैयार न हों; इस स्तर पर पौधे में कम से कम पांच पूरी तरह से विकसित सच्ची पत्तियां और कोई दिखाई देने वाली एक्सिलरी या फूल की कलियां नहीं होनी चाहिए, और पत्तियों में एक स्वस्थ हरी उपस्थिति होनी चाहिए)।
  7. स्थानीय आरएनए मुंह बंद करने के लिए एन बेंथमियाना 16c की 3−4 सप्ताह पुरानी पत्तियों का उपयोग करें, और प्रणालीगत आरएनए मुंह बंद करने के लिए युवा एन बेंथमियाना 16c पौधे (10−14 दिन पुराने) ।
    नोट: प्रयोगशालाओं में पौधों की वृद्धि की स्थिति और सुविधाएं भिन्न होती हैं; घुसपैठ के लिए स्वस्थ, अच्छी तरह से विकसित और पूरी तरह से विस्तारित पत्तियों का चयन करें।

3. घुसपैठ के लिए एग्रोबैक्टीरियम संस्कृति की तैयारी

  1. एलबी प्लेट से एक सकारात्मक कॉलोनी चुनें और कोशिकाओं को ग्लास ट्यूब में टीका लगाएं जिसमें 50 μg/mL kanamycin और 50 μg/mL रिफामपिसिन के साथ पूरक एलबी मीडियम के 5 मिलील होते हैं। 24−48 घंटे के लिए 200 आरपीएम पर मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बढ़ाएं।
  2. संस्कृति के 100 माइक्रोन को एक ही एंटीबायोटिक दवाओं, 10 एमएम 2-(एन-मॉर्फोलिनो) एथेनेसल्फोनिक एसिड (एमईएस; पीएच 5.6) और 20 माइक्रोएम एसीटोसिरिंगोन (एएस) के साथ पूरक एलबी मीडियम के 5 मिलील में स्थानांतरित करें। 16−20 घंटे के लिए 200 आरपीएम पर मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया बढ़ें।
  3. 10 000 x ग्राम पर 10 000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं। 10 मीटर एमजीसीएल2 बफर के 2 मिलील में पैलेट को बंद करें।
  4. एंटीबायोटिक दवाओं को पूरी तरह से हटाने सुनिश्चित करने के लिए चरण 3.3 दोहराएं।
  5. 600 एनएम (ओडी600)पर ऑप्टिकल घनत्व को मापकर एग्रोबैक्टीरियम संस्कृति के घनत्व का निर्धारण करें। 10 एमएम एमजीसीएल2 बफर के साथ 1.5−2.0 के ओडी600 में समायोजित करें।
  6. अंतिम निलंबन संस्कृतियों के लिए 10 mM एमईएस (पीएच 5.6) और 150 माइक्रोन जोड़ें और टी में कोशिकाओं को मिलाते हुए बिना कम से कम 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: अंतिम निलंबन संस्कृतियों रातोंरात मत छोड़ो ।

4. सह घुसपैठ एन बेंटमियाना छोड़ देता है

  1. 35S-ककड़ी मोज़ेक वायरस दमन 2बी (CMV2b), ख्यात प्रभावक, या खाली वेक्टर (ईवी) युक्त एग्रोबैक्टीरियम संस्कृति के बराबर मात्रा में 35S-GFP युक्त मिलाएं।
  2. ध्यान से और धीरे-धीरे एन बेंथमियाना 16सी पत्तियों के अक्षीय किनारों पर मिश्रित एग्रोबैक्टीरियम निलंबन में 1 मिलीग्राम सुईरहित सिरिंज का उपयोग करके घुसपैठ करें।
  3. नरम ऊतक वाइपर के साथ पत्तियों से शेष जीवाणु निलंबन को हटा दें और एक निर्माता कलम के साथ घुसपैठ पैच के मार्जिन सर्कल।
  4. इसी विकास की स्थिति में घुसपैठ वाले पौधों को ग्रोथ चैंबर में छोड़ दें।
    नोट: सुरक्षा और स्वास्थ्य कारणों के लिए, सुरक्षात्मक आंख काले चश्मे और घुसपैठ के दौरान एक मुखौटा पहना जाना चाहिए। क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए, दस्ताने को घुसपैठ के बीच इथेनॉल के साथ बदला या निष्फल किया जाना चाहिए। आम तौर पर घुसपैठ के लिए प्रति पत्ती एग्रोबैक्टीरियम निलंबन के कम से कम 1 एमएल की आवश्यकता होती है। प्रणालीगत मुंह बंद करने के लिए घुसपैठ के लिए कम से कम दो पत्तियों की जरूरत होगी।

5. जीएफपी इमेजिंग विश्लेषण

  1. नेत्रहीन पूरे पौधों की नई बड़ी पत्तियों में GFP फ्लोरेसेंस का पता लगाने 2 सप्ताह के बाद घुसपैठ (प्रणालीगत आरएनए चुप्पी के लिए) या पत्तियों के 3 −4 डीपीआई में घुसपैठ पत्तियों के संग्रह के बिना एक लंबी लहर पराबैंगनी (यूवी) दीपक का उपयोग कर ।
  2. तस्वीर दोनों यूवी और पीले फिल्टर के साथ लगे एक डिजिटल कैमरे के साथ पौधों और/या अलग पत्तियों एकत्र ।
    नोट: स्थानीय silencing दमन के परख के लिए, एन बेंथमियाना 16c पत्तियों के घुसपैठ पैच की जांच, जबकि प्रणालीगत टुकड़ा दमन गतिविधि के लिए, नव उगाया पत्तियों की जांच । आरएनए को दमन गतिविधि को अलग-अलग प्रभावकों में भिन्न कर सकते हैं। इसलिए, 3 डीपीआई से शुरू होने वाले कुछ दिनों में पैच या पत्तियों का निरीक्षण करें। क्रमशः सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में CMV2b और EV का उपयोग करें।

6. घुसपैठ पत्तियों में GFP mRNA स्तर के उत्तरी दाग विश्लेषण

  1. आरएनए अलगाव अभिकर्ता(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग करके पत्ती ऊतक से कुल आरएनए का अलगाव
    1. 4−7 डीपीआई पर घुसपैठ एन बेंथमियाना 16सी पैच से पत्ती के ऊतकों को इकट्ठा करें, तरल नाइट्रोजन में एक ठीक पाउडर में pulverize, और पाउडर को बाँझ 2 मिलील ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. आरएनए अलगाव अभिकर्ता (1 mL/100 मिलीग्राम ऊतक) तुरंत एक हुड में नमूना ट्यूब के लिए जोड़ें, जोरदार ढंग से समरूप करने के लिए हिला, और 5 मिन के लिए आरटी पर इनक्यूबेट ।
    3. एक हुड में प्रत्येक ट्यूब में क्लोरोफॉर्म (200 माइक्रोन/1 एल आरएनए आइसोलेशन रिएजेंट) जोड़ें, 15 एस के लिए सख्ती से हिलाएं, और 5 मिन के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए 12,000 x ग्राम पर होमोजेनेट करें।
    4. एक नई RNase मुक्त ट्यूब में supernatant हस्तांतरण और गोली त्यागें। सुपरनेटेंट में आइसोप्रोपेनॉल की 0.7 मात्रा जोड़ें, धीरे-धीरे कई बार उलटा करें, और 10 मिन के लिए आरटी पर मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
    5. आरएनए गोली को 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए 12,000 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा उपजी।
    6. अधिनायक को त्यागें, 70% इथेनॉल के साथ गोली धोएं, और एक हुड में गोली को हवा-सूखी करें। 10−20 मीटर के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में इनक्यूबेटिंग करके आहार पायरोकार्बोनेट (डीईपीसी) में आरएनए को भंग करें।
  2. घुसपैठ पत्तियों में GFP mRNA स्तर के उत्तरी दाग विश्लेषण
    1. बफर चलाने वाले 1x एमओपीएस में 1.2% फॉर्मलडिहाइड डेन्ट्यूरिंग अगारोज जेल तैयार करें।
    2. आरएनए 1:1 आरएनए लोडिंग रंग और 10 मिन के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन द्वारा प्रकृति के साथ मिलाएं, तुरंत 1 मिन के लिए बर्फ पर विकृत नमूनों को ठंडा करें।
    3. आरएनए अच्छी तरह से अलग होने तक 50 पंचम के लिए 100 वी पर जेल और इलेक्ट्रोफोरी ज़मीन पर नमूने लोड करें।
    4. फॉर्मलडिहाइड को हटाने और रात भर 20x एसएससी बफर में केशिका हस्तांतरण द्वारा नायलॉन झिल्ली में जेल स्थानांतरित करने के लिए 20x खारा-सोडियम साइटरेट (एसएससी) बफर में जेल कुल्ला। झिल्ली को 2x एसएससी में भिगोकर यूवी क्रॉस लिंकिंग के लिए गीली झिल्ली को उजागर करके झिल्ली में आरएनए को ठीक करें।
    5. संकरण बफर की उचित मात्रा (100 सेमी2 झिल्ली प्रति 10 0 0) जोड़ें; सामग्री की तालिका) एक संकरण ट्यूब में और एक संकरण ओवन में 60 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन।
    6. झिल्ली को संकरण ट्यूब में डाल दें और 60 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिन के लिए इनक्यूबेट करें। एक 5'DIG-लेबल डीएनए जांच (अंतिम एकाग्रता, 50 एनजी/mL) को संकरण समाधान में पतला करें जिसमें पूर्वगामी संकरण बफर हो।
    7. प्रीहाइब्रिडाइजेशन बफर को त्यागें और तुरंत डीआईजी-लेबल वाली जांच वाले पूर्व-गरम संकरण समाधान से बदलें। कोमल आंदोलन के साथ रात भर 60 डिग्री सेल्सियस पर जांच के साथ दाग इनक्यूबेट करें।
    8. संकरण के बाद, झिल्ली को 20 डिग्री सेल्सियस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ती स्ट्रिंग के बफ़र्स में दो बार धोएं। अतिरिक्त वाशिंग बफर को हटाने के लिए झिल्ली को धीरे से पोंछें और केमिल्यूमिनेसेंट संकरण और डिटेक्शन किट(सामग्री की तालिका)में सुझाए गए एजेंटों को जोड़ें।
    9. इमेजिंग सिस्टम के साथ संयुक्त केमिल्यूमिनेसेंट प्रतिक्रिया द्वारा संसंकरित संकेतों का पता लगाएं।

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Representative Results

ऊपर, हम पी सोजा ई आरएक्सएलआर प्रभावकों की आरएसएस गतिविधि का आकलन करने के लिए बेहतर स्क्रीनिंग परख के लिए कदम-दर-कदम प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। कुल मिलाकर, प्रयोग में 5−6 सप्ताह लगते हैं। बाद में, परख द्वारा पहचाने गए आरएसएसएस को कार्य और आणविक तंत्र के संदर्भ में और अधिक विशेषता दी जा सकती है। हमारे दृष्टिकोण के उदाहरण के रूप में, हमने आरएनए के पी सोजा ईआरएक्सएलआर इफेक्टो फाइटोफ्थोरा दमनकारी का उपयोग किया, जिसे संक्रमण के दौरान हौस्टोरिया के माध्यम से मेजबान कोशिकाओं में स्रावित और वितरित किया जाता है।

इस बात की पुष्टि करने के लिए कि PSR1 में आरएसएस की गतिविधि है और इस प्रकार इस विधि के लिए उपयुक्त है, प्रत्येक रूपांतरित एग्रोबैक्टीरियम तनाव को 35S-GFP को शरण देने वाले तनाव के साथ मिलाया गया था और एन बेंथमियाना 16c की पत्तियों में घुसपैठ की गई थी। EV और CMV2b क्रमशः नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया(चित्रा 1)। जीएफपी अभिव्यक्ति 2−3 डीपीआई पर सभी मिश्रणों के साथ घुसपैठ पत्तियों में उच्चतम स्तर पर पहुंच गई। ग्रीन फ्लोरेसेंस तीव्रता पैच में मजबूत बनी रही, जिसमें 35S-GFP प्लस CMV2b के साथ 6−9 दिन की प्रेक्षण की अवधि के दौरान21। पीएसआर 1 के साथ जीएफपी की सह-घुसपैठ के परिणामस्वरूप 3.5−4.5 दिन की टिप्पणियों के दौरान मजबूत जीएफपी फ्लोरेसेंस भी हुआ, जैसा कि घुसपैठ वाले पैच में ऊंचा फ्लोरेसेंस द्वारा प्रदर्शित किया गया था। हालांकि, पैच में फ्लोरेसेंस तीव्रता 35S-GFP और EV के साथ घुसपैठ 3 डीपीआई पर कमजोर हो गई । 4−5 डीपीआई पर, GFP फ्लोरेसेंस शायद ही पता लगाने योग्य था(चित्रा 1)।

उत्तरी दाग से पता चला है कि GFP mRNA 35S-GFP प्लस 35S-CMV2b या 35S-GFP प्लस 35S-PSR1 व्यक्त पत्तियों की तुलना में 35S-GFP प्लस EV(चित्रा 2)व्यक्त पत्तियों में उच्च संचित । इस प्रकार, पीएसआर 1 की प्रतिलेखन अभिव्यक्ति के साथ-साथ CMV2b ने जीएफपी एमआरएनए के स्थिरीकरण में योगदान दिया, जिसके परिणामस्वरूप जीएफपी फ्लोरेसेंस ऊंचा हुआ।

हमने 2 सप्ताह पुराने एन बेंथमियाना 16सी रोपण की पत्तियों में मुंह बंद संकेत के प्रसार का मूल्यांकन करने के लिए कृषि घुसपैठ की परख का भी इस्तेमाल किया । इस उद्देश्य के लिए, हमने आमतौर पर पूरी पत्तियों के इंजेक्शन के लिए 3−4 बड़ी पत्तियों का चयन किया। 14 डीपीआई में, 98% से अधिक ईवी ने प्रणालीगत पत्तियों में स्पष्ट रूप से कोई जीएफपी सिग्नलिंग प्रदर्शित नहीं किया, जबकि पीएसआर 1 और सीएमवी2बी दोनों ने सह-घुसपैठ वाले पौधों के लगभग 80% में जीएफपी फ्लोरेसेंस को देखकर सिहरन संकेत के प्रणालीगत प्रसार को कुशलतापूर्वक बाधित किया, और शेष 20% घुसपैठ वाले पौधों में केवल कुछ लाल नसें उभरी(चित्र 3)उभरी पत्तियों (चित्र 3) में दिखाई दीं।

Figure 1
चित्रा 1: फाइटोफथोरा सोजाई आरएक्सएलआर प्रभावक PSR1 निकोतियाना बेंथमियाना (एन बेंटमियाना)16c पौधों में स्थानीय आरएनए को दबाता है। 3−4 सप्ताह पुराने एन बेंथमियाना 16सी पौधों (बाएं पैनल) की पूरी तरह से विकसित पत्तियों को 35S-GFP और प्रत्येक छवि के ऊपर इंगित निर्माण ले जाने वाले एग्रोबैक्टीरियम मिश्रण ों के साथ पैच में सह-घुसपैठ की गई थी। घुसपैठ क्षेत्र के GFP फ्लोरेसेंस प्राकृतिक प्रकाश (मध्य पैनल) और 4 डीपीआई पर लंबी लहर यूवी लाइट (दाएं पैनल) के तहत चित्रित किया गया था । प्रयोग इसी तरह के परिणामों के साथ दो बार दोहराया गया था । लाल तीर घुसपैठ की पत्तियों का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: घुसपैठ एन बेंटमिना 16c पत्तियों में GFP mRNA का संचय । सीके और ईवी एन बेंथमियाना 16c का प्रतिनिधित्व अकेले छोड़ देता है और 16c 35S-GFP प्लस EV के साथ सह-घुसपैठ छोड़ देता है । EV और CMV2b से नमूनों को क्रमशः नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, RRNA एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: पी सोजाई आरएक्सएलआर प्रभावक PSR1 एन बेंथमियाना 16c पौधों में प्रणालीगत आरएनए को दबाता है। 2 सप्ताह पुराने एन बेंटमियाना 16c रोपण (बाएं पैनल) की तीन या चार पत्तियों को 35S-GFP और या तो EV या वेक्टर 35S प्रमोटर से PSR1 या CMV2b व्यक्त एग्रोबैक्टीरियम द्वारा सह-घुसपैठ की गई थी । 14 डीपीआई में प्राकृतिक प्रकाश (ऊपरी पैनल) और लंबी लहर यूवी लाइट (निचले पैनल) के तहत नए विकसित पत्तियों की जीएफपी फ्लोरेसेंस को चित्रित किया गया था। यह प्रयोग इसी तरह के परिणामों के साथ दो बार दोहराया गया था । लाल तीर घुसपैठ पत्तियों का संकेत दिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

आरएनए मुंह एक प्रमुख रक्षा पौधों द्वारा नियोजित तंत्र है जो वायरल, बैक्टीरियल, ऊमाइसेट और फंगल रोगजनकों का मुकाबला करने के लिए है। बदले में, ये रोगाणु एंटीवायरल मुंह का प्रतिकार करने के लिए दमनकारी प्रोटीन को मुंह में ले गए हैं, और ये आरएसएसएस आरएनए मुंह मार्ग22,23के विभिन्न चरणों में हस्तक्षेप करते हैं। आरएसएसएस10की पहचान करने के लिए कई स्क्रीनिंग परखें विकसित की गई हैं ।

यहां, हम मेजबान में आरएनए को दबाने की क्षमता के लिए संक्रमण पर मेजबान कोशिका में पी सोजा द्वारा स्रावित प्रभावक प्रोटीन स्क्रीनिंग के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह संशोधित परख एक वायरल सह घुसपैठ परख पर आधारित है, लेकिन कई महत्वपूर्ण तरीकों से अलग है । सबसे पहले, बैक्टीरिया और एन बेंथमियाना 16सी पौधों दोनों जोरदार और स्वस्थ होना चाहिए; यह बैक्टीरिया से प्रभावकों की स्थिर अभिव्यक्ति के लिए बहुत महत्वपूर्ण है और पूरी तरह से विकसित एन बेंथमियाना 16सी का उपयोग प्रयोगात्मक प्रजनन क्षमता और विश्वसनीयता सुनिश्चित करता है। हम अक्सर वनस्पति विकास के स्तर पर प्रति पौधे केवल दो या तीन पूरी तरह से विकसित पत्तियों का उपयोग करते हैं, पुरानी और नई उभरी पत्तियां अनुपयुक्त होती हैं। दूसरे, बैक्टीरियल संस्कृति के ओडी600 को इष्टतम मूल्य में समायोजित किया जाना चाहिए, आमतौर पर एग्रोबैक्टीरियमके लिए 0.75−1.0। एक कम ओडी600 (यहां तक कि 0.2 के रूप में कम) वीवीआर स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन पीएसआर24नहीं। तीसरा, प्रत्येक प्रभावक के लिए हरी फ्लोरेसेंस की जांच करने के लिए आदर्श समय बिंदु को अनुकूलित किया जाना चाहिए। वायरस में, जीएफपी प्लस ख्यात वीआरएस युक्त संस्कृतियों के साथ सह-इंजेक्शन छोड़ देता है 3 डीपीआई में घुसपैठ क्षेत्र में हरे रंग की फ्लोरेसेंस में उल्लेखनीय वृद्धि का प्रदर्शन करता है, और सिग्नल 9 डीपीआई22तक उच्च रहता है, लेकिन यह केवल हमारे वर्तमान अध्ययन में पीएसआरएस के लिए 4 या 5 डीपीआई पर प्रदर्शित किया गया था। इसलिए, जीएफपी एमआरएनए के संचय की मात्रा निर्धारित करके आरएनए को और अधिक पुष्टि करना भी महत्वपूर्ण है। अंत में, उचित नियंत्रण का उपयोग करना आवश्यक है। वीआरएस हमेशा प्रभावक प्रोटीन की पहचान करने के लिए आदर्श सकारात्मक नियंत्रण नहीं होते हैं क्योंकि इन प्रोटीनों में पीएसआरएस की तुलना में बहुत मजबूत दमनकारी गतिविधि होती है। इसके परिणामस्वरूप आरएनए के कमजोर दमनका पता लगाने में विफलता हो सकती है।

इस रिपोर्ट में, हम फाइटोफथोरा और पुक्सिनिया ग्रामीण रोगजनकों में आरएनए के दमन के लिए स्क्रीन करने के लिए हमारे संशोधित परख के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं। इस प्रकार, हमारी विधि संभावित प्रभावकों की विशेषता के लिए एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करती है जो आरएसएसएस को एन्कोड करती है, जो छोटे आरएनए संचय15,16,17को बाधित करके रोग संवेदनशीलता को बढ़ावा देती है। इसलिए, हमारा मानना है कि हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग मोटे तौर पर पौधे रोगजनकों द्वारा स्रावित प्रभावकों को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। भविष्य के काम अन्य रोगजनकों में अधिक RSSs की पहचान करने पर ध्यान केंद्रित करेंगे, और रोगाणुओं पर हमला करने के खिलाफ संयंत्र रक्षा में आरएनए चुप्पी की भूमिका को स्पष्ट करने पर ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को शंघाई शिक्षा विकास फाउंडेशन और शंघाई म्यूनिसिपल एजुकेशन कमिशन के "शुगुआंग कार्यक्रम" से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम ( 2018YFD0201500), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 31571696 और 31660510), चीन के युवा पेशेवरों के लिए हजार प्रतिभा कार्यक्रम, और शंघाई नगर पालिका के विज्ञान और प्रौद्योगिकी आयोग (18DZ2260500) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) Biofroxx 1086GR500 Buffer
2xTaq Master Mix Vazyme Biotech P112-AA PCR
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) Amresco 0264C507-1KG MOPS Buffer
Acetosyringone (AS) Sigma-Aldrich D134406-5G Induction of Agrobacterium
Agar Sigma-Aldrich A1296-1KG LB medium
Agarose Biofroxx 1110GR100 Electrophoresis
Amersham Hybond -N+ GE Healthcare RPN303 B Nothern blot
Amersham Imager GE Healthcare Amersham Imager 600 Image
Bacto Tryptone BD Biosciences 211705 LB medium
Bacto Yeast Extraction BD Biosciences 212750 LB medium
Camera Nikon D5100 Photography
ChemiDoc MP Imaging System Bio-Rad
Chemiluminescent detection module component of dafa kits Thermo Fisher Scientific 89880 Luminescence detection
Chloramphenicol Amresco 0230-100G Antibiotics
ClonExpress II One Step Cloning Kit Vazyme Biotech C112-01 Ligation
DIG Easy Hyb Sigma-Aldrich 11603558001 Hybridization buffer
Easypure Plasmid Miniprep kit TransGen Biotech EM101-02 Plasmid Extraction
EasyPure Quick Gel Extraction Kit TransGen Biotech EG101-02 Gel Extraction
EDTA disodium salt dihydrate Amresco/VWR 0105-1KG MOPS Buffer
Electrophoresis Power Supply LiuYi DYY6D Nucleic acid electrophoresis.
FastDigest EcoRV Thermo Fisher Scientific FD0304 Vector digestion
Gel Image System Tanon Tanon3500 Image
Gentamycin Amresco 0304-5G Antibiotics
Kanamycin Sulfate Sigma-Aldrich K1914 Antibiotics
LR Clonase II enzyme Invitrogen 11791020 LR reaction
Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um GE Healthcare 10600002 Northern
NORTH2south biotin random prime dna labeling kit Thermo Fisher Scientific 17075 Biotin labeling
PCR Thermal Cyclers Bio-Rad T100 PCR
Peat moss PINDSTRUP Dark Gold + clay Plants
Peters Water-Soluble Fertilizer ICE Peter Professional 20-20-20 Fertilizer
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase Vazyme Biotech P505-d1 Enzyme
Rifampicin MP Biomedicals 219549005 Antibiotics
RNA Gel Loading Dye (2X) Thermo Fisher Scientific R0641 RNA Gel Loading Dye
Sodium Acetate Hydrate Amresco/VWR 0530-1KG MOPS Buffer
Sodium Chloride Amresco 0241-10KG LB medium
Tri-Sodium citrate Amresco 0101-1KG SSC Buffer
Trizol Reagent Invitrogen 15596018 RNA isolation reagent
UV lamp Analytik Jena UVP B-100AP Observation
UVP Hybrilinker Oven Analytik Jena OV2000 Northern

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References

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