Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

Biology

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Summary

Este vídeo demonstra de 2 cores montar toda hibridização in situ, um método pelo qual o padrão de expressão espacial e temporal de 2 genes diferentes podem ser visualizados em embriões de galinha jovens. Este método foi originalmente introduzido por David Wilkinson, Henrique Domingos, Phil e David Ingham Ish-Horowicz.

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Psychoyos, D., Finnell, R. Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos. J. Vis. Exp. (20), e904, doi:10.3791/904 (2008).

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Abstract

O embrião de galinha é uma ferramenta valiosa no estudo do desenvolvimento embrionário precoce. Sua transparência, acessibilidade e facilidade de manipulação, torná-lo uma ferramenta ideal para estudar a expressão genética no cérebro, tubo neural, somito e formação de coração primórdios. Este vídeo demonstra as diferentes etapas em 2 cores montar toda a hibridização in situ; Primeiro, o embrião é dissecada do ovo e fixados em paraformaldeído. Em segundo lugar, o embrião é processada para prehybridization. O embrião é então hibridizado com duas sondas diferentes, um acoplado a DIG, e acoplado a um FITC. Após a hibridização durante a noite, o embrião é incubada com anticorpo acoplado DIG. Reação de cor para substrato DIG é realizada, ea região de interesse aparece em azul. O embrião é, então, incubadas com anticorpo acoplado FITC. O embrião é processado para reação de cor com FITC, ea região de interesse aparece em vermelho. Finalmente, o embrião é fixo e processados ​​para phtograph e corte. Um guia resolução de problemas também é apresentada.

Protocol

Parte 1: Corrigindo os embriões

  1. Preencha prato com dissecção gelada DEPC-PBS. Manter no gelo. Abra o ovo tocando no shell com uma pinça e remover peças de shell.
  2. Remover espessura albumina com uma pinça. Tilt saco vitelino com uma pinça grossa para que embrião voltado para cima.
  3. Com uma tesoura, corte um quadrado de saco vitelino em torno do embrião.
  4. Usando uma colher, retire embrião da gema e colocar no gelo frio DEPC-PBS.
  5. Sob o microscópio, retire as membranas e gema e transferência para prato de fixação.
  6. Pino para baixo, remova-DEPC PBS. Substituir por PFA 4% em PBS-DEPC e corrigir S / N, 4 ° C.
  7. Remover fixador. Substituir por gelada DEPC-PBS. Usando uma agulha fim blunt microcapilar ou uma faca microdissecção, perfurar o sistema nervoso e as cavidades do coração, para evitar aprisionamento de sonda.
  8. Lavar 2x 10 mn DEPC-PBS com 0,1% Tween-20 (PBT). Desidratar a 10 minutos cada em 25%, 50%, metanol 75% em PBT. Desidratar embriões duas vezes em metanol 100%. Armazenar a -20 ° C em metanol.

Parte 2: Prehybridization

  1. Reidratar embriões 10 minutos cada em 75%, 50% e metanol 25% em PBT. Lavar 2x 10 minutos em PBT.
  2. Enquanto isso, prepare fixador gelada (paraformaldeído 4% em PBT). Substituir PBT com proteinase K solução (3 ml / frasco; [? 5 g / ml] final em PBT). Certifique-se que o frasco inteiro é exposto à solução de proteinase K por suaves do frasco; consulte Solução de problemas para tempos de exposição.
  3. Usando RNase livre Pasteur pipeta, remova proteinase K e adicionar fixador (2 ml). Colocar imediatamente no gelo por exatamente 20 minutos.
  4. Todas as lavagens RT são executadas em nutator. Lavar 2x 10 minutos em PBT e PBT em 1x 10mn contendo tampão de hibridação de 50%.
  5. Lavar em 1x tampão de hibridação. Incubar a 65 ° C em tampão de hibridação 2 ml por 4-5 hr.

Parte 3: embriões híbridos com sondas

  1. DIG e FITC síntese sonda acoplada é descrito no apêndice. A sonda deverá dar um sinal forte, deve ser synhesized com FITC contendo nucleotídeos, o mais fraco sonda deve ser sintetizado com a DIG contendo nucleotídeos.
  2. Pré-aquecer as sondas em tampão de hibridação (500 ng / ml cada) usando um frasco de 2 ml. Prontamente substituir o tampão de hibridação com a solução de sonda. Não deixe que os embriões seco. Incubar por 16 horas a 65 ° C.
  3. Substituir sonda com tampão de hibridação, 2 lavagens, 30 min cada a 65 ° C. Lavar 15 minutos em tampão de hibridação / injuded (01/01 v / v /) a 65 ° C.

Parte 4: DIG de incubação de anticorpos e cor reação

  1. Lavar 2x20 mn em injuded. Lave 1 hr em 2% BBR / injuded. Lavar 5 horas em 2% BBR/20% HISS / injuded (tampão de bloqueio). Incubar em 1:2000 do anticorpo DIG diluído em tampão de bloqueio, O / N, 4 ° C em nutator.
  2. Lavar 3x 10 minutos cada um em injuded, e 1 hora cada em 3x injuded.
  3. Lavar 2x 20 mn em NTMT. Adicionar 200ul substrato NBT / BCIP a 10 NTMT ml. Remover imediatamente NTMT do frasco e substituir com 1-2 ml de tampão NBT / BCIP. Lugar no escuro. Monitorar a reação de cor depois de 20 mn, e em intervalos de 20 min depois.
  4. Após a reação de cor (deve aparecer azul), lavar em PBS durante 10 mn, o pino para baixo no prato de fixação preenchido com PBS, e substituir solução com PFA 4% em PBS. Fix O / N a 4 ° C.
  5. Transferir para frasco de cintilação novo. Lave em PBST (PBS com 1% Tween-20) 2x10 mn. Lave em injuded 2x 10 minutos.
  6. Incubar em injuded 30 mn a 63 ° C.

Parte 5: a incubação do anticorpo FITC e cor reação

  1. Lavar 2x 10 minutos em injuded, 1 hr em 2% BBR / injuded, 5 hr em tampão de bloqueio
  2. Incubar em fosfatase alcalina anti-coupled-FITC-anticorpos (1:500) O / N a 4 ° C.
  3. Lavar 3x 10 minutos cada um em injuded, e 1 hora cada em 3x injuded.
  4. Lave em 2x 20 minutos em TBS pH 8,45 com 0,1% Tween-20 (TBST).
  5. Preparar a solução Vector Vermelha de trabalho (5 ml) em TBST utilizando reagentes 1,2 e 3 incluída no kit. Remover imediatamente TBST do frasco e substituir com Vector tampão Vermelho. Lugar no escuro. Monitorar a reação de cor depois de 40 mn, e intervalos de 30 min depois.
  6. Reação de cor seguinte (deve aparecer em vermelho), os embriões transferidos para PBS.

Parte 6: Fixação e processamento

  1. Transferência para o prato de fixação contendo PBS, e fixar em PFA 4% por 20 min em temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C.
  2. Lavar em PBS, 2x 10 minutos. Ao processo para a fotografia, a transferência para glicerol 20% em PBS (isto fará com que os embriões translúcido). Para criar uma câmara, corte duas tiras de fita PVC, sobrepô-las em slide. Corte um quadrado no centro usando uma lâmina. Remova a pinça quadrada usando.
  3. Ao processo de corte de cera, a transferência de volta para PBS, lave 2x 10 minutos, desidratar em série graduada de metanol (25%, 50%, 75% e 100% em PBS, a 10 minutos cada).
  4. Substituir com propanol, 3mn. Substituir com 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene, 20 mn seguido por Histoclear (2x 1 hr). Substituir com histoclear / cera 01/01 (v / v) 60 ° C por 1 hora. Substituir por um processo de cerapara histologia.

Parte 7: Soluções

Tampão de hibridação loja, a -20 ° C no Falcon, 50 ml: 25 ml formamida; 3,25 ml (20xSSC), 0,5 ml (EDTA 0,5 M); 1 ml (10% Tween-20), 2,5 ml (1% SDS) ; 125 ul (20mg/ml tRNA);. 100ul (50 heparina mg / ml) injuded, prepare ácido maleico 100mM, pH para 7,5 com NaOH pellets. Adicionar 150mm NaCl e 0,1% Tween-20.

NTMT (feito um pouco antes de usar), 50 ml: 1 ml (NaCl 5M), 2,5 ml (2M Tris-HCl pH9.5); 1,25 ml (2M MgCl 2), 5 ml (10% Tween-20).

TBST: 0,1 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl, pH 8,45, 0,1% Tween-20.

Parte 8: Resolução de problemas

Problema Causa Remédio
Embrião é enrolado Desidratação insuficiente / reidratação Manter intervalos de 10 min durante sucessivos de desidratação / reidratação passos
Não há nenhum sinal de sonda Sonda é a contaminação RNase degradadas em frasco Executar sonda em 1% gel Agarose Certifique-se que o frasco inteiro é exposto a solução de proteinase K no passo 2
Sonda é etiquetas cavidades do coração de um tubo neural Sonda é preso No passo 2, certifique-se que todas as cavidades são faca microdissecção perfurado usando ou microcapilar
Embrião se desintegrou hibridização seguinte (passo 3) Proteinase K passo esquerdo temperatura de hibridação muito longo é muito alta Proteinase K não deve ser deixado mais tempo do que 1mn (estágios 3 e 4 +), 2 mn (estágio 5 a 7), 3 mn (fase 10/08), 4 mn (etapa 11-13) Não hibridizam em T o maior de 65 o C

Parte 9: Resultados Representante

Embriões representativos são mostrados abaixo: (A) Embrião (estágio HH7) é marcado com uma sonda DIG-Sox (azul) e uma FITC-delta-1 sonda (vermelho). (B) Embrião (estágio HH8) é marcado com uma sonda DIG-Pax6 (azul) e uma sonda FITC-Shh (vermelho). Nf, neural dobra, anp, placa neural anterior, psm, mesoderma presomitic, n, notocorda, nt, tubo neural). Sonda presentes dos laboratórios dos Drs.. C. Tabin, M. Goulding, D. Henrique, e J. Briscoe.

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Discussion

A montagem de 2 cores em todo método de hibridização in situ é usado para determinar os padrões espaciais e temporais da expressão gênica, usando um ou dois genes de interesse. As aplicações incluem análise de padrões de expressão gênica de genes novos (por exemplo, 1,2, assim como mudanças na expressão gênica insulto seguinte (manipulações embrionárias 3, 4 contas, e eletroporação de RNA ou DNA construções 5).

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Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pela M. Margaret Alkek Fundação RHF.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Eggs Animal Charles River Laboratories Premium Fertile
Stereomicroscope Microscope Leica Microsystems MZ9.5
Marsh Automatic Incubator Tool Lyon RX
Hybridization Incubator Tool Hybaid Micro-4
Adams Nutator orbital mixer Tool Fisher Scientific 14-062
Curved Forceps (1) Tool Electron Microscopy Sciences 72991-4C
Fine scissors Tool Fine Science Tools 14161-10
Spoon Tool Fine Science Tools 10370-18
Pasteur Capillary Pipette Electron Microscopy Sciences 70950-12
Microcapillary tube Sigma-Aldrich P1049-1PAK Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps
Microdissecting knife Fine Science Tools 10056-12 Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam Fine Science Tools 26002-20 Keep pins together using a magnetic stirrer;
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base Reagent Dow Corning 0001986475 Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc) Reagent Acros Organics 10025025 Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave
16% PFA Reagent Electron Microscopy Sciences 15710
Tween-20 Reagent Sigma-Aldrich P1379-100ML
Proteinase K Sigma-Aldrich P2308-5MG Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C.
Formamide, deionized Reagent Ambion 9342
Yeast tRNA-25 mg Reagent Invitrogen 15401-011 Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C
Heparin Sodium salt Reagent Sigma-Aldrich H4784-250MG Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C.
SSC x20 pH5.5 Reagent Fisher Scientific PR-V4261
EDTA (0.5M) PR-V4231 Fisher Scientific
SDS Reagent Fisher Scientific BP166-100
Maleic acid Reagent Fluka 63189
B–hringer Blocking Reagent Reagent Roche Group 11096176001 Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C.
Heat inactivated sheep serum Reagent Jackson ImmunoResearch 013-000-121 Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C.
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Reagent Roche Group 11093274910
NBT/BCIP stock solution Reagent Roche Group 11681451001
Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments Reagent Roche Group 11426338910
2M Tris BP1759-500 Fisher Scientific
Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit Reagent Vector Laboratories SK-5100
1,2,3,4-tetrahydronaphthalene Reagent Sigma-Aldrich 429325-100ML Under hood

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References

  1. Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
  2. Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
  3. Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
  4. Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
  5. Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).

Comments

1 Comment

  1. comment from author (DP): Pax6 expressed in neural folds and developing neural tube (Results section)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 28, 2008 - 10:34 AM

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