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Behavior

भ्रूण Microinjection और नॉकआउट उत्परिवर्ती CRISPR / Cas9 जीनोम-संपादित हेलिकोवेर्पा Armigera (Hübner) की पहचान

Published: July 1, 2021 doi: 10.3791/62068
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 1, 1, 2,3
1School of Chemical and Environmental Engineering, China University of Mining and Technology, 2State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, 3Guangdong Laboratory of Lingnan Modern Agriculture, Shenzhen; Agricultural Genomics Institute at Shenzhen, Chinese Academy of Agricultural Sciences

Summary

यहाँ प्रस्तुत हेलिकोवेर्पा armigera (Hübner) भ्रूण microinjection और नॉकआउट उत्परिवर्ती पहचान CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन द्वारा बनाई गई पहचान का एक प्रोटोकॉल है। उत्परिवर्ती कीड़े जीन समारोह और विवो में विभिन्न जीनों के बीच बातचीत के आगे के शोध को सक्षम करते हैं।

Abstract

कपास बॉलवर्म, हेलिकोवेर्पा आर्मिगेरा, दुनिया में सबसे विनाशकारी कीटों में से एक है। आणविक आनुवांशिकी, शरीर विज्ञान, कार्यात्मक जीनोमिक्स और व्यवहार अध्ययनों के संयोजन ने एच. आर्मिगेरा को लेपिडोप्टेरा नोक्टुइडी में एक मॉडल प्रजाति बना दिया है। विभिन्न जीनों के इन विवो कार्यों और उनके बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए, क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स (CRISPR)/ संबद्ध प्रोटीन 9 (Cas9) जीनोम संपादन तकनीक कार्यात्मक जीनोमिक अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली एक सुविधाजनक और प्रभावी विधि है। इस अध्ययन में, हम CRISPR / Cas9 प्रणाली का उपयोग करके H. armigera में जीन नॉकआउट को पूरा करने के लिए एक चरण-दर-चरण व्यवस्थित विधि प्रदान करते हैं। गाइड आरएनए (जीआरएनए) के डिजाइन और संश्लेषण का विस्तार से वर्णन किया गया है। फिर, गाइड आरएनए (जीआरएनए) निर्माण, भ्रूण संग्रह, माइक्रोइंजेक्शन, कीट पालन और उत्परिवर्ती का पता लगाने के लिए जीन-विशिष्ट प्राइमर डिजाइन से युक्त बाद के चरणों को संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। अंत में, जीन संपादन की दक्षता में सुधार करने के लिए समस्या निवारण सलाह और नोट्स प्रदान किए जाते हैं। हमारी विधि CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन के आवेदन के लिए एक संदर्भ के रूप में काम करेगी एच armigera के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य Lepidopteran पतंगों में.

Introduction

जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी का अनुप्रयोग विभिन्न प्रजातियों में लक्ष्य-जीन उत्परिवर्ती प्राप्त करने के लिए एक कुशल उपकरण प्रदान करता है। Clustered नियमित रूप से interspaced लघु palindromic दोहराता है (CRISPR)/ संबद्ध प्रोटीन 9 (Cas9) प्रणाली का उद्भव जीनोम 1 में हेरफेर करने के लिए एक उपन्यास विधि प्रदान करता है। CRISPR /Cas9 प्रणाली में एक गाइड आरएनए (gRNA) और Cas9 endonuclease2,3 शामिल हैं, जबकि gRNA को आगे दो भागों में विभाजित किया जा सकता है, एक लक्ष्य पूरक CRISPR RNA (crRNA) और एक ट्रांस-एक्टिवेटिंग crRNA (tracrRNA)। GRNA Cas9 एंडोन्यूक्लिएज के साथ एकीकृत होता है और एक राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (RNP) बनाता है। GRNA के साथ, Cas9 एंडोन्यूक्लिएज को आधार पूरकता के माध्यम से जीनोम की एक विशिष्ट साइट पर निर्देशित किया जा सकता है। Cas9 के RuvC और HNH डोमेन प्रोटोस्पेसर-आसन्न आकृति (PAM) अनुक्रम से पहले जीनोम तीन आधारों के लक्ष्य स्थल को क्लीव करते हैं और एक डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (DSB) बनाते हैं। डीएनए दरार को तब दो तंत्रों के माध्यम से मरम्मत की जा सकती है, गैर-होमोलोगस एंड जॉइनिंग (एनएचईजे) या होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) 4। डीएसबी की मरम्मत लक्षित जीन को निष्क्रिय करने के तरीके के रूप में सम्मिलन या विलोपन का परिचय देती है, संभावित रूप से जीन फ़ंक्शन का पूरा नुकसान पैदा करती है। इसलिए, CRISPR / Cas9 प्रणाली की तर्कसंगत और विशिष्टता इसे विवो में जीन कार्यों को चिह्नित करने और जीन इंटरैक्शन 5 का विश्लेषण करने के लिए एक मजबूत विधि बनाती है।

कई गुणों के साथ, CRISPR / Cas9 प्रणाली को बायोमेडिसिन 6,7, जीन थेरेपी 8,9, और कृषि 10,11,12 सहित विभिन्न क्षेत्रों में लागू किया गया है, और सूक्ष्मजीवों 13, पौधों 14,15, नेमाटोड 16 और स्तनधारियों सहित विभिन्न जैविक प्रणालियों के लिए उपयोग किया गया है। . अकशेरुकी में, कई कीट प्रजातियों को CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन के अधीन किया गया है, जैसे कि फल मक्खी ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर और 18,19,20,21,22 से परे।

हेलिकोर्पा आर्मिगेरा दुनिया भर में सबसे विनाशकारी कीटों में से एक है23, और कपास, सोयाबीन और ज्वार 24,25 सहित कई फसलों को नुकसान पहुंचाता है। अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के विकास के साथ, एच आर्मिगेरा के जीनोम, साथ ही साथ लेपिडोप्टेरा कीट प्रजातियों की एक श्रृंखला को पूरी तरह से अनुक्रमित किया गया है26,27,28,29। हाल के वर्षों में इन कीड़ों से बड़ी संख्या में प्रतिरोध और घ्राण रिसेप्टर जीन की पहचान की गई है और उनकी विशेषता है19,27,28,29। कुछ प्रतिरोध से संबंधित जीनों की पहचान एच आर्मिगेरा में की गई है, जैसे कि कैडरिन 30 के लिए एन्कोडिंग जीन, एक एटीपी-बाइंडिंग कैसेट ट्रांसपोर्टर 31,32, साथ ही साथ HaTSPAN133। CRISPR / Cas9 प्रौद्योगिकी का उपयोग करके इन जीनों के नॉकआउट के परिणामस्वरूप अतिसंवेदनशील उपभेदों में बैसिलस थुरिंगेनेसिस (बीटी) विष के लिए प्रतिरोध का एक उच्च स्तर होता है। इसके अलावा, चांग एट अल (2017) ने एक फेरोमोन रिसेप्टर को खटखटाया, जिसने संभोग समय विनियमन 19 में अपने महत्वपूर्ण कार्य को मान्य किया। इन रिपोर्टों से पता चलता है कि CRISPR / Cas9 कीट प्रणालियों में विवो में जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी उपकरण के रूप में कार्य कर सकता है। हालांकि, कीट प्रणालियों में CRISPR / Cas9 संशोधन के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया अधूरी बनी हुई है, जो कीट कार्यात्मक जीनोमिक्स में इसकी आवेदन सीमा को सीमित करती है।

यहां, हम CRISPR / Cas9 प्रणाली का उपयोग करके H. armigera में एक कार्यात्मक जीन को खटखटाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है, जिसमें जीआरएनए उत्पादन, भ्रूण संग्रह, माइक्रोइंजेक्शन, कीट पालन और उत्परिवर्ती पहचान के लिए जीन-विशिष्ट प्राइमरों के डिजाइन और तैयारी शामिल हैं। यह प्रोटोकॉल एच. आर्मिगेरा में किसी भी कार्यात्मक जीन में हेरफेर करने के लिए एक मूल्यवान संदर्भ के रूप में कार्य करता है और इसे अन्य लेपिडोप्टेरा प्रजातियों तक बढ़ाया जा सकता है।

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Protocol

1. जीन-विशिष्ट प्राइमरों का डिजाइन और एसजीआरएनए की तैयारी

  1. पीसीआर प्रवर्धन और अनुक्रमण विश्लेषण के माध्यम से ब्याज के जीन में एक संरक्षित जीनोमिक क्षेत्र को सत्यापित करें। एच armigera के जीनोम डीएनए से लक्ष्य जीन को बढ़ाने और exons और introns भेद.
    नोट:: ऑफ-टारगेट जीन संपादन से बचने के लिए गाइड साइट की अनुक्रम विशिष्टता आवश्यक है। एक्सोन में संभावित गाइड साइटों को खोजना जीन के 5 'यूटीआर के करीब है। फिर, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि जीन पूरी तरह से गैर-कार्यात्मक है। एसजीआरएनए की तैयारी के लिए प्रवाह पथ का सारांश चित्र 1 में दर्शाया गया है।
  2. SGRNA लक्ष्य चुनें. CRISPR ऑनलाइन वेबसाइट CRISPOR (संस्करण 4.97) (http://crispor.tefor.net/crispor.py) का उपयोग जीन के 5 'UTR के करीब exons में संभावित गाइड साइटों के लिए खोज करने के लिए। टेक्स्टबॉक्स में एक्सोन अनुक्रम इनपुट करें और हेलिकोवेर्पा आर्मिगेरा (Harm_1.0) के लिए लक्ष्य जीनोम का चयन करें। "20 bp-NGG" के प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (PAM) विकल्प चुनें और वेबसाइटों के उपयोगकर्ता मैनुअल के अनुसार डिफ़ॉल्ट पैरामीटर पर अन्य सेटिंग्स छोड़ दें।
  3. सॉफ़्टवेयर से अनुमानित गाइड अनुक्रमों की तुलना करें और संपादन दक्षता में सुधार करने और ऑफ-टारगेट संपादन को कम करने के लिए उच्चतम अनुमानित दक्षता और सबसे कम बेमेल के साथ गाइड अनुक्रम चुनें। 5 'यूटीआर पर एक या दो जी युक्त एक 20 बीपी गाइड अनुक्रम की सिफारिश की जाती है क्योंकि यह काटने की दक्षता को बढ़ा सकता है।
    नोट:: एक्सन-क्षेत्रों में gRNas की एक जोड़ी भी एक बड़े खंड विलोपन, जो बाद के चरणों में उत्परिवर्ती का पता लगाने को सरल बनाता है प्राप्त करने के लिए अनुशंसित हैं। सुनिश्चित करें कि दो चयनित गाइड अनुक्रमों के बीच रिक्ति दूरी कम से कम 100 बीपी है। इस प्रोटोकॉल में, हम आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले SpCas9 प्रोटीन का चयन करते हैं, जो एनजीजी आकृति को पहचानता है। निर्माता के निर्देश के अनुसार, टी 7 प्रमोटर को चुनते समय जी की कमी वाला गाइड अनुक्रम भी स्वीकार्य है क्योंकि प्रमोटर अनुक्रम के 5 'यूटीआर में एक जी जोड़ता है।
  4. डिजाइन आगे और रिवर्स oligonucleotides. अनुक्रम क्रम को 5'-20 bp गाइड अनुक्रम-NGG-3' पर सेट करें और रिवर्स गाइड अनुक्रम के पूरक हैं। GRNA संश्लेषण किट के उपयोगकर्ता गाइड के अनुसार क्रमशः आगे और रिवर्स स्ट्रैंड गाइड अनुक्रम में T7 प्रमोटर अनुक्रम जोड़ें।
    नोट: PAM अनुक्रम NGG को ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड अनुक्रम से बाहर रखा जाना चाहिए।
  5. gRNA संश्लेषण किट का उपयोग करके sgRNA उत्पन्न करें। इस प्रक्रिया में तीन चरण शामिल हैं: डीएनए टेम्पलेट असेंबली, इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन, और एसजीआरएनए का शुद्धिकरण (चित्रा 2)। उपयोगकर्ता निर्देशों के अनुसार प्रत्येक चरण निष्पादित करें।

2. भ्रूण की तैयारी और संग्रह

  1. Hongtao et al.34 द्वारा वर्णित के रूप में अलग-अलग नर और मादा प्यूपे और उन्हें दो अलग-अलग नेट पिंजरों में अलग करें। eclosion के बाद, उन्हें एक पेट्री डिश में अवशोषक कपास में 10% (डब्ल्यू / वी) सफेद चीनी समाधान के ~ 30 मिलीलीटर खिलाएं।
    नोट: 10% (डब्ल्यू / वी) सफेद चीनी समाधान तैयार करने के लिए 30 मिलीलीटर बाँझ पानी में 3 ग्राम सफेद चीनी को भंग कर दिया गया था।
  2. क्रमशः 3-दिन-पुराने पुरुषों और 2-दिन-पुरानी महिलाओं से 50 स्वस्थ व्यक्तियों का चयन करें, और उन्हें एक साफ नेट पिंजरे में मिलाएं। 10% (w/v) चीनी के घोल वाले कपास के एक टुकड़े को पिंजरे में रखें और कपास को नम रखें। धुंध के साथ शुद्ध पिंजरों को कवर करें और एक रबर बैंड के साथ धुंध को ठीक करें। नम रखने के लिए धुंध पर पानी स्प्रे करें।
  3. चरण 2 में चयनित नर और मादा पतंगों को पूरी तरह से संभोग करने और अंडे देने की मात्रा का निरीक्षण करने की अनुमति दें।
    नोट: H. armigera के oviposition का शिखर 9:00 p.m के बाद प्रकट होता है। इसलिए, संभोग के समय पर विचार किया जाना चाहिए ताकि बाद के चरणों में पर्याप्त संख्या में अंडे सुनिश्चित किए जा सकें। Oviposition के चरम पर, एक काले कपड़े के साथ धुंध को बदलें और 30 मिनट के लिए मुफ्त oviposition सक्षम करें। ताजा अंडे एकत्र करने के लिए हर 30 मिनट में काले कपड़े को बदलें (चित्रा 3 ए)।
  4. काले कपड़े को लगभग 3 मिमी के आकार के साथ अनियमित आकार के पैच में काट लें। प्रत्येक पैच पर अधिक अंडे सुनिश्चित करें।
    नोट: झुर्रीदार अंडे चुनने से बचें क्योंकि वे आमतौर पर अनफर्टिलाइज्ड होते हैं।
  5. माइक्रोस्कोप स्लाइड (25 मिमी x 75 मिमी) (चित्रा 3 बी) पर डबल-साइडेड टेप चिपकाएं। संदंश का उपयोग करके, दो तरफा टेप की सतह पर एक पंक्ति में अंडे के साथ पैच पेस्ट करें। यह सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक पैच के मार्जिन को दबाएं कि वे टेप से दृढ़ता से चिपके रहें। माइक्रोस्कोप स्लाइड प्रति 50-100 अंडे ले लीजिए (चित्रा 3 सी)।
    नोट: पैच को डबल-साइडेड टेप की पूरी सतह को कवर करने की आवश्यकता होती है, अन्यथा हैचिंग लार्वा को रेंगने में कठिनाई होगी।
  6. माइक्रोइंजेक्शन से पहले, भ्रूण के विकास में देरी करने के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड को बर्फ पर रखें।

3. भ्रूण के microinjection

  1. एक माइक्रोपिपेट खींचने वाले (चित्रा 4 ए) का उपयोग करके एक केशिका ग्लास खींचकर सुई तैयार करें। 540 के लिए हीट सेट करें, 80 पर पुल , 75 के लिए वेल , 170 के लिए समय , और 450 के लिए दबाव । एक माइक्रो चक्की का उपयोग कर सुई की नोक जमीन. आदर्श सुई एक तेज धार वाली नोक दिखाती है (चित्रा 4 बी)।
  2. इंजेक्शन समाधान की तैयारी. 10 μL आयतन मिश्रण प्राप्त करने के लिए एक पीसीआर ट्यूब में RNase-मुक्त पानी में वाणिज्यिक Cas9 प्रोटीन (1 mg / mL) और sgRNA (300-500 ng / μL अंतिम एकाग्रता) के 2 μL जोड़ें। एसजीआरएनए की मात्रा इसकी एकाग्रता पर निर्भर करती है। पिपेटिंग करके अच्छी तरह मिलाएं और इसे बर्फ पर रखें।
    नोट:: सभी पिपेट युक्तियाँ और PCR इस चरण में उपयोग की गई ट्यूब RNase मुक्त हैं।
  3. इलेक्ट्रॉनिक microinjector के पैरामीटर सेट करें। इंजेक्शन दबाव (pi) को 1,500 hPa पर सेट करें, इंजेक्शन का समय (ti) 0.1 s तक, और मुआवजे का दबाव (पीसी) 30 hPa पर।
  4. एक माइक्रो लोडर पिपेट टिप का उपयोग करके एक सुई में मिश्रण के 2 μL लोड करें। सुई की नोक में अवशिष्ट हवा को जितना संभव हो उतना समाप्त किया जाना चाहिए।
  5. इंजेक्शन सुई को माइक्रोमैनिपुलेटर से कनेक्ट करें और दो भागों के बीच एक तंग कनेक्शन सुनिश्चित करें।
  6. एक पेट्री डिश (100 मिमी) में एक स्लाइड रखें और उन्हें माइक्रोस्कोप (चित्रा 5 ए) के चरण पर रखें।
  7. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत सुई की नोक की स्थिति को समायोजित करें जब तक कि सुई की नोक और भ्रूण दोनों माइक्रोस्कोप के नीचे दिखाई न दें (चित्रा 5 बी)।
  8. ड्रॉपलेट की मात्रा को समायोजित करें। पेडल दबाएं और सुई की नोक पर तरल बूंद का निरीक्षण करें। माइक्रोइंजेक्टर के इंजेक्शन दबाव को समायोजित करें जब तक कि तरल बूंद की मात्रा भ्रूण की मात्रा का लगभग दसवां हिस्सा न हो।
    नोट: इंजेक्शन सुई की गुणवत्ता भ्रूण के जीवित रहने की दर के लिए महत्वपूर्ण है।
  9. ध्यान से एक 45 डिग्री कोण (चित्रा 5 सी) पर एक भ्रूण के शीर्ष गोलार्ध में सुई की नोक डालें। मिश्रण को भ्रूण में पहुंचाने के लिए पेडल दबाएं। इंजेक्शन से भ्रूण का थोड़ा विस्तार होता है। भ्रूण से सुई को तुरंत वापस लें और पेट्री डिश को एक हाथ से तब तक ले जाएं जब तक कि अगला भ्रूण सुई के निकटता में न हो जाए और उसी प्रक्रिया के साथ अगले भ्रूण को इंजेक्ट करें।
    नोट: पिनहोल पर साइटोप्लाज्मिक बहिर्वाह स्वीकार्य है। यदि साइटोप्लाज्मिक रिसाव बहुत अधिक है, तो सुई के कोण को अधिक गंभीर कोण में समायोजित करें जब तक कि द्रव बहिर्वाह नियंत्रित न हो जाए।
  10. पर्याप्त हैचिंग राशि सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 300 भ्रूण को इंजेक्ट करें। इंजेक्शन के बाद पेट्री डिश (ईएस) के ढक्कन को कवर करें।
    नोट: 50-100 भ्रूण के इंजेक्शन के लिए oviposition से समय 2 ज तक सीमित है। अधिकांश भ्रूण अभी भी इस समय सीमा के भीतर एक-कोशिका चरण में हैं। सामान्य तौर पर, दक्षता को बढ़ावा देने के लिए भ्रूण इंजेक्शन के दौरान ओवीपोजिशन प्रक्रिया को दोहराना उपयोगी है।

4. पोस्ट इंजेक्शन कीट पालन

  1. जी0 भ्रूण का प्रसार।
    1. 60% सापेक्ष आर्द्रता और 28 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण को 14 घंटे प्रकाश / 10 घंटे अंधेरे के साथ एक कृत्रिम जलवायु बॉक्स में इनक्यूबेट करें।
    2. इंजेक्शन के बाद प्रतिदिन भ्रूण के विकास की जांच करें। जब भ्रूण की सतह का रंग गहरा हो जाता है, तो माइक्रोस्कोप स्लाइड के चारों ओर पेट्री डिश में कृत्रिम आहार डालें, और हर 12 घंटे में भ्रूण के विकास की जांच करें।
      नोट: कृत्रिम आहार के रूप में Wu et al.35 और झा एट al.36 द्वारा वर्णित तैयार किया गया है.
    3. 24-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटें तैयार करें और कृत्रिम आहार के साथ अपनी वॉल्यूमेट्रिक क्षमता के एक तिहाई हिस्से में प्रत्येक को अच्छी तरह से भरें।
    4. एक छोटे से पेंटब्रश का उपयोग करके हैचिंग लार्वा (चित्रा 5 डी) चुनें और उन्हें 24-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में स्थानांतरित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रत्येक लार्वा के पास जीवित रहने के लिए पर्याप्त भोजन है, प्रति अच्छी तरह से एक लार्वा डालें।
      नोट: एच armigera के लार्वा प्रत्येक अच्छी तरह से व्यक्तिगत रूप से पाला गया था क्योंकि वे आमतौर पर एक दूसरे को नरभक्षण करते थे।
  2. G0 लार्वा पालन
    1. लार्वा को भ्रूण के समान परिस्थितियों में पीछे करें।
    2. हर दिन हैच किए गए लार्वा की जांच करें। जब लार्वा तीसरे इंस्टार चरण में बढ़ते हैं, तो प्रत्येक लार्वा को एक नए ग्लास डैक्टिलेथ्रे में स्थानांतरित करें, कृत्रिम आहार के साथ मात्रा का पांचवां हिस्सा भरें।
    3. इनक्यूबेशन के बाद लगभग 12 डी, परिपक्व लार्वा को प्यूपेट करना शुरू कर देना चाहिए।
    4. G0 परिपक्व pupae सेक्स के आधार पर प्रतिष्ठित कर रहे हैं और eclosion से पहले अलग पिंजरों में रखा. जंगली प्रकार के समान आयु वर्ग के प्यूपे भी तैयार किए जाते हैं।
  3. G0 वयस्कों का पालन-पोषण
    1. दोनों जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती pupae दैनिक के eclosion की जाँच करें.
    2. नव-eclosed G0 पुरुष वयस्कों और जंगली प्रकार की महिला वयस्कों को एक ताजा शुद्ध पिंजरे में स्थानांतरित करें और लगभग 1: 1 पर G0 और जंगली प्रकार के बीच का अनुपात बनाएं। कपास की गेंदों में गिराए गए 10% (डब्ल्यू / वी) चीनी समाधान के साथ उन्हें आपूर्ति करें।
    3. पीढ़ी एक (जी 1) के पिल्ला तक ऊपर की नियमित विधि का उपयोग करके पीछे के कीड़े।
    4. एक dactylethrae का उपयोग करते हुए, G1 वयस्कों की नव-eclosed एकल जोड़ी को एक प्लास्टिक जार (13 सेमी x 12 सेमी x 12 सेमी) में स्थानांतरित करें जो 10% (w / v) चीनी समाधान के साथ आपूर्ति की जाती है। प्रत्येक जार को धुंध के साथ कवर करें। कुल मिलाकर G1 वयस्कों के लगभग 50 जोड़े लें।
      नोट: मादा पतंगों का एक्लोशन पुरुष पतंगों के पूर्वगामी होता है। सामान्य तौर पर, एक 3-दिन-पुराना पुरुष और 2-दिन की महिला यौन रूप से परिपक्व और संभोग करने के लिए तैयार होती है। नव-eclosed वयस्कों को खिलाने के बिना अपनी पहली प्रकाश अवधि में संभोग नहीं करेंगे।
    5. अंडे देने के बाद जी 1 वयस्कों को एक प्लास्टिक जार में इकट्ठा करें। एक 1.5 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्रत्येक वयस्क कीट रखो.

5. नॉक-आउट उत्परिवर्ती का पता लगाने

  1. अनुमानित कटे हुए साइट को फैलाने वाले प्राइमरों की एक जोड़ी डिज़ाइन करें। प्राइमरों को लक्ष्य स्थल से दोनों तरफ (अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम) पर कम से कम 50 बीपी की दूरी निर्धारित की जानी चाहिए।
    नोट: लक्ष्य अनुक्रम की पहचान के लिए प्राइमर अक्सर कुशलतापूर्वक बढ़ाने के लिए बड़े स्पैन को कवर करते हैं।
  2. धारा 1 में निकाले गए जीनोम डीएनए के साथ जीनोटाइपिंग प्राइमरों का उपयोग करके पीसीआर प्रतिक्रिया करें। 20 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर साइकिल चलाना; 20 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 20 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, और होल्ड पर 4 डिग्री सेल्सियस। 1% (डब्ल्यू / वी) एगारोज़ जेल के माध्यम से प्रतिक्रिया उत्पाद को सत्यापित करें। डिटेक्शन प्राइमरों की चयनित जोड़ी पीसीआर उत्पाद की गुणवत्ता द्वारा पुष्टि की गई थी। यदि बैंड स्पष्ट और विशिष्ट हैं, तो प्राइमरों का उपयोग एम्प्लिकॉन आकार के आधार पर आगे उत्परिवर्ती का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।
  3. संभावित संपादित व्यक्तियों के लिए स्क्रीन. संदंश का उपयोग करके एक हिंद पैर को सावधानीपूर्वक निकालें और प्रत्येक पैर को क्रमशः एक लाइसिंग मैट्रिक्स ट्यूब में रखें। ग्लास dactylethrae पर संख्या के अनुरूप लाइसिंग मैट्रिक्स ट्यूब लेबल.
  4. एक ऊतक homogenizer का उपयोग कर हिंद पैर homogenize. गति को 6.0 मीटर / सेकंड और समय को 60 सेकंड पर सेट करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक gDNA निष्कर्षण किट का उपयोग कर homogenized नमूने के जीनोमिक डीएनए निकालें।
  5. चरण 2 में वर्णित समान पीसीआर प्रतिक्रिया स्थितियों के साथ जीनोटाइपिंग प्राइमरों का उपयोग करके जीन खंड को बढ़ाएं। जीन अनुक्रमण सेवा द्वारा जीनोटाइप की पुष्टि करें। एक बार जब जी 1 उत्परिवर्ती जीनोटाइप (एक ही साइट को लक्षित करें) एक ही जार में निहित का पता चला था, तो जी 1 संतानों को रखें और इसे पीढ़ी दो (जी 2) के रूप में नाम दें।
  6. एक ही जीनोटाइप के जी 1 व्यक्तियों को एक नेट पिंजरे में रखें। जी 1 संतानों को स्वयं पार करें और एक ही तरीकों का उपयोग करके स्क्रीन करना जारी रखें।
  7. जीन खंड को बढ़ाएं और चरण 2 में उल्लिखित एक ही प्रक्रिया के साथ जीनोटाइप की पुष्टि करें। जी 2 होमोजीगस लाइनों को प्राप्त करें और नॉक-आउट उत्परिवर्ती लाइन को बनाए रखें।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल CRISPR / Cas9 तकनीक का उपयोग करके H. armigera की जीन नॉक-आउट लाइनें प्राप्त करने के लिए विस्तृत कदम प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल द्वारा प्राप्त प्रतिनिधि परिणामों को जीडीएनए चयन, भ्रूण संग्रह और इंजेक्शन, कीट पालन और उत्परिवर्ती का पता लगाने के लिए संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है।

इस अध्ययन में, ब्याज के हमारे जीन का लक्ष्य स्थल अपने दूसरे एक्सोन (चित्रा 2 ए) में स्थित था। इस साइट को अत्यधिक संरक्षित किया गया था, और संश्लेषित एसजीआरएनए के लक्ष्य बैंड टुकड़े की पुष्टि एगारोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 2 बी, सी, डी) का उपयोग करके की गई थी।

नर और मादा पतंगों को शुरू में अलग-अलग शुद्ध पिंजरों में पाला गया था ताकि समय से पहले संभोग को रोका जा सके और जितना संभव हो सके भ्रूण की पर्याप्त मात्रा सुनिश्चित की जा सके। सामान्य तौर पर, 300 निषेचित अंडे की कुल संख्या एकत्र की गई थी और तुरंत एक सेल चरण में sgRNA / Cas9 प्रोटीन मिश्रण (sgRNA के 300-500 ng / μL, Cas9 प्रोटीन के 200 ng / μL) के साथ इंजेक्ट किया गया था। इंजेक्शन की मात्रा भ्रूण के लगभग दसवें हिस्से में थी। माइक्रोइंजेक्शन के बाद, भ्रूण को धारा 4 में वर्णित के रूप में पाला गया था, और इंजेक्ट किए गए भ्रूण का 40% -60% बच गया।

एक एकल एसजीआरएनए लक्ष्य का उत्परिवर्ती पता लगाना जी 1 माता-पिता के वयस्कों (चित्रा 6 बी) से पीसीआर उत्पादों को अनुक्रमित करके किया गया था। हमने विभिन्न एक्सोन में गैर-ओवरलैपिंग एसजीआरएनए जोड़े का उपयोग करने की प्रभावशीलता का भी परीक्षण किया। उत्परिवर्ती (चित्रा 6C, D) के बड़े विलोपन को आसानी से जंगली प्रकार के बैंड (चित्रा 6A) से अलग किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में गणना की गई उत्परिवर्तन दर 87.50% थी जब 16 व्यक्तियों को यादृच्छिक रूप से परीक्षण किया जाता है, यह दर्शाता है कि यह प्रोटोकॉल अत्यधिक कुशल था। जीन नॉकआउट परिणाम कई जीनोटाइप में दिखाए गए थे, लेकिन हमारी स्क्रीनिंग से पहचाने गए अधिकांश म्यूटेंट -2 बीपी प्रकार के थे। उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप जीनोम में प्रोटीन अनुवाद की समय से पहले समाप्ति हुई, जिसके परिणामस्वरूप बाद में जीन फ़ंक्शन का नुकसान हुआ।

Figure 1
चित्र 1: SGRNA की तैयारी के लिए फ़्लोचार्ट। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: H. armigera से लक्ष्य sgRNas का चयन और संश्लेषण( A) पीला डोमेन एक्सोन का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि काली रेखा इंट्रोन का प्रतिनिधित्व करती है। लाल अनुक्रम लक्ष्य अनुक्रम को इंगित करते हैं, और नीले अनुक्रम प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (पीएएम) को इंगित करते हैं। (बी) एसजीआरएनए डीएनए टेम्पलेट की पीसीआर असेंबली। (C) इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन उत्पाद। (घ) एसजीआरएनए का शुद्धिकरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: भ्रूण संग्रह। (A) काले कपड़े से ढका हुआ एक शुद्ध पिंजरा। एच armigera के नर और मादा पतंगों संभोग कर रहे थे. (बी) भ्रूण के बिना माइक्रोस्कोप स्लाइड। (c) काले कपड़े के टुकड़ों पर 50-100 भ्रूण युक्त सूक्ष्मदर्शी स्लाइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: सुई तैयारी. (ए) माइक्रोपिपेट खींचनेवाला. (बी) एक माइक्रोपिपेट खींचने वाले द्वारा खींचने के बाद एक माइक्रोइंजेक्शन सुई की नोक। बिंदीदार बॉक्स आवर्धित सुई टिप को इंगित करता है। स्केल बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: भ्रूण microinjections. (ए) एक माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम का पूरा सेट जिसमें एक माइक्रोस्कोप (मध्य) और एक इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोइंजेक्टर (बाएं) होता है जो एक माइक्रोमैनिपुलेटर (दाएं) से जुड़ा होता है। (बी) भ्रूण और माइक्रोइंजेक्शन सुई। (सी) भ्रूण के इंजेक्शन स्थल को लाल तीर के साथ लेबल किया गया है। स्केल बार 200 μm का प्रतिनिधित्व करता है। (D) माइक्रोस्कोप के नीचे एक हैच्ड लार्वा। स्केल बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: पीसीआर और जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा उत्परिवर्ती का पता लगाना। काले तीर और लाल रेखाएं sgRNA के लक्ष्य स्थलों को इंगित करती हैं। (ए) लेन 1 में बैंड जंगली प्रकार से व्युत्पन्न प्रवर्धन टुकड़े का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) लेन 2 और 3 में बैंड एक एकल एसजीआरएनए लक्ष्य का उपयोग करके उत्परिवर्ती से व्युत्पन्न प्रवर्धन टुकड़े का प्रतिनिधित्व करते हैं। (C) गैर-अतिव्यापी एसजीआरएनए की एक जोड़ी का उपयोग करके एक विषमयुग्मज का पता लगाना। लेन 4 और 5 में बैंड दो एसजीआरएनए लक्ष्यों के उत्परिवर्तन से व्युत्पन्न प्रवर्धन टुकड़े का प्रतिनिधित्व करते हैं। निचले बैंड एक बड़े टुकड़े को हटाने का संकेत देते हैं। (d) परिणाम एक होमोजाइगोट से प्राप्त होते हैं। लेन 6 और 7 में बैंड बड़े टुकड़े को हटाने का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

CRISPR /Cas9 प्रणाली के अनुप्रयोग ने विभिन्न जीनों के बीच जीन फ़ंक्शन और इंटरैक्शन के विश्लेषण के लिए शक्तिशाली तकनीकी सहायता प्रदान की है। विस्तृत प्रोटोकॉल जो हम यहां प्रस्तुत करते हैं, CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन के माध्यम से एच. आर्मिगेरा में एक होमोजाइगोट उत्परिवर्ती की पीढ़ी को दर्शाता है। यह विश्वसनीय प्रक्रिया एच. आर्मिगेरा में निर्देशित जीन म्यूटाजेनेसिस के लिए एक सीधा तरीका प्रदान करती है।

CRISPR लक्ष्य साइटों की पसंद म्यूटाजेनेसिस efficiency37 को प्रभावित कर सकती है। इस प्रोटोकॉल में, हमने एक उपयुक्त लक्ष्य साइट प्राप्त करने के लिए ऑनलाइन वेबसाइट CRISPOR से कई परिणामों की तुलना और विश्लेषण किया। सिलिको में, जीआरएनए भविष्यवाणियां कुछ फायदे पेश करती हैं। सबसे पहले, वे ऑफ-टारगेट प्रभावों को कम करने के लिए एसजीआरएनए डिजाइन करते समय एच. आर्मिगेरा के पूरे जीनोम का विश्लेषण करते हैं। ऊपर उल्लिखित ऑनलाइन संसाधन, साथ ही CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/), कई लेपिडोप्टेरा जीनोम के साथ कार्य करते हैं, जो अन्य लेपिडोप्टेरा पतंगों में जीन संपादन के लिए फायदेमंद हो सकते हैं। दूसरे, उम्मीदवार एसजीआरएनए की रैंकिंग सीधे संभावनाओं की तुलना करती है लेकिन इसमें विभिन्न एल्गोरिदम के आधार पर कुछ भिन्नताएं शामिल हो सकती हैं। दोनों सूचियों में उच्च रेटिंग के साथ उम्मीदवार अनुक्रम अधिक विश्वसनीय होता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल की एक प्रमुख सीमा यह है कि वेबसाइटों के डेटाबेस में बड़ी संख्या में कीट जीनोम अनुपस्थित हैं, इसलिए ऑफ-टारगेट प्रभावों की संभावना है। एक और सीमा यह है कि पीएएम अनुक्रम एसजीआरएनए डिजाइन के लिए आवश्यक है, जिसके परिणामस्वरूप एक उपयुक्त लक्ष्य साइट खोजने में असमर्थता हो सकती है।

उत्परिवर्ती स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले ऊतक भी एक महत्वपूर्ण कारक हैं। कीड़ों की जीवित रहने की दर, जीवन चक्र और शारीरिक कार्यों को प्रभावित नहीं किया जाना चाहिए। इष्टतम gDNA निष्कर्षण विधि की खोज की हमारी प्रक्रिया में, लार्वा से माइक्रो-हेमोलिम्फ निष्कर्षण समय बचाने और संभोग (अप्रकाशित डेटा) से बचने के लिए उत्परिवर्ती का पता लगाने के लिए प्रयास किया गया था। हालांकि, इस विधि ने पीसीआर प्रवर्धन की दक्षता और वयस्कों की जीवित रहने की दर (डेटा नहीं दिखाया गया है) के बारे में अधिक चुनौतियां लाईं। इसके अलावा, झेंग एट अल.38 ने एक्सुविएट या प्यूपरिया का उपयोग करके जीडीएनए निष्कर्षण के लिए एक गैर-विनाशकारी विधि की सूचना दी। उन निष्कर्षों के आधार पर, हमने जीडीएनए निष्कर्षण के लिए हिंद पैरों का उपयोग करके एक दृष्टिकोण को संशोधित और खोजा, जो वयस्क पतंगों को जीवित रहने और स्वाभाविक रूप से संभोग करने की अनुमति देता है, जिससे किसी दिए गए जीनोटाइप की पहचान सटीकता में काफी सुधार होता है। इसलिए, हमने प्रत्येक वयस्क उम्मीदवार से हिंद पैरों में से एक को हटाकर जीडीएनए निष्कर्षण की सफलता दर को बढ़ाने के लिए एक नई विधि विकसित की। हमने आगे पुष्टि की कि इस ऑपरेशन ने वयस्क पतंगों की जीवित रहने की दर और संभोग आवृत्ति को प्रभावित नहीं किया। इसके अलावा, हमने पाया कि बड़े टुकड़े को आसानी से जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा देखा जा सकता है जब एक्सोन-क्षेत्रों (चित्रा 6) में जीआरएनए की एक जोड़ी के साथ सह-इंजेक्ट किया जाता है, जो स्क्रीनिंग करते समय उत्परिवर्ती पहचान की प्रक्रिया को सरल बनाता है।

एच आर्मिगेरा के अंडे एक काले कपड़े पर एकत्र किए जाते हैं, जो माइक्रोइंजेक्शन (चित्रा 5 बी) की प्रक्रिया में माइक्रोस्कोप के तहत अंडे को अलग करना आसान बनाता है। लेपिडोप्टेरन पतंगों के सामान्य प्रजनन व्यवहार जैसे संभोग, ओवीपोज़िशन, हैचिंग, और एक्लोशन 39,40,41 के कारण, इस अंडे को इकट्ठा करने वाली तकनीक को अन्य लेपिडोप्टेरन पतंगों के लिए भी लागू किया जा सकता है।

अंत में, CRISPR / Cas9 प्रणाली एच armigera में कार्यात्मक जीनोमिक्स अध्ययन की सुविधा के लिए एक विश्वसनीय उपकरण साबित हुआ है। चरण-दर-चरण विवरण उपयोगकर्ताओं को एक अभिन्न जीन-संपादन प्रक्रिया को पूरा करने में सक्षम बनाते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31725023, जीडब्ल्यू के 31861133019, और सीवाई के लिए 31171912) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2kb DNA ladder TransGen Biotech BM101
Capillary Glass World Precision Instrucments 504949 referred to as "capillary glass" in the protocol
Double Sided Tape Minnesota Mining and Manufacturing Corporation 665
Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector Eppendorf Corporate E5252000021
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator Eppendorf Corporate 5192000051
Eppendorf Microloader Pipette Tips Eppendorf Corporate G2835241
GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific A29377
Microscope Slide Sail Brand 7105
Olympus Microscope Olympus Corporation SZX16
PrimeSTAR HS (Premix) Takara Biomedical Technology R040 used for mutant detection
Sutter Micropipette Puller Sutter Instrument Company P-1000
TIANamp Genomic DNA Kit TIANGEN Corporate DP304-03
TrueCut Cas9 Protein v2 Thermo Fisher Scientific A36499

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भ्रूण Microinjection और नॉकआउट उत्परिवर्ती CRISPR / Cas9 जीनोम-संपादित <em>हेलिकोवेर्पा Armigera</em> (Hübner) की पहचान
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Ai, D., Wang, B., Fan, Z., Fu, Y., Yu, C., Wang, G. Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner). J. Vis. Exp. (173), e62068, doi:10.3791/62068 (2021).

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