双整装原位杂交技术在早期鸡胚

Biology

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Summary

本视频演示了原位杂交的方法,其中2个不同的基因的时空表达模式可以在年轻的鸡胚显示2色整装。这种方法最初是由大卫威尔金森,多明戈斯恩里克,菲尔英厄姆和大卫ISH - Horowicz。

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Psychoyos, D., Finnell, R. Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos. J. Vis. Exp. (20), e904, doi:10.3791/904 (2008).

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Abstract

鸡胚是一个有价值的工具,在早期胚胎发育的研究。其透明度,可获得性和易于操纵,使其用于研究基因表达在脑,神经管,体节和心脏原基形成的理想工具。本视频演示了不同的步骤,在2色整装原位杂交;首先,胚胎从卵解剖和多聚甲醛固定。二,预杂交胚胎处理。具有两种不同的探针,再加上挖一个,并再加以FITC标记的杂交胚胎。杂交过夜后,胚胎培养与辛加上抗体。辛基板颜色反应的进行,和感兴趣的区域显示为蓝色。胚胎,然后加上与FITC标记抗体孵育。胚胎处理颜色用FITC反应,和感兴趣的区域显示为红色。最后,胚胎是固定的,为phtograph处理和切片。还介绍了故障排除指南。

Protocol

第1部分:固定的胚胎

  1. 填充与冰冷的DEPC - PBS清扫菜。置于冰上。打开用镊子轻敲壳蛋和删除壳件。
  2. 用镊子取出厚厚的白蛋白。卵黄囊倾斜粗钳,使胚胎朝上。
  3. 用剪刀,切割围绕胚胎的卵黄囊平方米。
  4. 使用勺子,取出胚胎从卵黄和冰冷的DEPC - PBS。
  5. 在显微镜下,删除膜和蛋黄,并转移到固定菜。
  6. 牵制,除去DEPC - PBS。 DEPC - PBS在4%煤灰更换和修复O / N在4 ° C。
  7. 删除固定液。更换与冰冷的DEPC - PBS。使用钝年底microcapillary针或显微切割刀,穿孔的神经系统和心腔,防止探头诱捕。
  8. 2X 10分钟DEPC - PBS洗0.1%Tween - 20的(PBT)的。脱水10分钟每25%,50%,75%甲醇在PBT。两次在100%甲醇脱水胚胎。在甲醇储存在-20 ° C。

第2部分:预杂交

  1. 补充水分胚胎75%,50%和25%甲醇在PBT中的每个10分钟。在PBT洗净2X 10分钟。
  2. 同时,准备冰冷的固定液(4%多聚甲醛在PBT)。替换蛋白酶K溶液(3毫升/瓶; [5克/毫升]最后在PBT)PBT。确保整个小瓶暴露蛋白酶K溶液轻轻滚动小瓶;故障排除的曝光时间。
  3. 使用核糖核酸免费巴斯德吸管删除蛋白酶K,添加固色剂(2毫升)。整整20分钟,立即放在冰上。
  4. 所有RT洗上nutator执行。洗2X 10分钟,在PBT和1x在PBT 10MN含有50%的杂交缓冲液。
  5. 在杂交缓冲液清洗1X。孵育65 °彗星在4-5小时的杂交缓冲液2毫升。

第3部分:与探针的杂交胚胎

  1. 挖掘和FITC耦合探针合成是在附录中描述。预计将提供一个强有力的信号探头,应synhesized FITC含核苷酸;较弱的探头应与辛含核苷酸合成。
  2. Prewarm探针在杂交缓冲液(500毫微克/毫升),使用2 ml小瓶。及时更换探头解决方案的杂交缓冲液。不要让胚胎干。孵育16小时,在65 ° C。
  3. 替换探针杂交缓冲液,2洗,30分钟在65 ° C。在杂交缓冲液/ MABT中清洗15分钟(1 / 1 V / V /)在65 ° C。

第4部分:辛抗体孵育和显色反应

  1. 洗净MABT 2X20万。在2%BBR / MABT清洗1小时。洗5小时,在2%BBR/20%HISS / MABT(封闭液)。孵育封闭液稀释1:2000辛抗体,O / N在4 °上nutator彗星。
  2. 洗3X 10分钟在MABT,3X MABT每1小时。
  3. 洗净NTMT 2X 20分钟。加入200ul NBT / BCIP底物10毫升NTMT。立即从小瓶NTMT和更换1-2毫升NBT / BCIP显缓冲区。在黑暗的地方。 20分钟后,显示器的色彩反应,并在此后每隔20分钟。
  4. 显色反应(应该出现蓝色),在PBS洗10分钟,针用PBS填充的固定菜,并取代与4%的PBS PFA解决方案。修正/ O在4 ° C。
  5. 转移到新的闪烁瓶中。 PBST洗涤(PBS 1%吐温20)2X10万。在MABT 2X 10分钟洗净。
  6. 在63 ° C,在MABT 30分钟的孵育

第5部分:FITC标记抗体孵育和显色反应

  1. 洗2倍的MABT 10分钟,1小时2%,5小时的封闭液BBR / MABT
  2. 孵育在碱性磷酸酶偶联抗FITC抗体(1:500)的O / 4个N ° C。
  3. 洗3X 10分钟在MABT,3X MABT每1小时。
  4. 在TBS的pH值8.45与0.1%Tween - 20的(TBST)2X 20分钟洗净。
  5. 准备在TBST使用试剂盒提供的试剂1,2和3的矢量红溶液(5毫升)。立即从小瓶TBST和替换矢量红缓冲区。在黑暗的地方。监控显色反应后40分钟,30分钟,其后每隔。
  6. 下列颜色反应(应该会出现红色),将胚胎转移,以PBS。

第6部分:固定和加工

  1. 转移到含PBS的固定菜,和4%PFA固定在室温或O / N为20分钟,在4 ° C。
  2. 在PBS,2个10分钟洗净。摄影过程中,转移至20%甘油的PBS(这将使半透明的胚胎)。要创建一个会议厅,切2条PVC胶带,幻灯片上叠加。切方在使用刀片中心。去掉方使用产钳。
  3. 蜡切片的过程中,转让,以PBS冲洗2X 10分钟,脱水甲醇梯度(25%,50%,75%和100%的PBS,每10分钟)。
  4. 丙醇,3MN更换。 1,2,3,4 - 四氢更换,20分钟之后Histoclear(2个1小时)。更换histoclear /蜡1 / 1(V / V)60 ° C时为1小时。替换一个过程蜡为组织学。

第7部分:解决方案

杂交缓冲液中,保存在-20 ° C的猎鹰,50毫升25毫升甲酰胺; 3.25毫升(20xSSC); 0.5毫升(0.5M EDTA); 1毫升(10%Tween - 20的); 2.5毫升(1%SDS) 125 UL(20mg/ml tRNA的); MABT 100ul(50毫克/毫升的肝素),准备100MM马来酸,pH值至7.5氢氧化钠颗粒。 150MM氯化钠和0.1%Tween - 20的。

NTMT(在使用前),50毫升:1毫升(5M氯化钠); 2.5毫升(2M的Tris - HCl pH9.5); 1.25毫升(2M氯化镁2); 5毫升(10%Tween - 20的)。

TBST:0.1M的Tris - HCl,pH值8.45,0.15米,氯化钠0.1%Tween - 20的。

第8部分:故障排除

问题原因补救
胚胎蜷缩脱水/补液不足维持在10分钟的间隔连续脱水/补液步骤
有没有探头的信号探头是退化RNase的污染小瓶 1%琼脂糖凝胶上运行的探头确保整个小瓶蛋白酶K溶液暴露在第2步
探头是标签的心腔神经管探头被困住在第2步,确保所有空腔穿孔采用显微切割刀或microcapillary
胚胎解体以下杂交(步骤3) 蛋白酶K一步离开太久杂交温度过高蛋白酶K不应该离开不再比1mn(阶段3和4),2分钟(第一阶段5至7),3分钟(8-10期),4分钟(第一阶段11-13)不要 T O杂交更高超过摄氏65

第9部分:代表结果

代表胚胎如下:(一)胚胎(阶段HH7),是标示与DIG - SOX探头(蓝色)和一个FITC -δ- 1的探头(红色)。 (二)胚胎(阶段HH8)都标有一挖,PAX6探头(蓝色)和FITC - SHH探头(红色)。 NF,神经倍,ANP,前神经板,PSM,presomitic中胚层,N,NT,脊索,神经管)。从博士实验室的探头礼物。 C.塔宾,古尔丁,D.恩里克,和J.布里斯科。

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Discussion

2色整装原位杂交方法是用来确定空间和时间的基因表达模式,使用一个或两个基因的兴趣。应用领域包括新基因的基因表达模式的评估 (如1,2,以及以下侮辱基因表达的变化(3 胚胎操作 ,珠4,RNA 或DNA电构造5)。

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Acknowledgements

这项工作是支持的玛格丽特M. Alkek基金会RHF。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Eggs Animal Charles River Laboratories Premium Fertile
Stereomicroscope Microscope Leica Microsystems MZ9.5
Marsh Automatic Incubator Tool Lyon RX
Hybridization Incubator Tool Hybaid Micro-4
Adams Nutator orbital mixer Tool Fisher Scientific 14-062
Curved Forceps (1) Tool Electron Microscopy Sciences 72991-4C
Fine scissors Tool Fine Science Tools 14161-10
Spoon Tool Fine Science Tools 10370-18
Pasteur Capillary Pipette Electron Microscopy Sciences 70950-12
Microcapillary tube Sigma-Aldrich P1049-1PAK Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps
Microdissecting knife Fine Science Tools 10056-12 Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam Fine Science Tools 26002-20 Keep pins together using a magnetic stirrer;
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base Reagent Dow Corning 0001986475 Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc) Reagent Acros Organics 10025025 Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave
16% PFA Reagent Electron Microscopy Sciences 15710
Tween-20 Reagent Sigma-Aldrich P1379-100ML
Proteinase K Sigma-Aldrich P2308-5MG Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C.
Formamide, deionized Reagent Ambion 9342
Yeast tRNA-25 mg Reagent Invitrogen 15401-011 Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C
Heparin Sodium salt Reagent Sigma-Aldrich H4784-250MG Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C.
SSC x20 pH5.5 Reagent Fisher Scientific PR-V4261
EDTA (0.5M) PR-V4231 Fisher Scientific
SDS Reagent Fisher Scientific BP166-100
Maleic acid Reagent Fluka 63189
B–hringer Blocking Reagent Reagent Roche Group 11096176001 Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C.
Heat inactivated sheep serum Reagent Jackson ImmunoResearch 013-000-121 Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C.
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Reagent Roche Group 11093274910
NBT/BCIP stock solution Reagent Roche Group 11681451001
Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments Reagent Roche Group 11426338910
2M Tris BP1759-500 Fisher Scientific
Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit Reagent Vector Laboratories SK-5100
1,2,3,4-tetrahydronaphthalene Reagent Sigma-Aldrich 429325-100ML Under hood

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
  2. Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
  3. Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
  4. Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
  5. Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).

Comments

1 Comment

  1. comment from author (DP): Pax6 expressed in neural folds and developing neural tube (Results section)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 28, 2008 - 10:34 AM

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