잠재적인 파킨슨병의 유전자 검증을위한 C. 엘레간스 도파민 신경 세포의 변성 분석의 응용

Published 7/18/2008
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Biology

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Summary

이 동영상은 파킨슨병에 대한 모델로 dopaminergic 신경 세포의 neurodegeneration을 평가 C. 엘레간스를 사용하는 방법을 보여줍니다. 또한, 유전자 화면은 어느 변성을 향상 또는 neuroprotective 가지 요인을 식별하는 데 사용됩니다.

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Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes. J. Vis. Exp. (17), e835, doi:10.3791/835 (2008).

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Abstract

파킨슨병 (PD)의 진단과 치료에 개선이 위험 인구를 렌더링 자화율 요인에 대한 지식에 의존하고 있습니다. 경찰과 관련된 새로운 유전자 요소를 식별하는 시도의 과정에서, 과학자들은 후보 유전자, polymorphisms, 중요한 진보를 대표하는 단백질의 많은 목록을 생성 있지만, 이러한 리드 mechanistically 정의되지 않은 상태로 유지됩니다. 우리 작품은 상당히 간단한 동물 모델 시스템의 장점을 이용하여 이러한 목록을 축소 방향으로 목표로하고 있습니다. 인간 뉴런 수십억을 가지고 있지만, 미세한 회 Caenorhabditis 엘레간스 정확하게 302을 가지고있는 hemaphrodites에서 단지 8 생산의 도파민 (DA). 투약 및 연령에 의존 neurodegeneration에 C. 엘레간스 DA 뉴런 결과에서 PD - 관련 단백질, 알파 synuclein를 인코딩 인간 유전자의 표현.

DA의 뉴런 인간의 알파 synuclein을 표현하는 벌레는 isogenic하고 검찰의 전송 모터 (Pdat - 1)에서 GFP과 인간 알파 synuclein 모두를 표현한다. GFP의 존재이 동물에서 검찰의 neurodegeneration에 따라위한 쉽게 시각 마커 역할을합니다. 우리는 처음 알파 synuclein 유발 검찰 neurodegeneration가 torsinA, 분자 보호자 활동 1 단백질 이러한 동물 구출 수 있다고 보여주었다. 또한, 후보 PD 관련 유전자 그러면 C. 엘레간스 DA 뉴런의 과잉 표현했다 알파 synuclein의 misfolding 분석을 사용하여 대규모 RNAi 심사 노력을 통해 우리가 실험실에서 발견. 우리는 그들이 알파 synuclein - 유발 - DA neurodegeneration 2 구조로 다섯 일곱 유전자 PD의 대표 중요한 후보 변조기를 테스트 사실을 확인했습니다. 알파 synuclein에 의존 독성이 세포 독성을 강화하거나 억제 유전자에 대한 수 판독로 사용됩니다 의하여 또한, 린드 퀴 스트 연구소 (목성의 문제) 효모 화면을 수행했습니다. 우리는 이후의 C. 엘레간스 알파 synuclein - 유도 neurodegeneration 분석에 효모 후보 유전자 검사를하고 성공적으로 이러한 목표를 3, 4의 많은 검증.

우리의 방법론은 Pdat - 1 프로 모터의 제어하에 후보 유전자 cDNAs의 recombinational 복제를 사용하는 C. 엘레간스 DA 뉴런 특정 발현 벡터의 생성을 포함한다. 이러한 plasmids 그러면 성공적인 변환을위한 선택 마커와 함께 야생 타입 (N2) 벌레에 microinjected 있습니다. DA의 뉴런에서 후보 단백질을 생산하는 다수의 안정적인 유전자 변형 라인은 노화의 과정을 통해, 동물 및 개별 신경 세포 수준 모두에서, 취득 후 독립적으로 건너 알파 synuclein 퇴행성 변형에와 neurodegeneration에 대한 평가입니다.

Protocol

A. 식 플라스미드 건설

두 plasmids이 필요합니다 : 조직 특정 관심의 유전자의 표현과 선택 전환 표시로 두 번째 (플라스미드 마커가 연구 공동체에서 일반적으로 사용할 수 있습니다하지만) 한.

실험 플라스미드

  1. 관심 조직 / 세포 유형에 표현되는 모터를 선택,이 경우, 검사의 수송은 (Pdat - 1) 발기인이 사용됩니다. 이 표현 플라스미드는 복제 recombinational 1 모터 관심 하류의 유전자의 삽입을 허용하는 Invitrogen 게이트웨이 시스템을 호환 대상 벡터 (pDEST - DAT - 1)로 만들어졌습니다.
  2. 관심 유전자의 cDNA는 PCR이 게이트웨이 AT & T B recombinational 시퀀스를 포함하는 primers를 사용하여 증폭됩니다. 증폭된 cDNA 먼저 입력 벡터를 만들 수있는 기증자 벡터 pDONR201에 recombined 후 E. 대장균 DH5α 변형으로 변환됩니다. 성공 recombinants과 DNA의 미니 준비 고립의 선택에 따라, 입력 벡터는 표현식이 플라스미드 만들 pDEST - DAT - 1 대상 벡터에 recombined입니다. recombinational 복제에 대한 자세한 내용은 Invitrogen 게이트웨이 설명서 중 또는 콜드웰 외에서 사용할 수 있습니다. 5.

플라스미드 선택 마커

플라스미드 형질 마커는 명확한 조직에서 형광 단백질의 표현을 구동 모터와 벡터로 구성되어 있습니다. 이되도록 특정 프로 시저에서, UNC - 54 발기인은 신체 벽 근육의 벚꽃 단백질 발현 (: 벚꽃 Punc - 54)을시킵니다.

Microinjection 통해 트렌스 제닉 C. 엘레간스의 B. 생성

관련 조브 문서를 참조하십시오 http://www.jove.com/index/details.stp?ID=833을

C. 유전자는 DA의 neurodegeneration 분석을위한 십자가

  1. 웜 표준 절차 6을 사용하여 재배하고 있습니다.
  2. 플레이스 10 Pdat - 1 : α - SYN, Pdat - 1 : 3-4 L4 단계 형질 전환 나온것과 짝짓기 접시에 GFP의 남성 1, 2 (: 유전자 X와 Punc - 54은 : Pdat - 1을 표현 : 체리) . 이것은 만들어진 세 개의 별도의 안정적인 라인 각각에 대해 개별적으로 수행되어야합니다. 이일 후 수컷을 제거합니다.
  3. F1 세대를 검사, 여러 남성 자손이있다면, 교미를 성공적으로 완료했습니다.
  4. 각 십자가에서 다섯 남녀 추니 L4 동물을 복제되는 전시 모두 Pdat - 1 : GFP 형광 마커 (남자 부모로부터 상속)과 Punc - 54 : 벚꽃 형광 바디 벽 근육 마커 (남녀 추니의 부모로부터 상속). 복제된 동물들은 아직 플레이트에있는 남자 동물 성관계를하지 않도록하기 위해 L4 단계에서해야합니다. 그들이 자기 ​​십자가와 F2 자손을 생산하도록 허용합니다.
  5. 3 단계에서 생산 F2 동물 밖으로 복제됩니다. 특히, 전송 ~ 자신의 개인 접시에 두 형광 마커를 전시 5-10 동물. 화면 동물 표현 DA 뉴런에 GFP과 동물의 일부 100 % 신체 벽 근육 세포에 표현 벚꽃 아르 접시에 대한 F3 세대. 이러한 동물 Pdat - 1 homozygous 것입니다 : α - SYN, Pdat - 1 : GFP 유전자 안정 새로 만든 transgene (유전자 X)를 전송하는 동안.

D. Dopaminergic 신경 세포 분석

  1. 새로운 위에서 만든 세 줄의 각각의 접시뿐만 아니라 Pdat - 1을 준비 : α - SYN, Pdat - 1 : GFP 혼자 변형. 그들이 성인으로 성장할 수 있습니다.
  2. 새로운 접시에 각 라인 30-40 형질 어른을 전송합니다. 그들은 20 º C. 4 시간 동안 태아를 낳기 위해 허용
  3. 어른을 제거합니다. 그들은 L4 단계에 도달할 때까지 배아가 20 º C에서 3-4일에 대한 개발을 허용합니다.
  4. 0.04 MG / ML 5 - 플루오로 - 2' - deoxyuridine (FUDR)이있는 접시로 ~ 100 유전자 변형 L4 동물을 선택하십시오. DNA 합성의 억제를 통해 다음 세대의 뉴클레오 티드 아날로그 블록 개발, 따라서 실험 동물 7 압도에서 자식을 방지. 그것이 가벼운 민감한이기 때문에 빛을에서 FUDR 번호판을 보호할 수 있습니다.
  5. 성인 동물 계란 누워있는 다음과 같은 여러 일에 분석할 수 있습니다. 분석의 적절한 일은 경험적으로 결정됩니다. 예를 들어, 우리는 결정했다고 77%, 87 %, 그리고 Pdat - 1의 90 % : α - SYN, Pdat - 1 : GFP의 동물들이 각각, 일 6, 7 및 10 게시물 개발에서 퇴화한 검찰의 뉴런을 나타냅니다. 따라서, 우리가 관심의 transgene이 neurodegeneration을 강화 수도 예측한다면, 우리는 6 일 및 / 또는 7 분석합니다. 마찬가지로, neurodegeneration을 억제 수도 있습니다 transgenes은 7 일 10시 분석됩니다.
  6. 4 신선한 아가로 오스 패드를 (microinjection의 한천 패드와는 달리, 이들은 신선한 사용하고 밖으로 건조 수 없습니다)합니다. 그들에 걸쳐 테이프의 조각을 두 가지 현미경 슬라이드를 설정하고, 테이프 equivalently 두꺼운 패드를위한 스페이서 역할을합니다. 3 분의 1을하다(그들은 세 나란히 위치에 있습니다) 벤치에서 그들 사이에 슬라이드. 중앙 슬라이드 용융 아가로 오스의 드롭을 장소와 빠르게 직각 세 슬라이드와 전체, 아가로 오스 상단에서 다른 슬라이드를하다. 패드를 사용할 준비가 될 때까지 함께 두 슬라이드를 떠나 여러 추가 패드하십시오.
  7. 웜 검찰의 뉴런을 분석, 22 X 30mm 커버 유리 3 MM의 levamisole (마취)의 6 μl 방울을 넣으십시오. 아가로 오스 패드에 커버 유리 반전 후, 드롭으로 (10 30 이상의 추가 득점 수) 40 성인 동물을 선택하십시오. 다른 라인의 각각에 대해 반복합니다.
  8. epifluorescence 및 FITC 또는 GFP의 시각화를 허용 필터 큐브와 복합 현미경을 사용하여 각 CEP 및 ADE 신경 세포의 존재에 대한 점수 줄에 30 동물. 우리는 GFP HYQ 필터 큐브를 (채도 기술) 부여를 사용하십시오. 첨부된 채점 시트에 기록 데이터입니다. 야생 동물 종류가 완료 모든 4 CEP에서 GFP의 형광 2 ADE의 뉴런을 유지합니다. DA의 뉴런의 손실을 전시 개별 동물은 아닌 WT 또는 "degenerating"로 득점 있습니다. 마찬가지로, 변성의 정도는 각 동물에서뿐만 아니라 인구로 잃은 총 뉴런를 세어 득점 수 있습니다.
  9. 분석에게 두 번 이상 (시험 줄에 30 이상 동물)을 반복합니다. 분석의 3 라운드에서 야생 형 DA의 뉴런을 전시 웜의 총수는 평균입니다. neuroprotection에 대한 통계 분석은 다음 제어 웜 (: α - SYN, Pdat - 1 : Pdat - 1 : GFP)을 비교하는 학생의 T - 테스트 (P <0.05)를 사용하여 수행됩니다 변종이있는 DA의 뉴런에 이상 - 특급 후보 유전자 .

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Discussion

도파민 뉴런의 나이에 의존 손실이 파킨슨병의 임상적 특징이며 알파 synuclein이라는 단백질의 축적이나 misfolding와 연결되었습니다. 여기 C.의 dopaminergic 신경, 형광등 transgene을 통해, 레이블하는 방법을 보여줍니다 엘레간스 이러한 세포의 coexpressing 인간 알파 synuclein에 의해 파킨슨병에서 본 neurodegeneration을 모방.

이 동영상은 성장, 유전자 교차점, 장착 및 중 neurodegeneration을 강화하거나 노화의 과정을 통해 neuroprotection을 제공 유전 요인을 평가하기 위해 유전자 변형 nematodes의 점수에 대한 방법론을 묘사. 관리가 적절하게 신경 세포의 손실이나 보호를 채점에서 남성과 성공 유전자 교차하기 위해 나온것 개최하고, 일관성 유지를 위해 transgene 마커를 사용하여 촬영합니다. 이러한 방법으로, C. 엘레간스도 neurodegeneration에 기여하거나 향상시키는 신경 세포의 생존을 위해 치료 목표를 대표하는 수도 유전 요인의 신속한 평가를 용이하게합니다.

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Acknowledgements

우리 모두는 콜드 웰 연구소 회원의 협력 정신을 인정하고 싶습니다. 연구실에 운동 장애 연구는 바흐만 - 스트라우스 Dystonia & 파킨슨병 재단, 미국 파킨슨병 재단, 미국 파킨슨 질병 협회, 앨라배마 파킨슨병 협회, 파킨슨병 연구에 대한 마이클 J. 폭스 재단과 대학 연​​구소에 의해 지원되었습니다

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agarose Ultrapure Invitrogen 15510-027
Coverglass 20x30 mm Fisher Scientific 12-548-5A
Microscope Slides Plain, 3x1" Fisher Scientific 12-549
Dissecting with Fluorescence Microscope Nikon Instruments SMZ800
Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ645
Epifluorescent Microscope Nikon Instruments Model E-800
Filter Cube, GFP HYQ Endow Bandpass Chroma Technology Corp.

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References

  1. Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
  2. Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model. PNAS. 105, 728-733 (2008).
  3. Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
  4. Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. PNAS. 105, 145-150 (2008).
  5. Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. John Wiley and Sons. West Sussex, England. (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  7. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).

Comments

7 Comments

  1. Thank you for your research. My husband has Parkinson's. It's so good to know that young people are doing research which may ultimately help stem the onslaught of this disease, not in our lifetime, but perhaps in the near future. Where dŒs your study go from here? Good luck with your work. (reader from Vancouver, Canada)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 10, 2008 - 2:08 PM
  2. Hi I would like to know when you can view the GFP::Alpha Synuclein C. elegans? Also, dŒs the Alpha-synuclein slowly degenerate the neurons or dŒs it automatically degenerate them when the C. elegans are born? Do they have to be in the adult stage when viewed under the microscope?

    Reply
    Posted by: Hunter C.
    September 27, 2010 - 9:57 PM
  3. Oh wow, this is awesome.

    Reply
    Posted by: Dmitriy K.
    August 12, 2013 - 12:35 AM
  4. Hello! How does the GFP get viewed in the C. elegans? Is there a specific type of microscope needed or does the promoter of the gene need to be activated?

    Reply
    Posted by: Marilyn Z.
    January 25, 2014 - 1:25 AM
  5. Hi. 1) To view GFP you need a microscope equipped with special (UV) light and fluorescent filters to excite the GFP molecule and capture the emissions. 2) This is a biological question, not so much an equipment question. The power of GFP and similar fluorescent molecules is that as long as they are expressed in the cell that can be visualized by the proper type of microscope. The type of promoter they are fused to just directs the tissue and/or developmental time of expression in the animal. Depending on the type of promoter used it may or may not need to be activated. For example heat-shock promoters need to have the animal heated above normal temp to induce expression. Other promoters are constitutive, so they are active all the time.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    February 3, 2014 - 3:14 PM
  6. Oh, I see. Thank you!

    How fast is the GFP produced? (for example, if I have GFP expression in DAergic neurons and do something to increase DAergic activity, can I see the increase in GFP right after, or how long will I have to wait?) Thanks.

    Reply
    Posted by: Marilyn Z.
    February 18, 2014 - 4:34 PM
  7. Again, how "fast" the GFP is produced depends on the type of transcriptional promoter it is attached to. The dat-1 promoter we use is expressed in the dopaminergic neurons. Once those cells have differentiated, the promoter is functional and the GFP is then expressed. So there is no need to activate these neurons to see the GFP. However, in other systems, a promoter may need to be activated (like the heat-shock example described above) to allow it to express the GFP.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    February 19, 2014 - 11:49 AM

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