الجامعة جبل مزدوجة في الموقع التهجين لافراخ الدجاج في وقت مبكر

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

هذا الفيديو يوضح 2 لون جبل بأكمله في الموقع التهجين ، وهي الطريقة التي نمط التعبير المكاني والزماني لل2 جينات مختلفة يمكن تصور افراخ الدجاج في الشباب. وقدم أصلا من قبل هذه الطريقة ويلكنسون ديفيد ، هنريك دومينغوس ، إنجهام فيل وديفيد العش - Horowicz.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Psychoyos, D., Finnell, R. Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos. J. Vis. Exp. (20), e904, doi:10.3791/904 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الجنين الفرخ هو أداة قيمة في دراسة التطور الجنيني المبكر. شفافيته ، وسهولة الوصول وسهولة التلاعب ، وجعلها أداة مثالية لدراسة الجينات في الدماغ ، والأنبوب العصبي ، والقلب الجسيدة تشكيل primordia. هذا الفيديو يوضح الخطوات المختلفة في 2 لون جبل بأكمله في الموقع التهجين ؛ أولا ، يتم تشريح الجنين من بويضة والثابتة في بارافورمالدهيد. الثانية ، يتم معالجة الجنين للprehybridization. غير المهجنة ثم الجنين مع اثنين من تحقيقات مختلفة ، واحدة بالإضافة إلى حفر ، واحد بالإضافة إلى FITC. بعد التهجين بين عشية وضحاها ، وحضنت الجنين مع الأضداد مقرونة DIG. يتم تنفيذ رد فعل اللون لالركيزة DIG ، ومنطقة ذات الاهتمام يظهر اللون الأزرق. ومن ثم حضنت الجنين مع FITC الضد جانب. تتم معالجة الجنين للتفاعل مع اللون FITC ، ومنطقة ذات الاهتمام يظهر باللون الأحمر. أخيرا ، يتم إصلاح الجنين ومعالجتها للphtograph وsectioning. وتقدم أيضا دليلا المشاكل.

Protocol

الجزء 1 : تحديد الأجنة

  1. ملء طبق تشريح الجليد الباردة مع depc - PBS. تبقي على الجليد. فتح البيضة من خلال الاستفادة من قذيفة مع ملقط قطع وإزالة القشرة.
  2. إزالة ألبومين سميك بالملقط. إمالة الكيس المحي مع ملقط الجنين الخشنة بحيث تواجه صعودا.
  3. باستخدام مقص ، وقطع مربعة من الكيس المحي حول الجنين.
  4. باستخدام ملعقة ، وإزالة الجنين من صفار البيض وتوضع على الجليد الباردة depc - PBS.
  5. تحت المجهر ، وإزالة الأغشية وصفار البيض ونقل إلى صحن التثبيت.
  6. دبوس باستمرار ، وإزالة depc - PBS. استبدال PFA 4 ٪ في depc - PBS والإصلاح O / N عند 4 درجات مئوية.
  7. إزالة مثبت. استبدال الباردة الجليد depc - PBS. باستخدام إبرة حادة نهاية microcapillary أو سكين microdissection ، خرم الجهاز العصبي والقلب تجاويف ، لمنع محاصرة من التحقيق.
  8. غسل 2X 10 مليون depc - PBS بنسبة 0.1 ٪ توين - 20 (PBT). يذوى 10 دقيقة في كل من 25 ٪ و 50 ٪ و 75 ٪ في الميثانول PBT. يذوى الأجنة مرتين في الميثانول بنسبة 100 ٪. المحل في -20 درجة مئوية في الميثانول.

الجزء 2 : Prehybridization

  1. ترطيب الأجنة 10 دقيقة في كل من 75 ٪ و 50 ٪ و 25 ٪ في الميثانول PBT. غسل 2X 10 مليون في PBT.
  2. وفي الوقت نفسه ، تعد مثبت الجليد الباردة (4 ٪ في بارافورمالدهيد PBT). استبدال PBT مع الحل K بروتين (3 مل / فيال ؛ [؟ 5 غ / مل] النهائية في PBT). تأكد من أن يتعرض القارورة بالكامل إلى حل K بروتين من قبل المتداول بلطف القارورة ، وانظر لاستكشاف مرات التعرض.
  3. ريبونوكلياز مجانا باستخدام ماصة باستير إزالة بروتين كاف وإضافة تثبيتي (2 مل). المكان فورا على الجليد عن 20 دقيقة بالضبط.
  4. يتم تنفيذ كافة يغسل RT على nutator. غسل 2X 10 مليون في PBT ، و1X 10mn في PBT يحتوي على 50 ٪ العازلة التهجين.
  5. غسل 1X العازلة في التهجين. احتضان عند 65 درجة مئوية في 2 مل العازلة التهجين للساعة 4-5.

الجزء 3 : الأجنة يهجن مع تحقيقات

  1. ويوصف DIG FITC التوليف التحقيق يقترن في الملحق. لجنة التحقيق من المتوقع أن تعطي إشارة قوية ، ينبغي synhesized مع FITC المحتوية على النيوكليوتيدات ، وينبغي توليفها مع الأضعف التحقيق مع DIG المحتوية على النيوكليوتيدات.
  2. Prewarm تحقيقات في التهجين العازلة (500 نانوغرام / مل لكل منهما) باستخدام قارورة 2 مل. استبدال فورا العازلة التهجين مع الحل التحقيق. لا تدع الأجنة الجافة. احتضان لمدة 16 ساعة عند 65 درجة مئوية.
  3. محل التحقيق مع العازلة التهجين ، يغسل 2 ، 30 مليون في كل 65 درجة مئوية. غسل 15 مليون العازلة في التهجين / MABT (1 / 1 / V / V) عند 65 درجة مئوية.

الجزء 4 : DIG حضانة الأجسام المضادة والتفاعل اللون

  1. غسل 2x20 مليون في MABT. يغسل 1 ساعة 2 ٪ في ببر / MABT. يغسل 5 ساعة في 2 ٪ BBR/20 ٪ هيس / MABT (حظر العازلة). في احتضان الضد DIG 1:2000 مخففة في حجب العازلة ، O / N عند 4 درجات مئوية على nutator.
  2. غسل 3X 10 دقيقة في كل MABT و3X 1 ساعة في كل MABT.
  3. غسل 2X 20 دقيقة في NTMT. إضافة 200ul NBT / BCIP الركيزة لNTMT 10 مل. على الفور بإزالة NTMT من القارورة واستبدال 1-2 العازلة NBT / BCIP مل. تجري في الظلام. رصد رد فعل اللون بعد 20 دقيقة ، وبعد ذلك على فترات 20 دقيقة.
  4. بعد تفاعل الألوان (يجب أن يظهر اللون الأزرق) ، ويغسل في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة ، دبوس باستمرار على تثبيت صحن مليء برنامج تلفزيوني ، واستبدال الحل مع PFA 4 ٪ في برنامج تلفزيوني. الإصلاح O / N عند 4 درجات مئوية.
  5. نقل إلى قارورة التلألؤ جديدة. يغسل في PBST (PBS مع 1 ٪ توين - 20) مليون 2x10. يغسل في 10 دقيقة MABT 2X.
  6. احتضان MABT في 30 دقيقة في 63 درجة مئوية.

الجزء 5 : FITC حضانة الأجسام المضادة والتفاعل اللون

  1. غسل 2X 10 مليون في MABT ، 1 ساعة في 2 ٪ ببر / MABT ، 5 ساعة في حجب العازلة
  2. في احتضان الفوسفاتيز القلوية ، بالإضافة مكافحة FITC الضد جيم O / N عند 4 درجة (1:500)
  3. غسل 3X 10 دقيقة في كل MABT و3X 1 ساعة في كل MABT.
  4. يغسل في 2X 20 دقيقة في درجة الحموضة TBS 8.45 بنسبة 0.1 ٪ توين - 20 (TBST).
  5. إعداد ناقل الأحمر الحل العمل (5 مل) في TBST باستخدام الكواشف 1،2 و 3 الواردة في المجموعة. على الفور بإزالة TBST من قارورة واستبدالها مع العازلة الأحمر ناقل. تجري في الظلام. رصد رد فعل اللون بعد 40 دقيقة ، وعلى فترات 30 دقيقة بعد ذلك.
  6. بعد تفاعل الألوان (يجب أن يظهر اللون الأحمر) ونقل الأجنة في برنامج تلفزيوني.

الجزء 6 : التثبيت وتجهيز

  1. نقل لتثبيت صحن يحتوي على برنامج تلفزيوني ، والإصلاح في PFA 4 ٪ لمدة 20 دقيقة في RT أو O / N عند 4 درجات مئوية.
  2. يغسل في برنامج تلفزيوني ، 2X 10 مليون سهم. لعملية التصوير ، ونقل إلى الجلسرين 20 ٪ في برنامج تلفزيوني (وهذا سيجعل من أجنة شفافة). لإنشاء الغرفة ، وقطع الشريط 2 شرائح من البلاستيك ، ويطغى عليها على الشريحة. قطع مربعة في وسط باستخدام شفرة. إزالة مربع باستخدام ملقط.
  3. لعملية sectioning الشمع ، ونقل مرة أخرى إلى برنامج تلفزيوني ، وغسل 2X 10 دقيقة ، يذوى في سلسلة متدرجة من الميثانول (25 ٪ ، 50 ٪ ، 75 ٪ و 100 ٪ في برنامج تلفزيوني و 10 مليون لكل منهما).
  4. استبدال بروبانول ، 3mn. تليها 20 دقيقة مع استبدال tetrahydronaphthalene ، 1،2،3،4 ، التي Histoclear (2X 1 ساعة). استبدال histoclear / الشمع 1 / 1 (V / V) 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. استبدال بالشمع عمليةلعلم الأنسجة.

الجزء 7 : حلول

التهجين العازلة ، في مخزن -20 درجة مئوية في فالكون ، و 50 مل : 25 مل formamide ؛ 3.25 مل (20xSSC) 0.5 مل (0.5M EDTA) ؛ 1 مل (10 ٪ توين - 20) ؛ 2.5 مل (1 ٪ SDS) ؛ 125 UL (20mg/ml الحمض الريبي النووي النقال). 100ul (50 ملغ / مل الهيبارين) MABT ، وإعداد حمض المالئيك 100mM ؛ مع حبيبات هيدروكسيد الصوديوم الهيدروجيني إلى 7.5. إضافة 150mM كلوريد الصوديوم و 0.1 ٪ توين - 20.

NTMT (الذي فقط قبل الاستعمال) ، و 50 مل : 1ml (كلوريد الصوديوم 5M) 2.5 مل (2M - تريس pH9.5 حمض الهيدروكلوريك) 1.25 مل (2M MgCl 2) و 5 مل (10 ٪ توين - 20).

TBST : 0.1M تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، كلوريد الصوديوم 0.15M ، ودرجة الحموضة 8.45 ، 0.1 ٪ توين - 20.

الجزء 8 : استكشاف

مشكلة سبب علاج
كرة لولبية حتى الجنين عدم كفاية الجفاف / الإماهة الحفاظ على 10 مليون خلال فترات الجفاف الخطوات / الإماهة المتعاقبة
لا يوجد أي إشارة التحقيق المسبار المتدهورة ريبونوكلياز التلوث في قارورة تشغيل المسبار في 1 ٪ هلام Agarose تأكد من أن ما يتعرض له قارورة بأكمله إلى حل K بروتين في الخطوة 2
المسبار التسميات تجاويف القلب أنبوب العصبي تحبس التحقيق في الخطوة 2 ، تأكد من أن جميع التجاويف هي مثقوبة سكين microdissection به أو microcapillary
تفككت الجنين التهجين التالية (الخطوة 3) غادر بروتيناز K الخطوة طويلا تهجين درجة الحرارة مرتفعة جدا لا ينبغي أن يترك بروتيناز K أطول من 1mn (مراحل 3 + و 4) ، 2 مليون (المرحلة 5-7) ، و 3 مليون (المرحلة 8-10) ، و 4 مليون (المرحلة 11-13) لا يهجن س تي في أعلى من 65 درجة مئوية

الجزء 9 : النتائج الممثل

وترد الأجنة ممثل أدناه : (أ) هو المسمى الأجنة (المرحلة HH7) مع التحقيق الذي تجريه DIG - سوكس (الأزرق) وFITC دلتا - 1 التحقيق (الحمراء). (ب) هو المسمى الأجنة (المرحلة HH8) مع التحقيق الذي تجريه - DIG Pax6 (الأزرق) والتحقيق FITC - SHH (الحمراء). NF ، أضعاف العصبية والشرطة الوطنية الأفغانية ، لوحة العصبية الأمامي ، PSM ، presomitic الأديم المتوسط ​​، ن ، notochord ، NT ، الأنبوب العصبي). الهدايا المسبار من مختبرات الدكاترة. جيم تابين ، M. غولدنغ ، وهنريك دال ، وجيه بريسكو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويستخدم جبل 2 لون كله في أسلوب التهجين لتحديد الموقع على حد سواء الأنماط المكانية والزمانية في التعبير الجيني ، وذلك باستخدام واحد أو اثنين من الجينات في المصالح. وتشمل التطبيقات تقييم أنماط التعبير الجيني للجينات جديدة (مثلا 1،2 ، فضلا عن التغيرات في التعبير الجيني إهانة التالية (التلاعب الجنينية 3 ، 4 حبات ، وelectroporation من الحمض النووي الريبي DNA أو يبني 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة مارغريت Alkek M. إلى RHF.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Eggs Animal Charles River Laboratories Premium Fertile
Stereomicroscope Microscope Leica Microsystems MZ9.5
Marsh Automatic Incubator Tool Lyon RX
Hybridization Incubator Tool Hybaid Micro-4
Adams Nutator orbital mixer Tool Fisher Scientific 14-062
Curved Forceps (1) Tool Electron Microscopy Sciences 72991-4C
Fine scissors Tool Fine Science Tools 14161-10
Spoon Tool Fine Science Tools 10370-18
Pasteur Capillary Pipette Electron Microscopy Sciences 70950-12
Microcapillary tube Sigma-Aldrich P1049-1PAK Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps
Microdissecting knife Fine Science Tools 10056-12 Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam Fine Science Tools 26002-20 Keep pins together using a magnetic stirrer;
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base Reagent Dow Corning 0001986475 Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc) Reagent Acros Organics 10025025 Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave
16% PFA Reagent Electron Microscopy Sciences 15710
Tween-20 Reagent Sigma-Aldrich P1379-100ML
Proteinase K Sigma-Aldrich P2308-5MG Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C.
Formamide, deionized Reagent Ambion 9342
Yeast tRNA-25 mg Reagent Invitrogen 15401-011 Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C
Heparin Sodium salt Reagent Sigma-Aldrich H4784-250MG Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C.
SSC x20 pH5.5 Reagent Fisher Scientific PR-V4261
EDTA (0.5M) PR-V4231 Fisher Scientific
SDS Reagent Fisher Scientific BP166-100
Maleic acid Reagent Fluka 63189
B–hringer Blocking Reagent Reagent Roche Group 11096176001 Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C.
Heat inactivated sheep serum Reagent Jackson ImmunoResearch 013-000-121 Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C.
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Reagent Roche Group 11093274910
NBT/BCIP stock solution Reagent Roche Group 11681451001
Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments Reagent Roche Group 11426338910
2M Tris BP1759-500 Fisher Scientific
Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit Reagent Vector Laboratories SK-5100
1,2,3,4-tetrahydronaphthalene Reagent Sigma-Aldrich 429325-100ML Under hood

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
  2. Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
  3. Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
  4. Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
  5. Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).

Comments

1 Comment

  1. comment from author (DP): Pax6 expressed in neural folds and developing neural tube (Results section)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 28, 2008 - 10:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics