Application d'une Assay C. elegans dégénérescence des neurones dopaminergiques pour la validation du potentiel de la maladie de Parkinson gènes

Published 7/18/2008
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Biology

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Summary

Cette vidéo montre comment utiliser C. elegans afin d'évaluer la neurodégénérescence neurone dopaminergique comme un modèle pour la maladie de Parkinson. Par ailleurs, cribles génétiques sont utilisés pour identifier les facteurs qui accentuent la dégénérescence ou sont neuroprotecteurs.

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Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes. J. Vis. Exp. (17), e835, doi:10.3791/835 (2008).

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Abstract

Les améliorations apportées au diagnostic et au traitement de la maladie de Parkinson (MP) sont tributaires des connaissances sur les facteurs qui rendent la susceptibilité des populations à risque. Dans le processus de tenter d'identifier de nouveaux facteurs génétiques associés à la DP, les scientifiques ont généré de nombreuses listes de gènes candidats, les polymorphismes, et les protéines qui représentent des avancées importantes, mais ces pistes restent mécanistiquement indéfini. Notre travail vise vers un rétrécissement de manière significative ces listes en exploitant les avantages d'un système de modèle animal simple. Bien que les humains ont des milliards de neurones, le nématode Caenorhabditis elegans microscopiques a précisément 302, dont huit seulement de produire la dopamine (DA) dans hemaphrodites. Expression d'un gène humain codant pour la protéine PD-associé, l'alpha-synucléine, dans C. elegans résultats neurones DA de la dose et âge-dépendante neurodégénérescence.

Worms exprimer humaine alpha-synucléine dans les neurones DA sont isogéniques et d'exprimer à la fois la GFP et l'alpha-synucléine humaine sous le promoteur du transporteur DA (EPEC-1). La présence de la GFP sert de marqueur pour suivre facilement visualisés neurodégénérescence DA chez ces animaux. Nous avons d'abord démontré que l'alpha-synucléine neurodégénérescence induite DA ont pu être sauvés dans ces animaux par torsinA, une protéine à activité chaperon moléculaire 1. En outre, le candidat PD-liés gènes identifiés dans notre laboratoire au travers de grands efforts de dépistage ARNi en utilisant un dosage repliement alpha-synucléine ont ensuite été sur-exprimée dans les neurones DA C. elegans. Nous avons déterminé que cinq des sept gènes testés représenté modulateurs candidat significatif de PD comme ils sauvé l'alpha-synucléine induite DA neurodégénérescence 2. Par ailleurs, le laboratoire de Lindquist (cette question de Jupiter) a effectué la levure écrans où l'alpha-synucléine-dépendant toxicité est utilisée comme une lecture des gènes qui peuvent augmenter ou supprimer la cytotoxicité. Nous avons ensuite examiné les gènes candidats de la levure dans notre test de C. elegans neurodégénérescence alpha-synucléine-induite et validé avec succès plusieurs de ces trois cibles, 4.

Notre méthodologie implique la génération d'un vecteur d'expression de C. elegans DA neurone-spécifique en utilisant le clonage par recombinaison des gènes candidats ADNc sous le contrôle du promoteur EPEC-1. Ces plasmides sont ensuite microinjectés de type sauvage (N2) vers, avec un marqueur de sélection pour la transformation réussie. Plusieurs lignées transgéniques stables produisant la protéine candidate dans les neurones DA sont obtenus indépendamment et ensuite franchi dans la souche alpha-synucléine dégénératives et évalués pour la neurodégénérescence, à la fois l'animal et le niveau des neurones individuels, au cours du vieillissement.

Protocol

A. Construction plasmide d'expression

Deux plasmides sont nécessaires: un pour l'expression tissu-spécifique du gène d'intérêt et un second en tant que marqueur sélectionnable de transformation (bien que le marqueur de plasmide est habituellement disponible au sein de la communauté de la recherche).

Experimental plasmidique

  1. Sélectionnez un promoteur qui est exprimé dans le type de tissu / cellule d'intérêt, dans ce cas, le transporteur DA (EPEC-1) promoteur est utilisé. Ce plasmide d'expression a été créé comme une passerelle Invitrogen système compatible vecteur de destination (pDEST-DAT-1) pour permettre l'insertion d'un gène d'intérêt en aval du promoteur par clonage par recombinaison 1.
  2. L'ADNc du gène d'intérêt est amplifié par PCR utilisant des amorces qui contiennent la passerelle att séquence B recombinaison. L'ADNc amplifié est d'abord recombinés dans le vecteur pDONR201 des donateurs pour créer le vecteur d'entrée et ensuite transformé en E. coli souche DH5a. Après la sélection de recombinants succès et mini-prep isolation de l'ADN, le vecteur d'entrée est recombinée dans le pDEST-DAT-1 vecteurs de destination pour créer le plasmide d'expression. Détails sur le clonage par recombinaison sont disponibles à partir du manuel soit Passerelle Invitrogen ou dans Caldwell et al. 5.

Marqueurs de sélection plasmidique

Un marqueur transgénique plasmide est constitué d'un vecteur par un promoteur qui contrôlent l'expression d'une protéine fluorescente dans un tissu clair. Dans cette procédure particulière, le promoteur unc-54 entraîne l'expression des protéines dans le corps de cerises paroi musculaire (ponctua-54:: cerise).

B. Génération de C. elegans transgéniques via micro-injection

Voir l'article relatif JoVE: http://www.jove.com/index/details.stp?ID=833

C. Analyse génétique des croix pour la neurodégénérescence DA

  1. Worms sont cultivés en utilisant des procédures standard de 6.
  2. Placer 10 EPEC-1:: α-syn; EPEC-1:: GFP mâles 1, 2 sur une plaque d'accouplement avec 3-4 L4 hermaphrodites transgéniques étape (exprimant EPEC-1: gène X et de ponctua-54:: cerise) . Cela devrait être effectué individuellement pour chacune des trois lignes séparées stables créés. Après deux jours, retirez les mâles.
  3. Inspectez la génération F1; s'il ya plusieurs descendants mâles, l'accouplement a réussi.
  4. Clone sur 5 hermaphrodites L4 animaux de chaque croix que présentent à la fois l'EPEC-1:: GFP marqueur fluorescent (hérité du parent mâle) et la ponctua-54:: cerise marqueur fluorescent muscles du corps mur (hérité du parent hermaphrodite). Les animaux clonés doivent être au stade L4 afin de s'assurer qu'ils n'ont pas encore accouplées avec des mâles présents sur le plateau. Permettez-leur de l'auto-cross et produire une descendance F2.
  5. Animaux F2 produits à l'étape 3 sont clonées sur. Plus précisément, le transfert des animaux ~ 50-10 qui présentent deux marqueurs fluorescents pour leurs propres assiettes individuelles. Écran de la génération F3 pour les plaques d'où 100% de la GFP animaux expriment en DA neurones et certains des animaux sont d'exprimer cerise dans les cellules du corps muscle de la paroi. Ces animaux seront homozygotes pour l'EPEC-1:: α-syn; EPEC-1: gène de la GFP alors stablement transmission du transgène nouvellement créé (gène X).

D. Analyse dopaminergiques Neuron

  1. Préparer une plaque de frais pour chacune des trois lignes créées ci-dessus, ainsi que l'EPEC-1:: α-syn; EPEC-1:: GFP seule souche. Leur permettre de croître à l'âge adulte.
  2. Transfert 30-40 adultes transgénique à partir de chaque ligne sur une plaque fraîche. Permettez-leur de jeter des embryons pendant 4 heures à 20 º C.
  3. Retirez les adultes. Autoriser les embryons à développer pendant 3-4 jours à 20 º C jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade L4.
  4. Choisissez ~ 100 transgénique L4 animaux à une plaque contenant 0,04 mg / ml de 5-fluoro-2'-désoxyuridine (FUDR). Ce nucléotide de développement analogiques des blocs de la prochaine génération par inhibition de la synthèse de l'ADN, empêchant ainsi la descendance de l'animal de laboratoire écrasante 7. Protéger les plaques FUDR de la lumière car il est sensible à la lumière.
  5. Les animaux adultes seront analysés à plusieurs jours suivant la ponte. Les jours d'analyse appropriées sont déterminées empiriquement. Par exemple, nous avons déterminé que 77%, 87% et 90% de l'EPEC-1:: α-syn; EPEC-1:: GFP animaux présentent dégénéré neurones DA aux jours 6, 7 et 10 de développement post, respectivement. Par conséquent, si nous prévoyons que le transgène d'intérêt pourrait renforcer la neurodégénérescence, nous allons analyser au jour 6 et / ou 7. De même, des transgènes qui pourrait supprimer la neurodégénérescence sera analysée au jour 7 et 10.
  6. Faire 4 nouveaux pads agarose (contrairement à des plaquettes de gélose microinjection, elles sont utilisées fraîches et ne sont pas autorisés à sécher). Énoncer deux lames de microscope qui ont un morceau de ruban à travers eux; le ruban sert entretoise pour les plaquettes équivalente d'épaisseur. Lay tiersglisser entre eux sur le banc (ils sont positionnés sur trois au courant). Déposer une goutte de agarose fondu sur la lame du centre et rapidement mettre une autre lame sur le dessus de l'agarose, perpendiculaire à et à travers tous les trois diapositives. Faites plusieurs pads supplémentaires, laissant les deux diapositives ensemble jusqu'à ce que le pad est prêt à l'emploi.
  7. Pour analyser le ver neurones DA, déposer une goutte 6 pi de 3 mM lévamisole (un anesthésique) sur un 22 x 30 mm couvercle en verre. Choisissez 40 animaux adultes (10 supplémentaires au-delà des 30 à être marqué) dans la goutte, puis inverser le couvercle en verre sur le tampon d'agarose. Répétez l'opération pour chacune des autres lignes.
  8. Score 30 animaux par ligne pour la présence de chaque CEP et ADE neurone à l'aide d'un microscope composé avec épifluorescence et un cube de filtre qui permet la visualisation de FITC ou GFP. Nous utilisons un filtre à gagner à la GFP HyQ cube (technologie Chroma). Enregistrer les données sur la feuille de pointage ci-joint. Animaux de type sauvage conservera fluorescence de la GFP complète dans tous les CEP 4 et 2 neurones ADE. Les animaux individuels présentant une perte de neurones DA sont marqués comme non-WT ou "dégénérer". De même, la mesure de la dégénérescence peut être marqué par le comptage des neurones perdus au total dans chaque animal ainsi que la population.
  9. Répétez l'analyse 2 fois plus (30 animaux plus par ligne et par essai). Le nombre total de vers de type sauvage présentant des neurones DA à partir des trois tours des analyses est de moyenne. L'analyse statistique pour la neuroprotection est ensuite effectuée à l'aide de l'étudiant t-test (p <0,05) pour comparer les vers de contrôle (EPEC-1:: α-syn; EPEC-1:: GFP) par des souches qui les gènes candidats sur-expriment dans les neurones DA .

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Discussion

La perte liée à l'âge des neurones à dopamine est une caractéristique clinique de la maladie de Parkinson et a été associée à l'accumulation ou mauvais repliement d'une protéine appelée alpha-synucléine. Ici, nous montrer comment l'étiquette, par l'intermédiaire d'un transgène fluorescentes, les neurones dopaminergiques de C. elegans et imiter la neurodégénérescence observée dans la maladie de Parkinson en coexprimant humaine alpha-synucléine dans ces cellules.

Cette vidéo illustre la méthodologie pour la croissance, croisements génétiques, de montage, et la notation des nématodes transgéniques afin d'évaluer les facteurs génétiques qui soit améliorer la neurodégénérescence ou de fournir une neuroprotection au cours du vieillissement. Il est pris soin d'utiliser des marqueurs pour l'entretien transgène convenablement mis en scène des hommes et des hermaphrodites pour assurer le succès des croisements génétiques, et la cohérence dans la notation la perte de neurones ou de protection. De cette manière, C. elegans facilite l'évaluation rapide des facteurs génétiques qui peuvent soit contribuer à la neurodégénérescence ou représentent des cibles thérapeutiques pour améliorer la survie des neurones.

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Acknowledgements

Nous tenons à souligner l'esprit de coopération de tous les membres du laboratoire Caldwell. Mouvements anormaux de recherche dans le laboratoire a été soutenu par la dystonie Bachmann-Strauss & Parkinson Foundation, Royaume-Parkinson Foundation, American Association Maladie de Parkinson, la maladie de Parkinson Association de l'Alabama, la Fondation Michael J. Fox pour la recherche sur le Parkinson, et une recherche de premier cycle

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agarose Ultrapure Invitrogen 15510-027
Coverglass 20x30 mm Fisher Scientific 12-548-5A
Microscope Slides Plain, 3x1" Fisher Scientific 12-549
Dissecting with Fluorescence Microscope Nikon Instruments SMZ800
Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ645
Epifluorescent Microscope Nikon Instruments Model E-800
Filter Cube, GFP HYQ Endow Bandpass Chroma Technology Corp.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
  2. Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model. PNAS. 105, 728-733 (2008).
  3. Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
  4. Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. PNAS. 105, 145-150 (2008).
  5. Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. John Wiley and Sons. West Sussex, England. (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  7. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).

Comments

7 Comments

  1. Thank you for your research. My husband has Parkinson's. It's so good to know that young people are doing research which may ultimately help stem the onslaught of this disease, not in our lifetime, but perhaps in the near future. Where dŒs your study go from here? Good luck with your work. (reader from Vancouver, Canada)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 10, 2008 - 2:08 PM
  2. Hi I would like to know when you can view the GFP::Alpha Synuclein C. elegans? Also, dŒs the Alpha-synuclein slowly degenerate the neurons or dŒs it automatically degenerate them when the C. elegans are born? Do they have to be in the adult stage when viewed under the microscope?

    Reply
    Posted by: Hunter C.
    September 27, 2010 - 9:57 PM
  3. Oh wow, this is awesome.

    Reply
    Posted by: Dmitriy K.
    August 12, 2013 - 12:35 AM
  4. Hello! How does the GFP get viewed in the C. elegans? Is there a specific type of microscope needed or does the promoter of the gene need to be activated?

    Reply
    Posted by: Marilyn Z.
    January 25, 2014 - 1:25 AM
  5. Hi. 1) To view GFP you need a microscope equipped with special (UV) light and fluorescent filters to excite the GFP molecule and capture the emissions. 2) This is a biological question, not so much an equipment question. The power of GFP and similar fluorescent molecules is that as long as they are expressed in the cell that can be visualized by the proper type of microscope. The type of promoter they are fused to just directs the tissue and/or developmental time of expression in the animal. Depending on the type of promoter used it may or may not need to be activated. For example heat-shock promoters need to have the animal heated above normal temp to induce expression. Other promoters are constitutive, so they are active all the time.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    February 3, 2014 - 3:14 PM
  6. Oh, I see. Thank you!

    How fast is the GFP produced? (for example, if I have GFP expression in DAergic neurons and do something to increase DAergic activity, can I see the increase in GFP right after, or how long will I have to wait?) Thanks.

    Reply
    Posted by: Marilyn Z.
    February 18, 2014 - 4:34 PM
  7. Again, how "fast" the GFP is produced depends on the type of transcriptional promoter it is attached to. The dat-1 promoter we use is expressed in the dopaminergic neurons. Once those cells have differentiated, the promoter is functional and the GFP is then expressed. So there is no need to activate these neurons to see the GFP. However, in other systems, a promoter may need to be activated (like the heat-shock example described above) to allow it to express the GFP.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    February 19, 2014 - 11:49 AM

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