潜在的なパーキンソン病の遺伝子を検証するための線虫のドーパミンニューロンの変性のアッセイのアプリケーション

Published 7/18/2008
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Biology

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Summary

このビデオでは、パーキンソン病のモデルとしてドーパミン作動性ニューロンの神経変性を評価するために線虫を使用する方法を示します。さらに、遺伝子スクリーニングは、どちら変性を高めたり、神経保護の要因を識別するために使用されます。

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Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes. J. Vis. Exp. (17), e835, doi:10.3791/835 (2008).

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Abstract

パーキンソン病(PD)の診断と治療の改善が危険にさらされる人口をレンダリング感受性要因に関する知識に依存しています。 PDに関連する新たな遺伝的要因を識別しようとする過程で、科学者は候補遺伝子、多型、および重要な進歩を表すタンパク質の多くのリストを生成しているが、これらのリード線は、機構的に未定義のまま。私たちの仕事は大幅に単純な動物モデルシステムの利点を活用することによってこのようなリストを狭めることに狙いを定めています。人間は神経細胞の十億を有しているが、顕微鏡回虫線虫Caenorhabditis elegansは、正確に302 hemaphroditesでのわずか8農産物のドーパミン(DA)があります。投与量と年齢に依存する神経変性におけるC. elegansのDAニューロンの結果でPD -関連タンパク質、α-シヌクレインをコードするヒト遺伝子の発現。

DAニューロンのヒトα-シヌクレインを発現しているワームは同質であり、DAトランスポーターのプロモーター下にGFPとα-シヌクレインのヒト(Pdat - 1)の両方を表現する。 GFPの存在は、これらの動物ではDA神経変性を以下のための容易に視覚化マーカーとして機能します。我々は最初にα-シヌクレイン誘発性のDA神経変性がtorsinA、分子シャペロン活性が1の蛋白質によってこれらの動物で救助できることを実証した。さらに、候補PD関連遺伝子は、C. elegansのDAニューロンで過剰発現されたα-シヌクレインのミスフォールディングのアッセイを用いて大規模なRNAiスクリーニングの取り組みを経由して私たちの研究室で同定した。我々は、彼らがα-シヌクレイン誘発性のDA神経変性2を救出したとして7遺伝子の5人がPDの表現の重要な候補モジュレーターをテストしたことが判明。また、リンドクイストラボ(Joveのこの問題は)酵母の画面を実行したことにより、α-シヌクレイン依存毒性は細胞毒性を増強または抑制することができる遺伝子の読み出しとして使用されます。私たちは、その後、私たちの線虫α-シヌクレイン誘発神経変性のアッセイで酵母の候補遺伝子を調べ、正常にこれらの目標3、4の多くの検証。

私たちの方法論はPdat - 1プロモーターの制御下に候補遺伝子のcDNAの組換えクローニングを使用して、C. elegansのDAニューロン特異的発現ベクターの生成を伴います。これらのプラスミドは、成功した変換のための選択マーカーと共に、野生型(N2)ワームにマイクロインジェクションされています。 DAニューロンの候補タンパク質を生産する複数の安定したトランスジェニック系統が得られ、その後独立してα-シヌクレインの変性株に交差させ、老化の過程で、動物と個々のニューロンレベルの両方で、神経変性について評価されています。

Protocol

A.発現プラスミドの構築

二つのプラスミドが必要です。興味と選択可能な形質転換マーカー(プラスミドマーカーは、研究コミュニティ内から通常使用可能ですが)などの第二の遺伝子の組織特異的発現のための1つを。

実験的なプラスミド

  1. 興味の組織/細胞型において発現されるプロモーターを選択し、この場合は、DAトランスポーター(Pdat - 1)プロモーターが使用されます。この発現プラスミドは、組換えクローニングを1プロモーターの関心の下流の任意の遺伝子の挿入を可能にするインビトロジェンのゲートウェイシステムと互換性のあるデスティネーションベクター(PDEST - DAT - 1)として作成されました。
  2. 目的の遺伝子のcDNAをPCRには、ゲートウェイATT B組換え配列を含むプライマーを用いて増幅される。増幅したcDNAは、最初のエントリのベクトルを作成するためにドナーベクターpDONR201に再結合し、大腸菌株DH5αに変換されます。成功した組換え体とDNAのミニプレップ分離の選択後、エントリーベクターは、発現プラスミドを作成するPDEST - DAT - 1デスティネーションベクターに再結合されています。組み換えクローン作成の詳細については、InvitrogenのGatewayのマニュアルから、またはコールドウェルらで用意されています。5。

プラスミド選択可能なマーカー

プラスミド形質転換マーカーは明らか組織における蛍光タンパク質の発現を駆動するプロモーターを持つベクトルで構成されています。この特定の手順では、UNC - 54プロモーターは、体壁筋の桜のタンパク質発現(::チェリーPunc - 54)を駆動します。

マイクロインジェクションを介してトランスジェニック線虫のB.の生成

:関連Joveの記事を参照してください。 http://www.jove.com/index/details.stp?ID=833を

DAの神経変性の解析のためのC.遺伝子交雑

  1. ワームは、標準的な手順6を使用して栽培されています。
  2. プレイス10 Pdat - 1::α- SYN、Pdat - 1::(::遺伝子XとPunc - 54::チェリーPdat - 1を発現する)3-4 L4ステージトランスジェニック雌雄同体と交配プレート上にGFPの雄1、2 。これは、作成した3つの別々の安定した線のそれぞれに対して個別に実行する必要があります。 2日後、男性を取り外します。
  3. F1世代を点検し、いくつかの男性の子孫が存在する場合、交配が成功しました。
  4. それぞれのクロスから5両性L4動物をクローニングすること展示の両方Pdat - 1::GFP蛍光マーカー(男性の親から継承されます)とPunc - 54::チェリー蛍光体壁筋のマーカー(両性の親から継承されます)。クローン動物は、彼らはまだプレート上に存在する雄動物と交配されていないことを確認するためにL4段階にあるとする必要があります。それらが自己交差してF2子孫を生成することができます。
  5. ステップ3で生成したF2動物が出クローン化されています。具体的には、転送〜自分の個々のプレートに、両方の蛍光マーカーを示す50〜10の動物。画面DAニューロンの動物の100%がGFPを発現するプレートのF3世代や動物の一部が体壁筋細胞で発現する桜です。これらの動物はPdat - 1のホモ接合になります::α- SYN、Pdat - 1::GFP遺伝子を安定新しく作成された遺伝子(遺伝子X)を送信中。

D.ドーパミン作動性ニューロンの解析

  1. 新鮮な上記で作成した3行のそれぞれのプレートだけでなく、Pdat - 1を準備します::α- SYN、Pdat - 1::GFP単独系統。彼らが大人に成長することができます。
  2. 新鮮なプレート上にそれぞれのラインから30〜40トランスジェニック大人を転送する。それらを20℃で4時間胚を築くために許可する
  3. 大人を削除します。彼らはL4段階に到達するまでの胚は20℃で3〜4日間、開発することができます。
  4. 0.04 mg / mlの5 - フルオロ-2' - デオキシウリジン(FUDR)を含むプレートに〜100トランスジェニックL4動物を選択してください。したがって、実験動物7を圧倒から子孫を防ぐDNA合成の阻害を介して次の世代のこのヌクレオチドアナログブロックの開発、。それは光に敏感であるため、光からFUDR板を保護する。
  5. 成体動物は、産卵に続く様々な日で分析されます。分析の適切な日々は経験的に決定されています。例えば、我々は決定したその77%、87%、Pdat - 1の90%::α- SYN、Pdat - 1::GFPの動物はそれぞれ、日6、7および10後の開発で縮退DAニューロンを示す。したがって、我々が関心の導入遺伝子は神経変性を高める可能性があることを予測した場合、我々は6日目及び/または7で分析を行います。同様に、神経変性を抑制する可能性導入遺伝子は、7日目および10で分析されます。
  6. 4新鮮なアガロースパッドを(マイクロインジェクション寒天パッドとは異なり、これらの新鮮な使用されていると乾きが許可されていない)ことを確認します。それらの間でテープの部分を持つ2つの顕微鏡スライドを設定し、テープには、等価的に厚いパッドのためのスペーサーとして機能します。三分の一をレイベンチでそれらの間にスライドさせて(それらは三遅れないように配置されています)。中央のスライド上に溶融アガロースの低下を置き、すぐに垂直に3つのすべてのスライドにし、全体で、アガロースの上に別のスライドを置く。パッドの使用準備が整うまで、一緒に2つのスライドを残して、いくつかの追加のパッドを作る。
  7. ワームDAニューロンを分析するために、22 × 30mmのカバーガラス上の3 mMのレバミゾール(麻酔)の6μlのドロップを置きます。アガロースのパッド上にカバーガラスを反転して、ドロップに(10が30を超えて余分な得点する)40大人の動物を選んでください。他の行のそれぞれに対して繰り返します。
  8. 落射蛍光及びFITCやGFPの可視化を可能にするフィルタキューブを持つ化合物の顕微鏡を使用して各CEPとADEニューロンの存在のためのスコアラインあたり30匹を。我々は、GFP HYQフィルターキューブ(クロマテクノロジー)を与える使用してください。添付のスコアリングシート上のデータを記録する。野生型の動物は、すべての4 CEPと2 ADEニューロンにおける完全なGFPの蛍光を保持します。 DAニューロンの喪失を示す個々の動物は、非WTまたは"退化"と記録されています。同様に、変性の程度は、各動物に失わ合計ニューロンと同様に人口を数えることによって得点することができます。
  9. 分析を2回以上(試験ごとにラインごとに30以上の動物)を繰り返します。分析の三回から、野生型DAニューロンを示すワームの合計数が平均化されます。神経保護のための統計分析は、コントロールのワーム(::α- SYN、Pdat - 1:Pdat - 1:GFP)を比較するために、学生のt -検定(P <0.05)を用いて行われる株とそのDAニューロンで過剰発現する候補遺伝子。

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Discussion

ドーパミンニューロンの年齢に依存する損失は、パーキンソン病の臨床的特徴であり、α-シヌクレインと呼ばれる蛋白質の蓄積や折り畳みに関連付けられている。ここでは、Cのドーパミン作動性ニューロン、蛍光遺伝子を経由して、ラベルの作成 ​​方法を示していますとこれらの細胞で共発現ヒトα-シヌクレインによるパーキンソン病に見られる神経変性を模倣する。

このビデオでは、成長、遺伝学的交差、マウンティング、そしてどちらかの神経変性を高めたり、老化の過程で神経保護を提供する遺伝的要因を評価するためのトランスジェニック線虫のスコアリングのための方法論を示しています。ケアは、適切にニューロンの損失または保護の得点で男性との成功の遺伝的交雑を確保するために雌雄同体上演、および一貫性遺伝子のメンテナンスのためのマーカーを使用して取得されます。このように、C.虫はどちら神経変性に寄与するまたは向上させるニューロンの生存のための治療標的を表すことができる遺伝的要因の迅速な評価を容易にする。

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Acknowledgements

我々はすべてコールドウェル研究室のメンバーの協力精神を認識したい。ラボにおける運動障害の研究は、バッハマン-シュトラウスジストニア&パーキンソン財団、米国パーキンソン財団、米国パーキンソン病協会、アラバマ州のパーキンソン病協会、パーキンソン病研究のためのマイケルJフォックス財団、および学部研究によってサポートされています

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agarose Ultrapure Invitrogen 15510-027
Coverglass 20x30 mm Fisher Scientific 12-548-5A
Microscope Slides Plain, 3x1" Fisher Scientific 12-549
Dissecting with Fluorescence Microscope Nikon Instruments SMZ800
Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ645
Epifluorescent Microscope Nikon Instruments Model E-800
Filter Cube, GFP HYQ Endow Bandpass Chroma Technology Corp.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
  2. Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model. PNAS. 105, 728-733 (2008).
  3. Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
  4. Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. PNAS. 105, 145-150 (2008).
  5. Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. John Wiley and Sons. West Sussex, England. (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  7. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).

Comments

7 Comments

  1. Thank you for your research. My husband has Parkinson's. It's so good to know that young people are doing research which may ultimately help stem the onslaught of this disease, not in our lifetime, but perhaps in the near future. Where dŒs your study go from here? Good luck with your work. (reader from Vancouver, Canada)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 10, 2008 - 2:08 PM
  2. Hi I would like to know when you can view the GFP::Alpha Synuclein C. elegans? Also, dŒs the Alpha-synuclein slowly degenerate the neurons or dŒs it automatically degenerate them when the C. elegans are born? Do they have to be in the adult stage when viewed under the microscope?

    Reply
    Posted by: Hunter C.
    September 27, 2010 - 9:57 PM
  3. Oh wow, this is awesome.

    Reply
    Posted by: Dmitriy K.
    August 12, 2013 - 12:35 AM
  4. Hello! How does the GFP get viewed in the C. elegans? Is there a specific type of microscope needed or does the promoter of the gene need to be activated?

    Reply
    Posted by: Marilyn Z.
    January 25, 2014 - 1:25 AM
  5. Hi. 1) To view GFP you need a microscope equipped with special (UV) light and fluorescent filters to excite the GFP molecule and capture the emissions. 2) This is a biological question, not so much an equipment question. The power of GFP and similar fluorescent molecules is that as long as they are expressed in the cell that can be visualized by the proper type of microscope. The type of promoter they are fused to just directs the tissue and/or developmental time of expression in the animal. Depending on the type of promoter used it may or may not need to be activated. For example heat-shock promoters need to have the animal heated above normal temp to induce expression. Other promoters are constitutive, so they are active all the time.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    February 3, 2014 - 3:14 PM
  6. Oh, I see. Thank you!

    How fast is the GFP produced? (for example, if I have GFP expression in DAergic neurons and do something to increase DAergic activity, can I see the increase in GFP right after, or how long will I have to wait?) Thanks.

    Reply
    Posted by: Marilyn Z.
    February 18, 2014 - 4:34 PM
  7. Again, how "fast" the GFP is produced depends on the type of transcriptional promoter it is attached to. The dat-1 promoter we use is expressed in the dopaminergic neurons. Once those cells have differentiated, the promoter is functional and the GFP is then expressed. So there is no need to activate these neurons to see the GFP. However, in other systems, a promoter may need to be activated (like the heat-shock example described above) to allow it to express the GFP.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    February 19, 2014 - 11:49 AM

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