L'applicazione di una degenerazione C. elegans Dopamina Saggio Neuron per la convalida dei potenziali morbo di Parkinson geni

Published 7/18/2008
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Biology

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Summary

Questo video illustra come utilizzare C. elegans per valutare neurodegenerazione dei neuroni dopaminergici come modello per la malattia di Parkinson. Inoltre, gli schermi genetici sono usati per identificare i fattori che o migliorare la degenerazione o sono neuroprotettivi.

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Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes. J. Vis. Exp. (17), e835, doi:10.3791/835 (2008).

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Abstract

Miglioramenti per la diagnosi e il trattamento della malattia di Parkinson (PD) dipendono le conoscenze sui fattori di suscettibilità che rendono le popolazioni a rischio. Nel processo di tentare di identificare nuovi fattori genetici associati a PD, gli scienziati hanno generato molte liste di geni candidati, polimorfismi, e le proteine ​​che rappresentano importanti passi avanti, ma questi cavi rimangono meccanicisticamente indefinito. Il nostro lavoro si rivolge in modo significativo restringimento verso tali elenchi, sfruttando i vantaggi di un sistema semplice modello animale. Mentre gli esseri umani hanno miliardi di neuroni, il microscopico verme Caenorhabditis elegans ha precisamente 302, di cui solo otto producono dopamina (DA) in hemaphrodites. Espressione di un gene umano che codifica per il PD-proteina associata, l'alfa-sinucleina, in C. elegans DA risultati neuroni nel dosaggio e dipendente dall'età neurodegenerazione.

Worm che esprimono umano alfa-sinucleina nei neuroni DA vengono isogeniche ed esprimono sia la GFP e umano alfa-sinucleina sotto il promotore trasportatore DA (Pdat-1). La presenza di GFP serve come marcatore per seguire facilmente visualizzati neurodegenerazione DA in questi animali. Inizialmente abbiamo dimostrato che l'alfa-sinucleina indotta neurodegenerazione DA potrebbe essere salvato in questi animali da torsinA, una proteina con attività di chaperone molecolare 1. Inoltre, candidato PD-correlati geni identificati nel nostro laboratorio attraverso grandi sforzi di screening RNAi con un alfa-sinucleina saggio misfolding sono stati poi sovra-espresso in C. elegans DA neuroni. Abbiamo determinato che cinque dei sette geni testati rappresentato modulatori candidato significative del PD in quanto salvato alfa-sinucleina indotta DA neurodegenerazione 2. Inoltre, il Laboratorio Lindquist (questo numero di Giove) si è esibito schermi lievito per cui alfa-sinucleina-dipendente tossicità è usato come una lettura di geni che possono aumentare o sopprimere citotossicità. Abbiamo poi esaminato i geni di lievito candidato nel nostro C. elegans alfa-sinucleina indotta saggio neurodegenerazione e convalidato correttamente molti di questi obiettivi 3, 4.

La nostra metodologia prevede la generazione di C. elegans DA neurone specifico vettore di espressione tramite la clonazione di ricombinazione cDNA gene candidato sotto il controllo del Pdat-1 promotore. Questi plasmidi sono poi microiniettati nel wild-type (N2) vermi, insieme a un marcatore per la trasformazione di successo. Più linee transgeniche stabili produrre la proteina nei neuroni DA candidato si ottengono e poi attraversato in modo indipendente l'alfa-sinucleina ceppo degenerative e valutati per la neurodegenerazione, sia l'animale e il livello di singolo neurone, nel corso del tempo.

Protocol

A. Costruzione Espressione plasmidi

Due plasmidi sono obbligatori: uno per l'espressione tessuto-specifica del gene di interesse e un secondo come marcatore trasformazione selezionabili (anche se il marcatore plasmide è solitamente disponibile all'interno della comunità di ricerca).

Sperimentale plasmidi

  1. Selezionare un promotore che si esprime nel tessuto / cellula tipo di interesse, in questo caso, il trasportatore della DA (Pdat-1) promotore viene utilizzato. Questa espressione plasmide è stato creato come un gateway Invitrogen compatibili con il sistema vettoriale destinazione (pDEST-DAT-1) per consentire l'inserimento di un gene di interesse a valle del promotore di clonazione ricombinazione 1.
  2. Il cDNA del gene di interesse è amplificato mediante PCR utilizzando primers che contengono il Gateway att sequenza B ricombinazione. Il cDNA amplificato viene prima ricombinato in un vettore donatore pDONR201 per creare il vettore di ingresso e poi trasformato in DH5α ceppo di E. coli. A seguito di selezione dei ricombinanti successo e mini-prep isolamento del DNA, il vettore di ingresso viene ricombinato in pDEST-DAT-1 vettore di destinazione per creare il plasmide di espressione. Dettagli sulla clonazione ricombinazione sono disponibili sia dal manuale Gateway Invitrogen o in Caldwell et al. 5.

Marker selezionabile plasmidi

Un indicatore transgenico plasmide è costituito da un vettore con un promotore di guida l'espressione di una proteina fluorescente in un tessuto ovvio. In questa particolare procedura, l'unc-54 promotore unità espressione ciliegia proteina nel muscolo del corpo parete (Punc-54:: ciliegio).

B. Generazione di transgenici C. elegans tramite microiniezione

Vedi relativi JOVE articolo: http://www.jove.com/index/details.stp?ID=833

C. per l'analisi genetica attraversa neurodegenerazione DA

  1. I worm sono coltivati ​​utilizzando le procedure standard 6.
  2. Place 10 Pdat-1:: α-syn; Pdat-1:: GFP maschi 1, 2 su un piatto di accoppiamento con ermafroditi fase 3-4 L4 transgenici (che esprime Pdat-1:: X gene e Punc-54:: ciliegio) . Questo dovrebbe essere eseguito singolarmente per ciascuna delle tre linee separate stabile creato. Dopo due giorni, togliere i maschi.
  3. Ispezionare la generazione F1, se ci sono diversi progenie di sesso maschile, l'accoppiamento ha avuto successo.
  4. Clone fuori 5 ermafrodita L4 animali da ogni croce che presentano sia il Pdat-1:: marcatore fluorescente GFP (ereditato dal genitore di sesso maschile) e la Punc-54:: ciliegio muro marcatore fluorescente corpo muscolare (ereditati dal genitore ermafrodita). Gli animali clonati bisogno di essere in fase di L4 per garantire che non hanno ancora accoppiati con animali maschi presenti sulla piastra. Consentire loro di auto-cross e produrre progenie F2.
  5. Animali F2 prodotte in fase 3 vengono clonati fuori. In particolare, il trasferimento di animali ~ 5-10 che presentano entrambi i marcatori fluorescenti ai loro piatti individuali. Schermo la generazione F3 per piatti dove il 100% degli animali esprimere GFP in neuroni DA e alcuni degli animali sono espressi ciliegio nel corpo di cellule muscolari della parete. Questi animali saranno omozigoti per la Pdat-1:: α-syn; Pdat-1:: gene GFP mentre stabilmente la trasmissione del transgene appena creato (gene X).

D. dopaminergici Neuron Analisi

  1. Preparare un piatto fresco per ciascuna delle tre linee creato in precedenza, così come la Pdat-1:: α-syn; Pdat-1:: GFP solo ceppo. Permettere loro di crescere fino all'età adulta.
  2. Trasferimento 30-40 adulti transgenici da ogni riga su un piatto fresco. Permettere loro di porre embrioni per 4 ore a 20 ° C.
  3. Rimuovere gli adulti. Permettono di sviluppare gli embrioni per 3-4 giorni a 20 ° C fino a raggiungere la fase di L4.
  4. Scegli ~ 100 L4 animali transgenici per un piatto contenente 0,04 mg / ml di 5-fluoro-2'-deossiuridina (FUDR). Questo nucleotide sviluppo analogica blocchi della prossima generazione attraverso l'inibizione della sintesi del DNA, impedendo così la discendenza dalla travolgente animali da esperimento 7. Proteggere le piastre FUDR dalla luce in quanto è sensibile alla luce.
  5. Animali adulti saranno analizzati a diversi giorni dopo la deposizione delle uova. I giorni appropriato di analisi sono determinati empiricamente. Per esempio, abbiamo determinato che il 77%, 87% e il 90% del Pdat-1:: α-syn; Pdat-1:: GFP animali mostrano degenerato neuroni DA nei giorni 6, 7 e 10 di sviluppo post, rispettivamente. Pertanto, se si prevede che il transgene di interesse potrebbero aumentare neurodegenerazione, analizzeremo al giorno 6 e / o 7. Allo stesso modo, transgeni che potrebbero sopprimere neurodegenerazione saranno analizzati a giorni 7 e 10.
  6. Fai 4 pastiglie fresca agarosio (a differenza di pastiglie agar la microiniezione, questi vengono utilizzati freschi e non sono autorizzati ad asciugarsi). Ha definito due vetrini da microscopio che hanno un pezzo di nastro attraverso loro, il nastro serve come distanziatore per cuscinetti equivalente di spessore. Lay terzoscivolare tra di loro in panchina (sono posizionati tre al passo). Mettere una goccia di agarosio fuso sul vetrino centro e rapidamente porre un altro scivolo in cima alla agarosio, perpendicolare e in tutti e tre diapositive. Fare alcune pastiglie aggiuntive, lasciando i due scivoli insieme fino a quando il pad è pronto all'uso.
  7. Per analizzare verme neuroni DA, posto un calo del 6 ml di 3 levamisolo mM (un anestetico) su un x 22 30 mm di vetro di copertura. Scegli 40 animali adulti (10 in più oltre i 30 ad essere segnati) nella goccia, poi invertire il vetro di copertura sul pad agarosio. Ripetere per ciascuna delle altre linee.
  8. Punteggio 30 animali per riga per la presenza di ogni CEP e ADE neurone utilizzando un microscopio composto con epifluorescenza e un cubo filtro che permette la visualizzazione di FITC o GFP. Usiamo un Dotare GFP HYQ filtro cubo (la tecnologia Chroma). Registrare dati sul foglio di punteggio allegata. Wild-type animali mantiene fluorescenza GFP completa in tutti e 4 CEP e 2 neuroni ADE. Singoli animali presentano perdita di neuroni DA vengono segnati come non WT o di "degenerazione". Allo stesso modo, il grado di degenerazione può essere segnata contando i neuroni perdita totale di ogni animale e la popolazione.
  9. Ripetere l'analisi altre 2 volte (30 animali più per riga per ogni prova). Il numero totale di vermi espositrici wild-type neuroni DA dai tre turni di analisi è media. L'analisi statistica per la neuroprotezione viene eseguita utilizzando il t di Student-test (p <0,05) per confrontare i vermi di controllo (Pdat-1:: α-syn; Pdat-1:: GFP) con ceppi che l'eccesso di esprimere geni candidati nei neuroni DA .

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Discussion

L'età-dipendente la perdita dei neuroni dopaminergici è una caratteristica clinica del morbo di Parkinson ed è stata associata con l'accumulo o misfolding di una proteina chiamata alfa-sinucleina. Qui mostriamo come etichettare, attraverso un transgene fluorescente, i neuroni dopaminergici di C. elegans e imitare la neurodegenerazione nella malattia di Parkinson da coexpressing umano alfa-sinucleina in queste cellule.

Questo video illustra la metodologia per la crescita, incrocio genetico, montaggio, e il punteggio di nematodi transgenici per valutare i fattori genetici che o migliorare neurodegenerazione o fornire neuroprotezione nel corso dell'invecchiamento. Si ha cura di utilizzo di indicatori per la manutenzione transgene opportunamente messa in scena di sesso maschile e ermafroditi per assicurare il successo incroci genetici, e la coerenza nel notare la perdita dei neuroni o protezione. In questo modo, C. elegans facilita la rapida valutazione di fattori genetici e che possono contribuire alla neurodegenerazione o rappresentare bersagli terapeutici per migliorare la sopravvivenza dei neuroni.

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Acknowledgements

Vogliamo riconoscere lo spirito di cooperazione di tutti i membri Lab Caldwell. Disturbi del movimento di ricerca in laboratorio è stato sostenuto dalla Bachmann-Strauss Fondazione Parkinson e distonia, Regno Parkinson Foundation, American Parkinson Disease Association, il morbo di Parkinson Associazione dell'Alabama, Michael J. Fox Foundation for Parkinson Research, e una ricerca di laurea

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agarose Ultrapure Invitrogen 15510-027
Coverglass 20x30 mm Fisher Scientific 12-548-5A
Microscope Slides Plain, 3x1" Fisher Scientific 12-549
Dissecting with Fluorescence Microscope Nikon Instruments SMZ800
Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ645
Epifluorescent Microscope Nikon Instruments Model E-800
Filter Cube, GFP HYQ Endow Bandpass Chroma Technology Corp.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
  2. Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model. PNAS. 105, 728-733 (2008).
  3. Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
  4. Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. PNAS. 105, 145-150 (2008).
  5. Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. John Wiley and Sons. West Sussex, England. (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  7. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).

Comments

7 Comments

  1. Thank you for your research. My husband has Parkinson's. It's so good to know that young people are doing research which may ultimately help stem the onslaught of this disease, not in our lifetime, but perhaps in the near future. Where dŒs your study go from here? Good luck with your work. (reader from Vancouver, Canada)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 10, 2008 - 2:08 PM
  2. Hi I would like to know when you can view the GFP::Alpha Synuclein C. elegans? Also, dŒs the Alpha-synuclein slowly degenerate the neurons or dŒs it automatically degenerate them when the C. elegans are born? Do they have to be in the adult stage when viewed under the microscope?

    Reply
    Posted by: Hunter C.
    September 27, 2010 - 9:57 PM
  3. Oh wow, this is awesome.

    Reply
    Posted by: Dmitriy K.
    August 12, 2013 - 12:35 AM
  4. Hello! How does the GFP get viewed in the C. elegans? Is there a specific type of microscope needed or does the promoter of the gene need to be activated?

    Reply
    Posted by: Marilyn Z.
    January 25, 2014 - 1:25 AM
  5. Hi. 1) To view GFP you need a microscope equipped with special (UV) light and fluorescent filters to excite the GFP molecule and capture the emissions. 2) This is a biological question, not so much an equipment question. The power of GFP and similar fluorescent molecules is that as long as they are expressed in the cell that can be visualized by the proper type of microscope. The type of promoter they are fused to just directs the tissue and/or developmental time of expression in the animal. Depending on the type of promoter used it may or may not need to be activated. For example heat-shock promoters need to have the animal heated above normal temp to induce expression. Other promoters are constitutive, so they are active all the time.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    February 3, 2014 - 3:14 PM
  6. Oh, I see. Thank you!

    How fast is the GFP produced? (for example, if I have GFP expression in DAergic neurons and do something to increase DAergic activity, can I see the increase in GFP right after, or how long will I have to wait?) Thanks.

    Reply
    Posted by: Marilyn Z.
    February 18, 2014 - 4:34 PM
  7. Again, how "fast" the GFP is produced depends on the type of transcriptional promoter it is attached to. The dat-1 promoter we use is expressed in the dopaminergic neurons. Once those cells have differentiated, the promoter is functional and the GFP is then expressed. So there is no need to activate these neurons to see the GFP. However, in other systems, a promoter may need to be activated (like the heat-shock example described above) to allow it to express the GFP.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    February 19, 2014 - 11:49 AM

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