En kromatin-analys för mänskliga hjärnvävnaden

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Fram till nyligen var uttryck studier på mänskliga hjärnan begränsad till kvantifiering av RNA eller protein. Med kromatin immunoprecipitation tekniker som beskrivs i detta dokument kommer det att vara möjligt att kartlägga histon metylering och andra epigenetiska regulatorer av genuttryck i döden hjärnan.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Matevossian, A., Akbarian, S. A Chromatin Assay for Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (13), e717, doi:10.3791/717 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kroniska neuropsykiatriska sjukdomar som schizofreni, bipolär sjukdom och autism tros bero på en kombination av genetiska och miljömässiga faktorer som kan leda till epigenetiska förändringar av genuttryck och andra molekylär patologi. Traditionellt var dock uttryck studier i döden hjärnan begränsad till kvantifiering av mRNA eller protein. Begränsningarna stött på döden hjärnforskning som variabilitet i autolys tid och integrities vävnad är också sannolikt att påverka några studier av högre strukturer för kromatin. Men nucleosomal organisation av arvsmassans DNA inklusive DNA: core histon bindande - verkar vara i stort sett bevaras i representativa prover som tillhandahålls av olika hjärnan banker. Därför är det möjligt att studera metylering mönstret och andra kovalenta modifieringar av kärnan histoner vid definierade genetiska loci i döden hjärnan. Här presenterar vi en förenklad infödd kromatin immunoprecipitation (NChIP) protokoll för frysta (aldrig fast) mänskliga hjärnan exemplar. Från och med micrococcal nukleas rötning av hjärnan homogenat, följt NChIP av qPCR kan slutföras inom tre dagar. Den metod som presenteras här bör vara användbar för att belysa epigenetiska mekanismer av genuttryck i normala och sjuka mänskliga hjärnan.

Protocol

Förfarande:

1: a Day

1. Homogenisera 50-500 mg frysta efter slakt grå vävnad med Douncing buffert.

! VARNING - mänsklig vävnad måste hanteras med omsorg under strikta säkerhetskrav. Det ska hanteras på BSL-2 eller högre säkerhetsstandard.

  1. Ta tidigare dissekerade, obduktioner hjärnan från -80 ° C, dounce dem i 5X hjärnans volym Douncing buffert, och placera i 2,0 ml mikrocentrifugrör. Matchade prov och kontroll paren behandlas samtidigt.

2. Micrococcal nukleasfritt (MN) Matsmältning

  1. Lägg 5U/mL av Micrococcal nukleas till provet och blanda i lösningen genom att pipettera upp och ned innan de släpps ut på isen.
    * Kritiskt steg - Det är viktigt att göra detta steg snabbt sedan MN har förmågan att agera på ännu 4 ° C.
  2. Inkubera prov för 7 minuter vid 37 ° C.
  3. Efter 7 minuters inkubation, lägga 0,5 EDTA till en koncentration av 10 mM att stoppa MNase aktivitet.

3. Hypotonisation

  1. Placera prov till en 15 ml Falcon rör. Lägg 10X provet volym 0,2 mm EDTA, 1 / 2000 provvolym på 0,2 benzamidine och 1 / 1000 provvolym på 0,1 miljoner phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF). De två sistnämnda föreningar används som proteashämmare.
    * Kritiskt steg - Det är viktigt att hålla prover på is under alla dessa steg.
  2. Inkubera prov i 1 timme, medan vortexa det varje 10 minuter.
  3. I slutet av timmen lång inkubationstid, tillsätt 1 / 2000 provvolym av 3M DTT, ännu en proteashämmare.
  4. Vortex prov en gång och centrifugera vid 3175 RCF i 10 minuter vid 4 ° C.
    * Valfritt steg - Precleansing med Protein G agaros.
    1. Ta supernatanten och sätta i nya 15 ml Falcon rör.
    2. Tillsätt 500 mikroliter av Protein G agaros.
    3. Rotera i rumstemperatur i 30 min.
    4. Centrifugera vid 4000 rpm i 10 min vid 4 ° C.
  5. Fördela supernatanten så att 500 mikroliter används som indata kontroll (som endast innehåller genomiska DNA) och resten delas upp i två provrör innehållande 1600 mikroliter av provet var - som är för kromatin immunoprecipitation (chip) prover.
  6. Input kontroll är placerad vid -80 ° CO / N tills vidare användning.
  7. Till flisprover - lägg till 1:10 volym 10XFSB och 4μg antikroppar, sedan virvel prover och rotera dem vid 4 ° C över natten.
    ! VARNING - Belopp och utspädning av antikroppar kan kräva optimering.

2: a Day

! VARNING! - Börja 2: a dagen med att tvätta Protein G agaros som kommer att användas för att isolera nucleosomal DNA. Eftersom agarosen pärlor är mycket känsliga, är det nödvändigt att skära av huvudet på de tips när pipetteringen någon lösning innehållande agaros pärlor.

1. Probing Protein G agaros Pärlor till DNA

  1. Tillsätt 1,6 ml 1XFSB till 245 mikroliter protein G-Agar (tillräckligt för 4 rör) i en 2 ml mikrocentrifugrör (en slinga).
  2. Separata lösningen i två 2 ml rör och fyll varje upp till 1,6 ml med 1X FSB.
  3. Rotera vid RT i 30 sekunder och centrifugera vid 0,1 RCF i 30 sek.
  4. Avlägsna supernatanten med en dammsugare.
  5. Tillsätt 1,6 ml 1X FSB igen. Rotera prover för 30 sek och sedan centrifugera vid 0,1 RCF i 30 sek.
  6. Avlägsna supernatanten igen, och kombinera båda rören med 1,5 ml 1XFSB.
  7. Tillsätt 15 mikroliter sonicated DNA Lax spermier (10mg/mL).
    ! VARNING - Detta steg bör, i princip, minska icke-specifik bindning av immunoprecipitate till pärlor. Men även detta kan leda till falska positiva för några av de (mänskliga) DNA-sekvenser.
  8. Rotera vid RT i 30 min, sedan centrifugera vid 0,1 RCF i 30 sek.
  9. Avlägsna supernatanten. Tillsätt 200 mikroliter av 1XFSB.
  10. Tillsätt 90 mikroliter av agaros pärlor i varje chip prov. Rotera vid 4 ° C under 1 timme.
  11. Tillsätt 1 mL 1XFSB in återstående agaros pärlor att fungera som en negativ kontroll och rotera vid 4 ° C under 1 timme.
  12. Efter en timme lång inkubationstid, centrifugera proverna och negativa kontrollen vid 0,1 RCF i 30 sek. Kassera supernatanten.

2. Tvätta Pärlor

! VARNING! - Tvätt buffertar måste hållas vid 4 ° C tills den ska användas, och ska endast användas om mindre än en månad gamla.

  1. Tillsätt 1 ml av varje tvätt lösning på pärlor och rotera i 3 min vid RT.
  2. Centrifugera vid 0,1 RCF i 30 sek.
  3. Kassera supernatanten med hjälp av vakuum.

* Varje tvättlösning

- Låg salt tvättningsbuffert

- Hög salt tvättningsbuffert - Litiumklorid lösning - bara rotera vid RT under 1 minut!

- TE buffert (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH = 8)

3. Eluering

* Kritiskt steg - Gör färska Elution buffert för varje experiment på dagen den ska användas.

  1. Tillsätt 250 mikroliter av nyberedd eluering buffert i varje prov.
  2. Rotera i 15 min vid RT och sedan centrifugera vid 0,4 RCF i 1 min.
  3. Spara supernatanten i ett 2,0 ml mikrocentrifugrör (Loop).
  4. Tillsätt 250 mikroliter av eluering buffert till varje prov och vortexa för hand i några sekunder. Sedan virvel prover för 15 minuter på en mulitvortexer.
  5. Centrifugera vid 16 RCF rpm i 4 minuter och spara supernatanten i samma 2,0 ml tub (Loop).

4. Digest Protein

  1. Tillsätt 10 l 0,5 M EDTA, 25 l 0,8 Tris-HCl, pH 6,5, 10 mg / ml proteinas K (1 / 200 prov) till varje chip prov.
  2. Till varje ingång kontroll lägga lyseringsbuffert för proteinas K matsmältningen (1 / 10 av provet buffert) och 10mg/ml proteinas K (1 / 200 av prov buffert).
  3. Inkubera ingång och flisprover i 52 ° C i minst 3 timmar.

5. Fenol / Kloroform extraktion

! VARNING - Experiment kräver fenol / kloroform bör utföras under huven. Använd nitrilhandskar vid hantering av fenol / kloroform.

  1. Efter 3 timmars inkubation, lägger vi till 500 l fenol-kloroform till varje prov.
  2. Vortex alla prover i flera sekunder och sedan centrifugera vid 13 RCF rpm i 5 min.
  3. Vid denna punkt kommer två faser vara närvarande och vi är intresserade av innehållet i den övre fasen. Ta ut den övre fasen och lägg den i en 2 ml mikrocentrifugrör.
  4. Tillsätt en blandning av 2μL av glykogen och 50μL av 3M natriumacetat till varje prov tillsammans med 1,375 ml 100% etanol.
  5. Vortex alla prover kraftigt. Placera dem i -80 ° C över natten.

3: e dag

  1. Ta prover formen -80 ° C och placera dem på is för dem att tina.
  2. Centrifugera vid 15 RCF i 10 minuter vid 4 ° C.
  3. Ta försiktigt bort supernatanten utan att störa pelleten i botten av röret.
  4. Tillsätt 1 ml kall 75% etanol till varje prov och sedan vända dem 4-6 gånger.
  5. Centrifugera vid 18 RCF i 5 min vid 4 ° C.
  6. Avlägsna supernatanten gång och låt pellets lufttorka.
  7. Lös torkade pellets i 50 mikroliter av 4mm Tris-HCl, pH8 och förvara vid -80 ° C tills vidare användning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det protokoll som beskrivs här är särskilt användbart för utredarna intresserade histon och / eller DNA-metylering underskrifter mänskliga hjärnan, eftersom dessa kromatin märken kan vara mindre benägna att obduktion artefakter jämfört med andra typer av förändringar, inklusive (histon) acetylering och fosforylering 1, 2. Den obduktion hjärnan är mottaglig för studiet av mono-nucleosomal preparat; DNA är i stort sett knutna till kärnan histoner, åtminstone i prover med representativa autolys intervall (tiden mellan döden och frysning / lagring av vävnad) vanligtvis i intervallet några timmar upp till 1,5 dagar 1. Kunde dock mono-nucleosomal förberedelser vara känsliga för förändringar i nucleosomal positionering och täthet, särskilt runt sekvenser omgivande områden transkription början av gener 3. Därför bör kontroll experiment med modifikation oberoende anti-histon antikroppar ingå. Alternativt kan det vara möjligt att isolera poly-nucleosomal fraktioner från mänskliga hjärnan extrakt, med hjälp av kortare inkubationstiderna för micrococcal nukleas smälta tillsammans med ytterligare reningssteg (inkl. ultracentrifugering). Slutligen en färsk studie om arvsmassan hela transkriptionsfaktor bindande i döden hjärnan klippt enkelt kromatin via sonication 4. I synnerhet kan förbereda kromatin genom fixering före ultraljudsbehandling eller enzym-baserade matsmältningen inte vara perfekt med tanke på döden studier, eftersom fördelning och / eller artificiell omkonfigurering av högre strukturer för kromatin efter döden är potentiella förvirrar svåra att kontrollera för. Därför ChIP analyser om obduktion hjärnan kommer sannolikt att vara användbar för ett begränsat antal molekyler inklusive nucleosomal kärna histoner och andra proteiner tätt knutna till den genomiska DNA. Även med denna protest beaktas, de metoder som beskrivs i denna presentation kommer sannolikt att ge nya insikter i kromatin-associerade mekanismer som styr neuronala och gliaceller funktioner i normala och sjuka mänskliga hjärnan.

Vi har använt denna teknik framgångsrikt främst för mätning av histon metylering och histon occupancies vid specifika projektansvariga att använda genen av Gene qPCR 1, 5, 6. Som nämnts tidigare har den mänskliga döden hjärnan verkar vara mottaglig för studiet av mono-nucleosomal förberedelser eftersom DNA är i stort sett knutna till kärnan histoner. Vanligtvis när man startar med 75 mg av mänskliga barn eller en vuxen hjärnbarken (grå) kan man förvänta använder protokollet presenteras ovan-en avkastning på 20-30 ng / l i en total volym på 50 l för Input och 10-15 ng / l i en total volym på 50 l för chip, åtminstone när modifiering av specifika anti-histon antikroppar används. Den så kallade chip till Input förhållandet är den måttenhet. Specificitet av reaktionen övervakas genom smältning kurva analys, gelelektrofores och sekvensering. Dessutom negativa kontroller (i) saknar specifika antikroppar eller (ii) som innehåller (icke-specifik) immunglobulin bör behandlas av qPCR parallellt med chip och prover ingång och bör inte resultera i specifik produkt. Var medveten om att när laxen spermier används som en blockerande medel, kan kontrollprov resultera i ett cellprov när den körs på en gel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Institute of Mental Health (5R01MH071476).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris-HCl EMD Millipore 9310
Magnesium Chloride Hexahydrate OmniPur, EMD Millipore 5980
Calcium Chloride Fisher Scientific C614-3
EDTA, 0.5M Solution, pH8.0 OmniPur, EMD Millipore 4055
Sodium Chloride Mallinckrodt Baker Inc. 7581-06
SDS Solution 10% (w/v) Bio-Rad 161-0416
Triton X-100 Fluka 93426
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I-3021
Sodium Deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-25G
Lithium Chloride Sigma-Aldrich L9650-100G
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S7277-250G
Sodium Acetate (anhydrous) Sigma-Aldrich S-2889
Nuclease micrococcal from Staphylococcus Sigma-Aldrich N3755-200UN
Benzamidine Fluka 12072
Phenylmethanesulfonylfluoride Sigma-Aldrich P7626-1G
3M DTT Fluka 43815
Protein G Agarose, Fast Flow Upstate, Millipore 16-266
Sonicated Salmon Sperm DNA Kit Stratagene, Agilent Technologies 201190
Proteinase K from Engyodontium album Sigma-Aldrich P2308
Phenol:Chloroform 1:1 OmniPur, EMD Millipore 6810
Glycogen, From Mussels Sigma-Aldrich G1767-1VL
Ethyl Alcohol (200 Proof) Pharmco-AAPER 111000200

Solutions:

  • nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
  • 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
  • Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
  • High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
  • Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
  • TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
  • Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
  • Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
  • 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.
  • nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
  • 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
  • Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
  • High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
  • Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
  • TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
  • Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
  • Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
  • 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain. J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.
  2. Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters. J Neurosci. 27, 11254-11262 Forthcoming.
  3. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31, 76-82 Forthcoming.
  4. Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain. Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 Forthcoming.
  5. Huang, H. uang, Akbarian, S. GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia. PLoS ONE. 2, Forthcoming.
  6. Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain. J Neurochem. 94, 324-336 Forthcoming.

Comments

3 Comments

  1. Dear Dr, I am selvakumar, Research scholar, Dept of Endocrinology,University of madras, chennai- India. I Need aclarification, whether is is possible in the rat brain. Send some assay, protocol in brain regions, thanking you, with regards selvakumar 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 21, 2008 - 9:25 AM
  2. Hi, What company did you purchase the tissue homogenizer from for douncing the brain tissue? Thanks, Pritika

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 6, 2009 - 10:19 PM
  3. Hi, Pritika, The tissue homogenizer is a Wheaton Science Product. We purchased from Fisher Scientific. Thank you. Yan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 7, 2009 - 9:29 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics