一个线虫多巴胺神经元退化含量的应用验证潜在的帕金森氏症基因

Published 7/18/2008
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Biology

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Summary

该视频演示如何使用线虫作为帕金森病模型的多巴胺能神经元的神经退行性疾病,以评估。此外,遗传屏幕是用来识别,要么提高变性或神经因素。

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Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes. J. Vis. Exp. (17), e835, doi:10.3791/835 (2008).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

帕金森氏病(PD)的诊断和治疗的改进取决于关于在高危人群的易感因素,呈现的知识。在试图找出与PD相关的新的遗传因素的过程中,科学家们产生了许多候选基因,多态性,蛋白质,代表了重要进展列出,但这些信息仍然机械地不确定。我们的工作目的是利用一个简单的动物模型系统的优势,如列出走向显着缩小。虽然人类有十亿的神经元,微观蛔虫线虫正是302,其中只有八个产生多巴胺(DA),在hemaphrodites。表达一个人的PD相关蛋白,α-突触核蛋白基因编码线虫DA能神经元剂量与年龄相关的神经退行性疾病的结果。

蠕虫DA能神经元中表达人α-突触核蛋白等基因和表达GFP和人α-突触核蛋白的DA转运子(Pdat 1)下。绿色荧光蛋白的存在,作为一个在这些动物中的DA神经退行性疾病容易可视化的标记。我们初步表明,α-突触核蛋白诱导DA神经退行性疾病,可以在这些动物中救出torsinA,具有分子伴侣活性蛋白质1。此外,候选人的PD相关基因的鉴定,我们通过大规模RNAi筛选使用α-突触核蛋白的错误折叠检测工作的实验室,然后在C. elegans的DA能神经元过度表达。我们决定,七五的基因测试,因为他们救出α-突触核蛋白诱导DA神经退行性疾病 2 PD的显着代表候选人调制。此外,林德基斯特实验室(这个问题的朱庇特)已经完成酵母屏幕,使依赖α-突触核蛋白毒性是用于读出一个基因,可以增强或抑制细胞毒性。其后,我们研究线虫α-突触核蛋白诱导神经退行性疾病检测酵母候选基因,并成功地验证这些目标的3, 4。

我们的方法涉及一个线虫DA神经元特异性表达Pdat - 1启动子的控制下使用的候选基因的cDNA recombinational克隆载体的一代。然后,这些质粒显微注射野生型(N2),蠕虫,伴随着一个成功转型的可选标志。多个稳定生产的DA能神经元的候选蛋白的转基因株系的获得,然后自主划线到α- synuclein的退行性应变和神经退行性疾病进行评估,在动物和单个神经元的水平,在老化的过程。

Protocol

A.表达质粒的构建

需要两个质粒:感兴趣的基因组织特异性表达和作为第二个可选择的改造标记(虽然通常是由研究界内的标记质粒)之一。

实验质粒

  1. 选择一个利益的组织/细胞类型中表达的启动子,在这种情况下,DA转运(Pdat 1)发起人为使用。这表达质粒作为Invitrogen公司的网关系统兼容的目标向量(pDEST - DAT - 1),允许插入任何发起人的利益下游基因 recombinational克隆1。
  2. 感兴趣的基因的cDNA PCR扩增用引物包含网关ATT乙recombinational序列。扩增的cDNA第一重组到捐助载体pDONR201创建入门载体,然后转化到大肠杆菌菌株DH5α中。入门载体是继成功的重组体的选择和小型预习DNA提取,重组到pDEST - DAT - 1目标的载体,以创建表达质粒。 recombinational克隆的详情,可从Invitrogen公司的网关手册或在考德威尔等5

选择标记质粒

转基因标记质粒组成一个驾驶了一个明显的组织中的荧光蛋白表达的启动子的载体。在这个特殊的过程中,UNC - 54启动子驱动樱桃体壁肌肉蛋白的表达(Punc - 54:樱花)。

B.通过显微注射转基因C. elegans的的代

请参阅相关的朱庇特的文章 :http://www.jove.com/index/details.stp?ID=833

C.遗传横渡DA神经退行性疾病分析

  1. 蠕虫是种植使用的标准程序。
  2. 放置10 Pdat - 1:α- SYN; Pdat - 1:GFP的男性1,2到一个3-4 L4阶段转基因雌雄同体交配板(表达Pdat 1:基因X和Punc - 54:樱花) 。这应该是单独为每个创建三个单独的稳定线。两天后,取出男性。
  3. F1代的检查,如果有几个男的后代,交配成功。
  4. 克隆出5雌雄同体L4从每个交叉动物展览Pdat - 1:GFP荧光标记(父本继承)和Punc - 54:樱花荧光体壁肌肉标记(雌雄同体父继承)。克隆动物需要在L4阶段,以确保他们尚未与板块上存在的雄性动物交配。让他们自交产生F2代。
  5. 在第3步中产生的F2动物克隆。具体地说,转移到自己的个人板,表现出两种荧光标记5-10动物。屏幕板,其中100%的动物表达绿色荧光蛋白在DA能神经元和一些动物在体壁肌肉细胞中都表达樱桃F3代。这些动物将Pdat - 1纯合子:α- SYN; Pdat - 1:绿色荧光蛋白基因,而稳定的传输新创建的转基因(基因X)。

D.多巴胺能神经元分析

  1. 准备新鲜板,以及为每个上面创建的三线Pdat - 1:α- SYN; Pdat - 1:GFP的单独应变。让他们长到成年。
  2. 从每行传送到一个​​新的板块30-40的转基因成年人。允许他们打下了4个小时的胚胎在20℃
  3. 取出的成年人。允许胚胎为3-4天,在20℃开发,直到他们达到的L4阶段。
  4. 选择板含有0.04 mg / ml的5 - 氟-2' - 脱氧尿苷(FUDR)〜100的转基因L4动物。这核苷酸模拟模块通过抑制DNA合成的下一代的发展,从而防止铺天盖地而来的7个实验动物的后代。光保护FUDR板,因为它是光敏感。
  5. 成年动物进行分析,在产蛋后的各种天。凭经验确定适当的分析天。例如,我们已经确定,77%,87%和90%的Pdat - 1:α- SYN; Pdat - 1:GFP的动物表现出堕落的DA能神经元,在6天,7日和10后的发展。因此,如果我们预测,转基因可能会提高神经退行性疾病的利益,我们将分析,在第6天和/或7。同样,将可能抑制神经退行性疾病的转基因分析,在7和10天。
  6. 使4个新鲜的琼脂糖凝胶垫(与显微注射琼脂垫不同的是,这些都是使用新鲜的,不得干出)。设置了两个显微镜幻灯片,在它们之间有一块的磁带;磁带作为等价脚垫厚实间隔。奠定了第三个它们之间在板凳上滑动​​(它们定位三排)。广场中心幻灯片上的熔化琼脂糖下降,并迅速奠定琼脂糖上另一张幻灯片,垂直和所有三张幻灯片。使一些额外的垫,留下两个幻灯片,直到垫准备使用。
  7. 要分析蠕虫DA能神经元,地方上一个22 × 30毫米的玻璃盖的3毫米左旋咪唑(一种麻醉剂)6μL下降。挑选40个成年动物(超出30 10额外得分)下降,然后翻转到琼脂糖垫玻璃盖。其他各线的重复。
  8. 分数每行30只动物,为每个CEP和ADE神经使用epifluorescence和过滤器的多维数据集,允许可视化FITC或GFP的复合式显微镜的存在。我们使用一个赋予GFP HYQ过滤立方体(色度科技)。附加的评分表上的记录数据。野生动物将保留在所有4 CEP的完整的绿色荧光和2 ADE的神经元。参展的DA能神经元的损失动物个体取得非WT或“堕落”。同样,变性程度上可以取得,通过计算每个动物以及人口失去了总神经元。
  9. 重复2次以上(30多个动物每人审判)的分析。参展三轮分析野生型的DA能神经元的蠕虫总数的平均值。神经保护的统计分析是,然后执行使用的学生的t检验(P <0.05),以比较控制蠕虫(Pdat - 1::α- SYN; Pdat - 1::GFP)与株DA能神经元的过度表达候选基因。

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Discussion

年龄依赖性的多巴胺神经元的损失是帕金森氏病的临床标志,并已积累或称为α-突触核蛋白的一种蛋白质的错误折叠有关。在这里,我们将演示如何标注,通过荧光的基因,C的多巴胺能神经元elegans和模仿在这些细胞中的共表达人α-突触核蛋白在帕金森氏症的神经退行性疾病。

此影片描绘的增长,遗传隧道,安装,和转基因线虫的得分来评估遗传因素,提高神经退行性疾病,或提供在老化过程中的神经保护作用的方法。护理是采取适当上演男,雌雄同体,以确保成功的遗传杂交的一致性,并在得分神经元的损失或保护,利用转基因维护标记。在这种方式下,C线虫有利于遗传因素的快速评估,可促进神经退行性病变或代表为提高神经元的存活的治疗靶点。

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Acknowledgements

我们要感谢考德威尔实验室所有成员的合作精神。运动障碍在实验室的研究已经得到了巴赫曼 - 斯特劳斯肌张力障碍及帕金森基金会,美国帕金森基金会,美国帕金森病协会,阿拉巴马州帕金森氏病协会,迈克尔J.福克斯帕金森病研究基金会,和本科生科研

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agarose Ultrapure Invitrogen 15510-027
Coverglass 20x30 mm Fisher Scientific 12-548-5A
Microscope Slides Plain, 3x1" Fisher Scientific 12-549
Dissecting with Fluorescence Microscope Nikon Instruments SMZ800
Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ645
Epifluorescent Microscope Nikon Instruments Model E-800
Filter Cube, GFP HYQ Endow Bandpass Chroma Technology Corp.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
  2. Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model. PNAS. 105, 728-733 (2008).
  3. Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
  4. Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. PNAS. 105, 145-150 (2008).
  5. Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. John Wiley and Sons. West Sussex, England. (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  7. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).

Comments

7 Comments

  1. Thank you for your research. My husband has Parkinson's. It's so good to know that young people are doing research which may ultimately help stem the onslaught of this disease, not in our lifetime, but perhaps in the near future. Where dŒs your study go from here? Good luck with your work. (reader from Vancouver, Canada)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 10, 2008 - 2:08 PM
  2. Hi I would like to know when you can view the GFP::Alpha Synuclein C. elegans? Also, dŒs the Alpha-synuclein slowly degenerate the neurons or dŒs it automatically degenerate them when the C. elegans are born? Do they have to be in the adult stage when viewed under the microscope?

    Reply
    Posted by: Hunter C.
    September 27, 2010 - 9:57 PM
  3. Oh wow, this is awesome.

    Reply
    Posted by: Dmitriy K.
    August 12, 2013 - 12:35 AM
  4. Hello! How does the GFP get viewed in the C. elegans? Is there a specific type of microscope needed or does the promoter of the gene need to be activated?

    Reply
    Posted by: Marilyn Z.
    January 25, 2014 - 1:25 AM
  5. Hi. 1) To view GFP you need a microscope equipped with special (UV) light and fluorescent filters to excite the GFP molecule and capture the emissions. 2) This is a biological question, not so much an equipment question. The power of GFP and similar fluorescent molecules is that as long as they are expressed in the cell that can be visualized by the proper type of microscope. The type of promoter they are fused to just directs the tissue and/or developmental time of expression in the animal. Depending on the type of promoter used it may or may not need to be activated. For example heat-shock promoters need to have the animal heated above normal temp to induce expression. Other promoters are constitutive, so they are active all the time.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    February 3, 2014 - 3:14 PM
  6. Oh, I see. Thank you!

    How fast is the GFP produced? (for example, if I have GFP expression in DAergic neurons and do something to increase DAergic activity, can I see the increase in GFP right after, or how long will I have to wait?) Thanks.

    Reply
    Posted by: Marilyn Z.
    February 18, 2014 - 4:34 PM
  7. Again, how "fast" the GFP is produced depends on the type of transcriptional promoter it is attached to. The dat-1 promoter we use is expressed in the dopaminergic neurons. Once those cells have differentiated, the promoter is functional and the GFP is then expressed. So there is no need to activate these neurons to see the GFP. However, in other systems, a promoter may need to be activated (like the heat-shock example described above) to allow it to express the GFP.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    February 19, 2014 - 11:49 AM

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