Um Ensaio Chromatin para tecido do cérebro humano

Biology

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Summary

Até recentemente, estudos de expressão no cérebro humano eram limitados a quantificação de RNA ou proteína. Com as técnicas de imunoprecipitação de cromatina descritas neste documento, será possível mapear a metilação da histona e outros reguladores epigenética da expressão gênica no cérebro pós-morte.

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Matevossian, A., Akbarian, S. A Chromatin Assay for Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (13), e717, doi:10.3791/717 (2008).

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Abstract

Crônica doenças neuropsiquiátricas como a esquizofrenia, doença bipolar e autismo são pensados ​​para resultar de uma combinação de fatores genéticos e ambientais que podem resultar em alterações epigenéticas da expressão gênica e outra patologia molecular. Tradicionalmente, no entanto, estudos de expressão no cérebro pós-morte foram confinados a quantificação de mRNA ou da proteína. As limitações encontradas na investigação pós-morte do cérebro, como variabilidades no tempo autólise e integridades tecidos também são susceptíveis de impacto a todos os estudos de estruturas de maior cromatina ordem. No entanto, a organização nucleosomal de DNA genômico, incluindo DNA: núcleo da histona vinculativo - parece ser em grande parte preservados em amostras representativas prestados pelos bancos cérebro diferentes. Portanto, é possível estudar o padrão de metilação e outras modificações covalentes das histonas no núcleo definido loci genômicos no cérebro pós-morte. Aqui, apresentamos uma versão simplificada nativa imunoprecipitação da cromatina protocolo (NChIP) para amostras congeladas (nunca fixo) cérebro humano. Começando com micrococcal digestão nuclease de homogeneizados de cérebro, NChIP seguido por qPCR pode ser concluída dentro de três dias. A metodologia apresentada aqui deve ser útil para elucidar os mecanismos epigenéticos de expressão gênica em normais e doentes cérebro humano.

Protocol

Procedimento:

1 º dia

1. Homogeneizar 50-500 mg de tecido de matéria congelada post-mortem cinza com Douncing Buffer.

! ATENÇÃO - tecidos humanos devem ser manuseados com cuidado sob condições rígidas de segurança. Que deve ser manuseado em padrões NBS-2 ou superior de segurança.

  1. Tomar previamente dissecados, cérebro post-mortem de -80 ° C, Dounce-los em volume cerebral 5X de tampão Douncing, e colocar em tubo de microcentrífuga 2,0 mL. Matched amostra e pares de controle são processados ​​simultaneamente.

2. Micrococcal Nuclease (MN) Digestão

  1. Adicionar 5U/mL de Micrococcal nuclease para a amostra e misturar na solução pipetando cima e para baixo antes de colocar no gelo.
    * ETAPA CRÍTICA - É importante fazer este passo rapidamente desde MN tem a capacidade de atuar em até 4 ° C.
  2. Incubar as amostras durante 7 minutos a 37 ° C.
  3. Após a incubação 7 minutos, adicione EDTA 0,5 M a uma concentração de 10mM para parar a atividade MNase.

3. Hypotonisation

  1. Colocar as amostras em um tubo falcon 15 mL. Adicionar o volume de amostra de 0,2 mM 10X EDTA, 1 / 2000 volume de amostra de benzamidine 0,2 M e volume de amostra 1 / 1000 de phenylmethanesulphonylfluoride 0,1 M (PMSF). Os dois últimos compostos são usados ​​como inibidores da protease.
    * ETAPA CRÍTICA - É importante manter as amostras em gelo durante todos estes passos.
  2. Incubar amostra por 1 hora, enquanto vórtex a cada 10 minutos.
  3. No final da incubação hora de duração, adicionar volume de amostra 1 / 2000 da 3M TDT, outro inibidor da protease.
  4. Amostra de vórtice, uma vez mais e centrifugar a 3175 RCF por 10 minutos a 4 ° C.
    * ETAPA OPCIONAL - Precleansing com proteína G Agarose.
    1. Tome sobrenadante e colocar em novo tubo falcon 15 mL.
    2. Adicionar 500 mL da proteína G Agarose.
    3. Girar em temperatura ambiente por 30 min.
    4. Centrifugar a 4000 rpm por 10 min a 4 ° C.
  5. Distribuir sobrenadante para que 500 mL são usados ​​como controle de entrada (contendo DNA genômico apenas), eo restante é dividido em dois tubos contendo 1600 mL de amostra de cada um - que são de cromatina imunoprecipitação (CHIP) amostras.
  6. O controle de entrada é colocada a -80 ° CO / N até à sua utilização.
  7. Para as amostras de chip - adicionar o volume de 10XFSB 01:10 e 4μg de anticorpos, em seguida, as amostras vortex e gire-a 4 ° C durante a noite.
    ! ATENÇÃO - Quantidade e diluição de anticorpos pode exigir de otimização.

2 º Dia

! CUIDADO! - Begin 2 º dia lavando a proteína G Agarose que será usado para isolar DNA nucleosomal. Desde contas agarose são muito sensíveis, é necessário cortar as cabeças das dicas sempre pipetagem qualquer solução contendo esferas de agarose.

1. Sondagem Beads Proteína G Agarose para DNA

  1. Adicionar 1,6 mL para 245 mL 1XFSB proteína G-agarose (suficiente para 4 tubos) em um tubo de microcentrífuga de 2 mL (loop).
  2. Separar a solução em dois tubos de 2 mL e encha cada uma com até 1,6 mL com 1X FSB.
  3. Girar em RT por 30 segundos e centrifugar a 0,1 RCF por 30 seg.
  4. Retire o sobrenadante usando um vácuo.
  5. Adicionar 1,6 mL 1X FSB mais uma vez. Gire as amostras por 30 segundos e depois centrifugar a 0,1 RCF por 30 seg.
  6. Remover o sobrenadante, mais uma vez, e combinar os dois tubos com 1,5 mL 1XFSB.
  7. Adicionar 15 mL de DNA do esperma sonicado Salmon (10mg/mL).
    ! ATENÇÃO - Esta etapa deve, em princípio, reduzir a ligação não específica da immunoprecipitate às esferas. No entanto, isso também pode levar a falsos positivos para algumas das seqüências (humano) de DNA.
  8. Girar em RT por 30 min, em seguida, centrifugar a 0,1 RCF por 30 seg.
  9. Remover o sobrenadante. Adicionar 200 mL de 1XFSB.
  10. Adicionar 90 mL de contas agarose em cada amostra ChIP. Gire a 4 ° C por 1 hora.
  11. Adicione 1 ml de 1XFSB em grânulos restantes agarose para servir como controle negativo e gire a 4 ° C por 1 hora.
  12. Após a incubação hora de duração, centrifugar as amostras e controle negativo em 0,1 RCF por 30 seg. Desprezar o sobrenadante.

2. Lavar as Beads

! CUIDADO! - Buffers de lavar roupa deve ser mantida a 4 ° C até o uso, e devem ser usados ​​apenas se estão a menos de um mês de idade.

  1. Adicionar 1 mL de cada solução de lavagem para as contas e rodar por 3 min à temperatura ambiente.
  2. Centrífuga de 0,1 RCF por 30 seg.
  3. Descarte de vácuo utilizando sobrenadante.

* Cada solução de lavagem

- Tampão de lavagem Low sal

- Tampão de lavagem de alta sal - Solução de cloreto de lítio - apenas giram a RT por 1 minuto!

- Tampão TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH = 8)

3. Eluição

* ETAPA CRÍTICA - Faça tampão de eluição frescos para cada experimento no dia em que está a ser utilizado.

  1. Adicionar 250 mL de tampão de eluição preparada para cada amostra.
  2. Rodar por 15 min à temperatura ambiente, então centrifugue a 0,4 RCF por 1 min.
  3. Salve o sobrenadante em um tubo de microcentrífuga de 2,0 mL (Loop).
  4. Adicionar 250 mL de tampão de eluição de cada amostra e vortex à mão por alguns segundos. Então, amostras vortex por 15 minutos em um mulitvortexer.
  5. Centrifugar a 16 RCF rpm por 4 minutos e guarde o sobrenadante em 2,0 mL mesmo tubo (Loop).

4. Proteína Digest

  1. Adicionar 10 ml de EDTA 0,5 M, 25 mL 0,8 M Tris-HCl, pH 6,5, 10 mg / ml Proteinase K (1 / 200 da amostra) para cada amostra ChIP.
  2. Para cada controle de entrada, adicionar tampão de lise para a digestão proteinase K (1 / 10 de tampão da amostra) e proteinase K 10mg/ml (1 / 200 de tampão da amostra).
  3. Entrada e incubar amostras de chip em 52 ° C por pelo menos 3 horas.

5. Fenol / clorofórmio extração

! ATENÇÃO - Experiment exigindo fenol / clorofórmio deve ser realizada sob o capô. Use luvas de borracha nitrílica ao manusear fenol / clorofórmio.

  1. Após a incubação de 3 horas, nós adicionamos os 500 mL de fenol-clorofórmio para cada amostra.
  2. Vortex todas as amostras durante vários segundos, em seguida, centrifugar a 13 rpm RCF por 5 min.
  3. Neste ponto, duas fases estarão presentes e nós estamos interessados ​​no conteúdo da fase de topo. Retire a fase superior e colocá-lo em um tubo de microcentrífuga de 2 mL.
  4. Adicionar uma mistura de 2μL de glicogênio e 50μL de acetato de sódio 3M para cada amostra, juntamente com 1,375 mL de etanol 100%.
  5. Vortex vigorosamente todas as amostras. Colocá-los em -80 ° C durante a noite.

3 º dia

  1. Remover amostras forma -80 ° C e colocá-los no gelo para eles a descongelar.
  2. Centrifugar a 15 RCF por 10 minutos a 4 ° C.
  3. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento no fundo do tubo.
  4. Adicionar 1 mL de etanol 75% frio para cada amostra, em seguida, inverter-los 4-6 vezes.
  5. Centrifugar a 18 RCF por 5 min a 4 ° C.
  6. Remover o sobrenadante, uma vez mais e permitir que as pelotas para o ar seco.
  7. Dissolver pellets secos em 50 mL de 4mm Tris-HCl, PH8 e armazenar a -80 ° C até à sua utilização.

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Discussion

O protocolo apresentado aqui é particularmente útil para os pesquisadores interessados ​​em assinaturas de metilação das histonas e / ou DNA do cérebro humano, porque essas marcas cromatina pode ser menos propenso a artefatos pós-morte, em comparação com outros tipos de modificações, incluindo (histonas) acetilação e fosforilação 1, 2. O cérebro pós-morte é passível de estudo da mono-nucleosomal preparados; o DNA permanece em grande parte ligado à histonas do núcleo, pelo menos em amostras com intervalos de autólise representante (o tempo entre a morte eo congelamento / armazenamento do tecido) tipicamente na faixa de várias horas até 1,5 dias 1. No entanto, mono-nucleosomal preparações podem ser sensíveis a mudanças no posicionamento nucleosomal e densidades, particularmente em torno seqüências proximidade dos sítios de transcrição início de genes 3. Portanto, experimentos de controle com modificação independente de anticorpos anti-histonas devem ser incluídos. Alternativamente, pode ser possível isolar poli-nucleosomal frações de extratos de cérebro humano, utilizando menor tempo de incubação para a nuclease micrococcal digerir em conjunto com etapas de purificação adicional (incl. ultracentrifugação). Finalmente, um estudo recente sobre genome-wide fator de transcrição de ligação no cérebro pós-morte, simplesmente cortado cromatina via sonicação 4. Nomeadamente, a preparação da cromatina por fixação antes da digestão sonicação ou à base de enzimas pode não ser ideal do ponto de vista dos estudos post-mortem, porque quebra e / ou artificial reconfiguração das estruturas de ordem superior cromatina após a morte são confunde potencial de difícil controle para. Assim, ensaios chip no cérebro pós-morte são susceptíveis de ser útil para um número limitado de moléculas, incluindo histonas do núcleo nucleosomal e outras proteínas firmemente ligado ao DNA genômico. Mesmo com essa ressalva tidos em conta, as abordagens descritas nesta apresentação são susceptíveis de fornecer insights romance em cromatina associados mecanismos que regem as funções neuronais e gliais no cérebro normal e doentes humanos.

Temos utilizado esta técnica com sucesso principalmente para medição de metilação de histonas e ocupação das histonas em promotores específicos usando gene por gene qPCR 1, 5, 6. Como dito anteriormente o cérebro pós-morte humana parece ser favorável ao estudo da mono-nucleosomal preparações porque o DNA permanece em grande parte ligado à histonas do núcleo. Normalmente, quando se inicia com 75 mg de criança ou adulto humano córtex cerebral (massa cinzenta) pode-se esperar usando o protocolo apresentado acima um rendimento de 20-30 ng / mL em um volume total de 50 l para a entrada e 10-15 ng / mL em um volume total de 50 l para ChIP, pelo menos quando a modificação específica anticorpos anti-histonas são usados. O Chip chamado à relação de entrada é a unidade de medida. Especificidade da reação é monitorado por análise da curva de derretimento, eletroforese em gel, e seqüenciamento. Além disso, controles negativos (i) sem os anticorpos específicos ou (ii) a imunoglobulina (não específica) contendo devem ser processados ​​por qPCR em paralelo com o chip e amostras de entrada e não devem resultar em produtos específicos. Estar ciente de que quando o esperma de salmão é usado como um agente de bloqueio, amostras de controlo pode resultar em uma mancha quando executado em um gel.

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Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por uma doação do Instituto Nacional de Saúde Mental (5R01MH071476).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris-HCl EMD Millipore 9310
Magnesium Chloride Hexahydrate OmniPur, EMD Millipore 5980
Calcium Chloride Fisher Scientific C614-3
EDTA, 0.5M Solution, pH8.0 OmniPur, EMD Millipore 4055
Sodium Chloride Mallinckrodt Baker Inc. 7581-06
SDS Solution 10% (w/v) Bio-Rad 161-0416
Triton X-100 Fluka 93426
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I-3021
Sodium Deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-25G
Lithium Chloride Sigma-Aldrich L9650-100G
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S7277-250G
Sodium Acetate (anhydrous) Sigma-Aldrich S-2889
Nuclease micrococcal from Staphylococcus Sigma-Aldrich N3755-200UN
Benzamidine Fluka 12072
Phenylmethanesulfonylfluoride Sigma-Aldrich P7626-1G
3M DTT Fluka 43815
Protein G Agarose, Fast Flow Upstate, Millipore 16-266
Sonicated Salmon Sperm DNA Kit Stratagene, Agilent Technologies 201190
Proteinase K from Engyodontium album Sigma-Aldrich P2308
Phenol:Chloroform 1:1 OmniPur, EMD Millipore 6810
Glycogen, From Mussels Sigma-Aldrich G1767-1VL
Ethyl Alcohol (200 Proof) Pharmco-AAPER 111000200

Solutions:

  • nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
  • 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
  • Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
  • High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
  • Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
  • TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
  • Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
  • Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
  • 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.
  • nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
  • 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
  • Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
  • High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
  • Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
  • TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
  • Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
  • Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
  • 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.

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References

  1. Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain. J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.
  2. Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters. J Neurosci. 27, 11254-11262 Forthcoming.
  3. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31, 76-82 Forthcoming.
  4. Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain. Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 Forthcoming.
  5. Huang, H. uang, Akbarian, S. GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia. PLoS ONE. 2, Forthcoming.
  6. Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain. J Neurochem. 94, 324-336 Forthcoming.

Comments

3 Comments

  1. Dear Dr, I am selvakumar, Research scholar, Dept of Endocrinology,University of madras, chennai- India. I Need aclarification, whether is is possible in the rat brain. Send some assay, protocol in brain regions, thanking you, with regards selvakumar 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 21, 2008 - 9:25 AM
  2. Hi, What company did you purchase the tissue homogenizer from for douncing the brain tissue? Thanks, Pritika

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 6, 2009 - 10:19 PM
  3. Hi, Pritika, The tissue homogenizer is a Wheaton Science Product. We purchased from Fisher Scientific. Thank you. Yan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 7, 2009 - 9:29 AM

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