Хроматин Пробирной по правам ткани мозга

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

До недавнего времени выражение исследования человеческого мозга были ограничены количественного РНК или белка. С хроматин иммунопреципитации методы описаны в этой статье, можно будет сопоставить гистонов метилирование и других эпигенетических регуляторов экспрессии генов в посмертных мозг.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Matevossian, A., Akbarian, S. A Chromatin Assay for Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (13), e717, doi:10.3791/717 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Хронический психоневрологических заболеваний, таких как шизофрения, биполярное заболевание и аутизмом, как полагают, является результатом сочетания генетических и экологических факторов, которые могут привести к эпигенетических изменений экспрессии генов и других молекулярных патологии. Традиционно, однако, выражение исследований в посмертных мозга были приурочены к количественной оценке мРНК или белка. Ограничения встречаются в посмертных исследований мозга, такие как изменчивость в аутолиза времени и ткани целостностей также возможных последствий любого исследования высшей структуры хроматина порядке. Тем не менее, нуклеосомной организации геномной ДНК, включая ДНК: основные гистонов обязательным - как представляется, в значительной степени сохранились в репрезентативных выборок, предоставляемых различными банками мозга. Таким образом, можно изучать метилирования и другие ковалентные модификации гистонов ядро ​​в определенные геномных локусов в посмертных мозг. Здесь мы приведем упрощенную родной хроматин иммунопреципитации (NChIP) протокол для замороженных (никогда не фиксированной) образцы человеческого мозга. Начиная с микрококковой нуклеазы пищеварения мозга гомогенатов NChIP следуют КПЦР может быть завершена в течение трех дней. Методология, представленная здесь, должно быть полезным для выяснения эпигенетические механизмы экспрессии генов в нормальных и больных человеческого мозга.

Protocol

Порядок действий:

1-й день

1. Однородный 50-500 мг замороженных посмертного серое вещество ткани с Douncing буфера.

! ВНИМАНИЕ -! Правам ткани должны быть обработаны с осторожностью, под строгим условиям безопасности. Обращайтесь в BSL-2 или более высоким стандартам безопасности.

  1. Возьмите ранее рассеченные, посмертные мозг от -80 ° C, Dounce их в 5 раз объем мозга Douncing буфера, и место в трубку 2,0 микроцентрифужных мл. Согласованные образца и контроля пар обрабатываются одновременно.

2. Микрококковой нуклеазой (MN) Пищеварение

  1. Добавить 5U/mL из микрококковой нуклеазы к образцу и смешивать в растворе с помощью пипетки вверх и вниз перед размещением на льду.
    * Важный шаг - Важно сделать этот шаг, быстро, поскольку MN имеет способность действовать на еще 4 ° C.
  2. Инкубируйте образцы в течение 7 минут при температуре 37 ° C.
  3. После 7 минут инкубации, добавляют 0,5 М ЭДТА до концентрации 10 мМ, чтобы остановить MNase деятельности.

3. Hypotonisation

  1. Место образцов в 15 мл трубки сокола. Добавить 10X образца объемом 0,2 ЭДТА, 1 / 2000 объем пробы 0,2 М benzamidine и 1 / 1000 образцов объемом phenylmethanesulphonylfluoride 0,1 М (PMSF). Последние два соединения используются в качестве ингибиторов протеазы.
    * Важный шаг - Важно сохранить образцы на льду во время всех этих шагов.
  2. Инкубируйте образца на 1 час, в то время вортексе его каждые 10 минут.
  3. В конце часовой инкубации, добавить 1 / 2000 объема образца 3М DTT, еще один ингибитор протеазы.
  4. Vortex образец еще раз и центрифуге при 3175 RCF в течение 10 минут при 4 ° C.
    * Факультативный шаг - Precleansing с Protein G агарозы.
    1. Возьмите супернатант и поставить в новый 15 мл трубки сокола.
    2. Добавить 500 мкл белка G агарозы.
    3. Поворот при комнатной температуре в течение 30 мин.
    4. Центрифуга при 4000 оборотов в минуту в течение 10 мин при 4 ° C.
  5. Распространение супернатант, так что 500 мкл используются в качестве входного контроля (содержащие только геномной ДНК), а остальное разделить на две пробирки, содержащие 1600 мкл образца каждого, - которые для иммунопреципитации хроматина (чип) образцов.
  6. Входной контроль находится при температуре -80 ° CO / N до последующего использования.
  7. Для ChIP образцов - добавить 1:10 Объем 10XFSB и 4μg антител, то вихрь образцов и поворачивать их при температуре 4 ° С в течение ночи.
    ! ВНИМАНИЕ -! Количество и разведение антител может потребовать оптимизации.

2-го дня

! ВНИМАНИЕ! - Начало 2-й день, если мыться Protein G агарозы, который будет использоваться для изоляции нуклеосомной ДНК. С агарозном бисер очень чувствительны, надо отрезать глав советов, когда любой пипетки раствор, содержащий агарозном бисером.

1. Зондирование Protein G агарозном Бусины с ДНК

  1. Добавить 1,6 мл 1XFSB до 245 мкл белка G-агарозы (достаточно для 4 труб) в 2 мл микроцентрифужных трубы (петли).
  2. Отдельное решение на две 2 мл труб и пополнить каждая до 1,6 мл с 1X ФСБ.
  3. Поворот при комнатной температуре в течение 30 сек и центрифуги на 0,1 RCF на 30 сек.
  4. Удалить супернатант использованием вакуума.
  5. Добавить 1,6 мл 1X ФСБ еще раз. Поворот образцов в течение 30 секунд, а затем центрифуги на 0,1 RCF на 30 сек.
  6. Удалить супернатант еще раз, и объединить обе трубы с 1,5 мл 1XFSB.
  7. Добавьте 15 мкл ультразвуком ДНК спермы лосося (10mg/mL).
    ! ВНИМАНИЕ -! Этот шаг должен, в принципе, уменьшить неспецифическое связывание иммунопреципитации с бисером. Однако это также может привести к ложным положительным результатам для некоторых (человека) последовательностей ДНК.
  8. Поворот при комнатной температуре в течение 30 мин, затем центрифуги на 0,1 RCF на 30 сек.
  9. Удалить супернатант. Добавить 200 мкл 1XFSB.
  10. Добавить 90 мкл из бисера агарозы в каждый чип образца. Поворот при 4 ° С в течение 1 часа.
  11. Добавить 1 мл 1XFSB в оставшиеся бисером агарозы в качестве отрицательного контроля и вращаются на 4 ° С в течение 1 часа.
  12. После часовой инкубации, центрифуги образцов и отрицательного контроля на уровне 0,1 RCF на 30 сек. Удалите супернатант.

2. Стиральная бисер

! ВНИМАНИЕ! - Стиральная буферы должны храниться при температуре 4 ° С до использования, и будут использоваться только в том случае меньше, чем месяц назад.

  1. Добавить 1 мл каждого мытья решение бисером и вращаться в течение 3 мин при комнатной температуре.
  2. Центрифуга на 0,1 RCF на 30 сек.
  3. Удалите надосадочную использованием вакуума.

* Каждый моющего раствора

- Низкий буфер мытье соли

- Высокая буфера стиральной соли - Раствор Хлорид лития - только вращаться при комнатной температуре в течение 1 минуты!

- TE буфера (10 мМ Tris, 1 мМ ЭДТА рН = 8)

3. Элюирование

* Важный шаг - Сделать свежие буфера элюции для каждого эксперимента на день она будет использоваться.

  1. Добавьте 250 мкл свежеприготовленного элюции буфера каждого образца.
  2. Поворот на 15 минут при комнатной температуре, а затем центрифуги в 0,4 RCF в течение 1 мин.
  3. Сохранить супернатант в микроцентрифужных 2,0 мл трубки (Loop).
  4. Добавьте 250 мкл буфера для элюции каждого образца и вихревые вручную в течение нескольких секунд. Затем вихрь образцов в течение 15 минут на mulitvortexer.
  5. Центрифуга на 16 оборотов в минуту RCF в течение 4 минут и сохранить супернатант в том же 2,0 мл трубки (Loop).

4. Дайджест белка

  1. Добавьте 10 мкл 0,5 М ЭДТА, 25 мкл 0.8M Tris-HCl, рН 6,5, 10 мг / мл протеиназы К (1 / 200 проба), чтобы каждый чип образца.
  2. Для каждого входного контроля, добавить буфер для лизиса протеиназы К пищеварения (1 / 10 образца буфера) и 10mg/ml протеиназы К (1 / 200 образца буфера).
  3. Инкубируйте Входные и ChIP образцов в 52 ° С в течение 3 часов.

5. Фенол / хлороформ добычи

! ВНИМАНИЕ -! Эксперимент требует фенол / хлороформ должна быть выполнена под капотом. Используйте нитриловые перчатки при работе с фенол / хлороформ.

  1. После 3-часовой инкубации, мы добавляем 500 мкл фенол-хлороформ для каждого образца.
  2. Vortex всех образцов в течение нескольких секунд, затем центрифуге при 13 RCF оборотов в минуту в течение 5 мин.
  3. На данный момент, две фазы будут присутствовать, и мы заинтересованы в содержании верхней фазе. Выньте верхнюю фазу и положить его в 2 мл микроцентрифужных трубки.
  4. Добавить смесь 2μL гликогена и 50 мкл 3М ацетата натрия к каждому образцу наряду с 1,375 мл 100% этанола.
  5. Vortex всех образцов энергично. Поместите их в -80 ° С в течение ночи.

3-го дня

  1. Удалить образцы формы -80 ° C и поместите их на лед для них оттепели.
  2. Центрифуга на 15 RCF в течение 10 минут при 4 ° C.
  3. Осторожно удалите супернатант, не нарушая гранул в нижней части трубы.
  4. Добавьте 1 мл холодного 75% этанола на каждого образца, затем инвертировать их 4-6 раз.
  5. Центрифуга на 18 RCF в течение 5 мин при 4 ° C.
  6. Удалить супернатант еще раз и позволяют гранулы высохнуть на воздухе.
  7. Растворить сухой гранул в 50 мкл 4 мм Трис-HCl, PH8 и хранить при температуре -80 ° C до последующего использования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол изложенных здесь особенно полезен для следователей интересует гистонов и / или метилирования ДНК подписей человеческого мозга, потому что эти хроматина маркировка может быть менее склонными к посмертной артефакты по сравнению с другими типами модификаций, в том числе (гистонов) ацетилирования и фосфорилирования 1, 2. Посмертных мозг поддается изучению моно-нуклеосомной препаратов; ДНК остается в значительной степени придает основной гистонов, по крайней мере в образцах с представителем интервалы аутолиза (время между смертью и замораживания / хранение ткани) обычно находится в диапазоне от нескольких часов до 1,5 суток 1. Тем не менее, моно-нуклеосомной подготовки могут быть чувствительны к изменениям нуклеосомной позиционирования и плотности, особенно вокруг последовательности окружающих старта транскрипции генов сайтов 3. Таким образом, контрольные эксперименты с модификацией-независимые анти-гистонов антитела должны быть включены. Кроме того, это может быть возможным, чтобы изолировать поли-нуклеосомной фракций из экстракта мозга человека, используя более короткие сроки инкубации в течение микрококковой нуклеазы переварить в сочетании с дополнительной стадии очистки (в том числе ультрацентрифугирования). Наконец, последние исследования генома фактора транскрипции обязательными в посмертных мозг просто стриженой хроматина с помощью ультразвука 4. Примечательно, что подготовка хроматина фиксацией до пищеварения ультразвуком или на основе ферментов не может быть идеальным с точки зрения посмертных исследований, так как срыв и / или искусственных реконфигурации более высокого порядка, структуры хроматина после смерти являются потенциальными смешивает трудно контролировать. Таким образом, ChIP пробы на посмертных мозг, вероятно, будут полезны для ограниченного числа молекул, в том числе нуклеосомной гистонов ядра и других белков плотно прикреплена к геномной ДНК. Даже с этой оговоркой учитывать, подходы, изложенные в данной презентации могут обеспечить романа понимание хроматина связанных механизмы, регулирующие нейронов и глиальных функции в нормальных и больных человеческого мозга.

Мы использовали этот метод успешно в первую очередь для измерения гистонов метилирование гистонов и заселенности на конкретных промоутеров использованием гена гена КПЦР 1, 5, 6. Как было сказано выше человеческого мозга посмертных, кажется, поддается изучению моно-нуклеосомной подготовка потому ДНК остается в значительной степени придает основной гистонов. Как правило, когда, начиная с 75 мг человеческого ребенка или взрослого коры головного мозга (серого вещества) можно ожидать, используя протокол приведенные выше-выход 20-30 нг / мкл в общем объеме 50 мкл для входа и 10-15 нг / мкл в общем объеме 50 мкл для чипа, по крайней мере, когда конкретные модификации гистонов анти-антитела используются. Так называемый чип для входного соотношение единицы измерения. Специфика реакции контролируется кривой плавления анализа, гель-электрофореза и секвенирования. Кроме того, отрицательный контроль (я) не хватает специфических антител или (II), содержащий (неспецифический) иммуноглобулина должны быть обработаны КПЦР параллельно с чипом и входных образцов и не должно привести к конкретным продуктом. Помните, что при спермы лосося используется как блокирующий агент, контрольных образцов может привести к мазке при запуске на гель.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантом Национального института психического здоровья (5R01MH071476).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris-HCl EMD Millipore 9310
Magnesium Chloride Hexahydrate OmniPur, EMD Millipore 5980
Calcium Chloride Fisher Scientific C614-3
EDTA, 0.5M Solution, pH8.0 OmniPur, EMD Millipore 4055
Sodium Chloride Mallinckrodt Baker Inc. 7581-06
SDS Solution 10% (w/v) Bio-Rad 161-0416
Triton X-100 Fluka 93426
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I-3021
Sodium Deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-25G
Lithium Chloride Sigma-Aldrich L9650-100G
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S7277-250G
Sodium Acetate (anhydrous) Sigma-Aldrich S-2889
Nuclease micrococcal from Staphylococcus Sigma-Aldrich N3755-200UN
Benzamidine Fluka 12072
Phenylmethanesulfonylfluoride Sigma-Aldrich P7626-1G
3M DTT Fluka 43815
Protein G Agarose, Fast Flow Upstate, Millipore 16-266
Sonicated Salmon Sperm DNA Kit Stratagene, Agilent Technologies 201190
Proteinase K from Engyodontium album Sigma-Aldrich P2308
Phenol:Chloroform 1:1 OmniPur, EMD Millipore 6810
Glycogen, From Mussels Sigma-Aldrich G1767-1VL
Ethyl Alcohol (200 Proof) Pharmco-AAPER 111000200

Solutions:

  • nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
  • 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
  • Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
  • High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
  • Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
  • TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
  • Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
  • Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
  • 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.
  • nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
  • 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
  • Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
  • High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
  • Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
  • TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
  • Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
  • Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
  • 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain. J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.
  2. Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters. J Neurosci. 27, 11254-11262 Forthcoming.
  3. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31, 76-82 Forthcoming.
  4. Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain. Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 Forthcoming.
  5. Huang, H. uang, Akbarian, S. GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia. PLoS ONE. 2, Forthcoming.
  6. Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain. J Neurochem. 94, 324-336 Forthcoming.

Comments

3 Comments

  1. Dear Dr, I am selvakumar, Research scholar, Dept of Endocrinology,University of madras, chennai- India. I Need aclarification, whether is is possible in the rat brain. Send some assay, protocol in brain regions, thanking you, with regards selvakumar 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 21, 2008 - 9:25 AM
  2. Hi, What company did you purchase the tissue homogenizer from for douncing the brain tissue? Thanks, Pritika

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 6, 2009 - 10:19 PM
  3. Hi, Pritika, The tissue homogenizer is a Wheaton Science Product. We purchased from Fisher Scientific. Thank you. Yan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 7, 2009 - 9:29 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics