Lokalisierte RNAi und ektopische Genexpression in der Blutegel

Biology

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Summary

In diesem Video zeigen wir ein Verfahren für eine genaue biolistischen Lieferung von Reagenzien in lebendes Gewebe mit einem neuartigen Mini-Gen-Kanone. Wir sind umzuwerfen der Ausdruck der Axon Führung Molekül Netrin in Blutegel Embryonen durch die Bereitstellung Moleküle dsRNA in der ventralen Körperwand und Ganglien der einzelnen Segmente.

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Shefi, O., Simonnet, C., Groisman, A., Macagno, E. R. Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech. J. Vis. Exp. (14), e697, doi:10.3791/697 (2008).

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Abstract

In diesem Video zeigen wir die Verwendung eines pneumatischen Kapillare Waffe für die genaue biolistischen Lieferung von Reagenzien in lebendem Gewebe. Wir nutzen das Verfahren zur stören Genexpressionsmuster in ausgewählten Segmenten des Blutegel Embryonen, so dass die unbehandelten Segmenten als interne Kontrollen.

Die pneumatische Kapillare Waffe kann zur inneren Schichten von Zellen in einem frühen Stadium der Entwicklung erreicht, ohne Öffnung der Probe sein. Als Verfahren zur lokalisierten Einbringen von Stoffen in lebenden Geweben, die biolistischen Lieferung mit der Pistole mehrere Vorteile: Sie ist schnell, berührungslos und zerstörungsfrei. Darüber hinaus kann eine einzelne Kapillare Pistole für unabhängige Lieferung von verschiedenen Substanzen verwendet werden. Die Lieferung einer Region kann auch lateralen Abmessungen von ca. 50-150 um und erstreckt sich über ca. 15 um rund um die mittlere Eindringtiefe, die zwischen 0 und 50 um liegt. Diese Auslieferung hat den Vorteil, dass in der Lage, eine begrenzte Anzahl von Zellen in einem ausgewählten Ort der Mitte zwischen einzelnen Zelle knock down durch Mikroinjektion und systemische Knockdown durch extrazelluläre Injektionen oder durch genetische Ansätze Ziel.

Für umzuwerfen oder Klopfen in der Expression des Axons Führung Molekül Netrin, die natürlich von einigen zentralen Neuronen und in der ventralen Körperwand zum Ausdruck kommt, nicht aber die dorsale Domäne, liefern wir Moleküle dsRNA oder Plasmid-DNA in den Körper Wand-und zentralen Ganglien. Dieses Verfahren umfasst folgende Schritte: (i) Vorbereitung der Versuchsaufbau für einen spezifischen Assay (Anpassung der Beschleunigung Druck), (ii) die Beschichtung der Partikel mit Molekülen der dsRNA oder DNA, (iii) das Laden der beschichteten Partikel in die Pistole, bis zu zwei Reagenzien in einem Test, (iv) die Vorbereitung der Tiere für die Partikel-Lieferung, (v) Lieferung von beschichteten Partikel in das Zielgewebe (Körper Wand oder Ganglien), und (vi) die Verarbeitung der Embryonen (Immunfärbung, Immunhistochemie und neuronalen Kennzeichnung), um die Ergebnisse zu visualisieren, in der Regel 2 bis 3 Tage nach der Lieferung.

Wenn die Teilchen mit Netrin dsRNA beschichtet waren, verursachten sie deutlich sichtbar knock-down von Netrin Ausdruck, der nur in Zellen mit Teilchen (in der Regel, 1-2 Partikel pro Zelle) aufgetreten ist. Partikel mit einem Plasmid kodiert EGFP Fluoreszenz in neuronalen Zellen, wenn sie in ihrem Kern nicht mehr beschichtet.

Protocol

Partikel können mit verschiedenen Reagenzien, wie dsRNA Moleküle, DNA-Plasmiden oder Farbstoffe aufgebracht werden. Die Art und Durchmesser der Teilchen nach dem Reagenz und die Tiefe der Zielzellen in das Gewebe gewählt: größere Partikel dringen weiter, können aber eine Schädigung des Gewebes führen.

1. Vorbereitung der dsRNA beschichteten Partikel

  1. Legen Sie 100% Isopropanol auf Eis.
  2. Resuspendieren 5 mg Goldpartikel (S1600ri, Seashell Technology, LLC, mittleren Durchmesser 1,6 um) in 100 ml Bindungspuffer. Als Lösung bereit ist, mit dem nächsten Schritt fortfahren.
  3. Verdünnen Sie die Partikel-Lösung durch Zugabe von 100 ul Bindungspuffer, kurz vortexen und beschallen für 1-2 min zu vermeiden, zu verklumpen.
  4. Add 5-10 ug von dsRNA / siRNA (dsRNAs / siRNA sollte in Wasser auf eine Konzentration von ~ 1μg/μl aufgelöst werden).
  5. Vortex und lassen bei Raumtemperatur für 2 min. Diese Konzentration und Zeitintervall Ergebnis in siRNA gesättigten Goldpartikel.
  6. Pellet der siRNA / Goldpartikel Komplexe durch Zentrifugation bei ~ 2.500 upm in einer Tischzentrifuge für ~ 15 sek.
  7. Entfernen Sie den Überstand und sanft add 750 ml kaltem Isopropanol mit minimaler Unterbrechung des Pellets. Spin kurz und entfernen Sie den Überstand.
  8. Resuspendieren Goldpartikel in 100 ul kaltem 100% Isopropanol, dann kurz beschallen in einem Ultraschallbad (2-3 Pulse) zu brechen Partikelagglomerate. Last, gießen Sie die Schwebeteilchen auf einen Objektträger aus Glas und lassen Sie sie bei Raumtemperatur trocknen.

2. Vorbereiten des Versuchsaufbaus für einen bestimmten Test

  1. Jede Waffe hat eine andere Düsenöffnung Durchmesser reicht von einem Minimum von ~ 50 um bis zu ~ 3mm. Die spezifische, für die Waffe verwendet werden soll daher nach dem Gebiet des Tissue gezielt gewählt.
  2. Die He-Druck ist für die Tiefe in das Gewebe der Zielzellen angepasst, in der Regel bis zu ~ 100 um (höhere Drücke können die Teilchen tiefer zu liefern). Der Abstand zwischen dem Embryo und die Spitze der Düse wirkt sich auch auf die Eindringtiefe, wie Goldpartikel lockeren Schwung in der Luft.

3. Laden der Waffe mit der Pre-beschichtete Partikel

Partikel sollten als trockenes Pulver in die Tygon-Schlauch Partikelinjektion Linien verbunden, um die vielfältigen geladen werden. Diese Schläuche, die in einer trockenen Atmosphäre bei 4 gehalten werden sollte ° C, wenn nicht in Gebrauch ist, kann in weiteren Experimenten mit dem gleichen Reagenzien wieder verwendet werden. Unser Versuchsaufbau kann bis zu zwei verschiedenen Reagenzien pro Test durch separate Ports im Verteiler.

  1. Kratzen Sie die getrockneten beschichteten Partikel aus dem Glasträger mit der Kante eines Deckglas oder einer Rasierklinge vor dem Einlegen in die Tygon-Schlauch Linie. Dieser Tygon-Schlauch wird nur für diesen Reagenz, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
  2. Wie Sie die Partikel zu laden, beugen Sie den Schlauch in eine U-Form in der Nähe der Stecker, um die Partikel Ausbreitung entlang der gesamten Schlauch und konzentrierte sich in der Nähe der Anschluss zu halten. Pick-up die Partikel mit einem kleinen Spatel oder einem Stück gefaltet wiegen Papier, und legen etwa die Hälfte davon in den Schlauch für jede Serie von Embryonen. Tippen Sie auf den Schlauch während der Beladung Schritt, um die Partikel gleichmäßig verteilt.

4. Tierische Vorbereitung

Vor und nach der Goldpartikel Lieferung, werden die Embryonen in sterile künstlichen Teich Wasser bei Raumtemperatur aufbewahrt.

  1. Legen Sie die Embryonen, Bauchseite nach oben in eine Nut in eine flache, 5mm-dickes Stück aus Silikon-Kautschuk (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) geschnitzt und betäuben sie in eine Lösung von 8% Ethanol in sterile künstlichen Teich Wasser ( jüngeren Embryonen in den Stadien E6-E8 kann in künstlichen Teich Wasser ohne Ethanol während des gesamten Experiments bleiben).
  2. Unmittelbar vor der Aufnahme der Partikel niedriger der Badspiegel der ventralen Oberfläche des Embryos, indem ein Teil der Lösung aufzudecken. Legen Sie ein Stück Seidenpapier mit einem kleinen Loch in der Mitte oben drauf geschnitten, um es zu stabilisieren und die Oberfläche vor dem Austrocknen bewahren.

5. Lieferung von beschichteten Partikel in das Zielgewebe

Eine Belastung der Partikel können in der Regel für bis zu zehn Aufnahmen verwendet werden, mit einem einzigen Schuss in der Regel liefert der Größenordnung von ein paar hundert Partikel.

  1. Generieren Sie einen Schuss durch das Öffnen eines der Ventile für 0,3 s, so dass die Injektion eines Bolus von Partikeln aus der entsprechenden Rohrleitung in die Pistole.
  2. Tippen Sie den Schlauch vorsichtig zwischen den Aufnahmen, um Partikel aus dem Schlauch Wand lösen und erleichtern somit die Injektion in die He-Strom der Waffe.
  3. Zur Abdeckung der Fläche von Gewebe von Interesse, können mehrere Schüsse erforderlich sein.
  4. Nach der Partikel Lieferung, statt die Embryonen wieder in künstlichen Teich Wasser, vorzugsweise ein Embryo pro Well in einer Multi-Well-Platte.

6. ImmunoFärbung und neuronalen Kennzeichnung

Halten Sie die Embryonen bei Raumtemperatur und in Dunkelheit für 1 bis 3 Tage nach der Partikel Lieferung bis RNAi (oder ektopische Expression) ist erreicht. Wir führen Sie dann eine der folgenden Verfahren auf der experimentellen Proben und Kontrollen:

  1. In-situ-Hybridisierung zum Testen auf das Vorhandensein oder Fehlen von Netrin mRNA. Digoxigenin-markierten Blutegel Netrin Ribosonden sind ganze Blutegel Embryonen hybridisiert.
  2. Immunzytochemie zum Testen auf Netrin und anderen Proteinen, die einzigartig für neuronales Gewebe (wie z. B. Anti acetyliertes Tubulin) sind. Das Verfahren ist auch auf ganze-mount Embryonen durchgeführt.
  3. Mikroinjektionen lipophiler Farbstoffe (DII und DIO) in einzelnen Neuronen, für Farbstoff-füllt den kompletten Lauben der Neuronen von Interesse (mechanosensorischen Druck Neuronen in unserem Fall) in Behandlungs-und Kontrollgruppe Segmente Etikett. Dieser Assay basiert auf Live-Embryonen (intakt oder seziert) durchgeführt.

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Discussion

In dieser Demonstration, verwendeten wir die pneumatische Kapillare Pistole an Goldpartikel in Zellen liefern in kleinen lokalisierten Volumen von einer Live-leech Embryo bis zum Knock-in und knock-down-Gene. Die Zielregion der Regel einen Durchmesser von ~ 150 um und Partikel gefunden wurden ~ 15 um rund um die mittlere Eindringtiefe, die zwischen 0 und 50 um. Wenn die Teilchen mit dsRNA Moleküle des Axons Führung Faktor Netrin beschichtet waren, verursachten sie deutlich sichtbar knock-down von Netrin Ausdruck, der nur in Zellen mit Partikeln aufgetreten. Partikel mit einem Plasmid kodiert GFP Fluoreszenz in neuronalen Zellen, wenn sie in ihrem Kern nicht mehr beschichtet.

Wir haben Ihnen gezeigt, wie die pneumatische Kapillare Pistole gibt die Technik der biolistischen Lieferung eine neue Funktion, um mikroskopische Bereiche eines Gewebes in drei Dimensionen beschränkt und zielgerichtete mit hoher Präzision Ziel, ohne nachweisbare Schädigung des Gewebes.

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Acknowledgements

Wir möchten Dr. Michael Baker für seine Hilfe danken Erzeugung Konstrukte für die Gen-knock-in und für die Bereitstellung der Zeitraffer-Filme wachsender sensorischen Projektionen. Wir möchten auch Virginia Vandelinder für technische Hilfe mit dem Luftgewehr Experimente danken.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
gold particles Other Seashell Technology, LLC S1600ri
binding buffer Reagent Seashell Technology, LLC
silicone rubber Reagent Dow Corning Sylgard 184

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References

  1. Baker, M. W., Macagno, E. R. RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse. Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).
  2. Baker, M. W., Macagno, E. R. Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression. Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).
  3. Gan, W. B., et al. Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets. Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).
  4. Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. Rational design of a super core promoter that enhances gene expression. Nature Methods. 3, 917-922 (2006).
  5. Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles. Applied Physics Letters. 87, 014103- (2005).
  6. Shefi, O., Simonnet, C., Baker, M. W., Glass, J. R., Macagno, E. R. Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience. 26, 6119-6123 (2006).

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