Summary
Burada CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi tarafından oluşturulan Helicoverpa armigera (Hübner) embriyo mikroenjeksiyonu ve nakavt mutant tanımlama protokolü sunulmaktadır. Mutant böcekler, in vivo'daki farklı genler arasında gen fonksiyonu ve etkileşiminin daha fazla araştırılmasına olanak tanır.
Abstract
Pamuk bollworm, Helicoverpa armigera, dünyanın en yıkıcı zararlılarından biridir. Moleküler genetik, fizyoloji, fonksiyonel genomik ve davranışsal çalışmaların bir kombinasyonu , H. armigera'yı Lepidoptera Noctuidae'de örnek bir tür haline getirmiştir. Farklı genlerin in vivo fonksiyonlarını ve etkileşimlerini incelemek için düzenli olarak kümelenmiş kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)/ ilişkili protein 9 (Cas9) genom düzenleme teknolojisi fonksiyonel genomik çalışmaların yapılmasında kullanılan uygun ve etkili bir yöntemdir. Bu çalışmada CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak H. armigera'da gen nakavtını tamamlamak için adım adım sistematik bir yöntem sunuyoruz. Kılavuz RNA'nın (gRNA) tasarımı ve sentezi ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Daha sonra kılavuz RNA (gRNA) oluşturma, embriyo toplama, mikroenjeksiyon, böcek yetiştirme ve mutant tespiti için gene özgü astar tasarımından oluşan sonraki adımlar özetlenmiştir. Son olarak, gen düzenlemenin verimliliğini artırmak için sorun giderme önerileri ve notları sağlanır. Yöntemimiz, CRISPR/Cas9 genom düzenlemenin H. armigera'da ve diğer Lepidopteran güvelerinde uygulanması için bir referans görevi görecektir.
Introduction
Genom düzenleme teknolojisinin uygulanması, çeşitli türlerde hedef gen mutantlarına ulaşmak için etkili bir araç sağlar. Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarların (CRISPR)/ilişkili protein 9 (Cas9) sisteminin ortaya çıkması genomları manipüle etmek için yeni bir yöntem sağlar1. CRISPR/Cas9 sistemi bir kılavuz RNA (gRNA) ve Cas9 endonuclease2,3'den oluşurken, gRNA iki bölüme ayrılabilir, hedef tamamlayıcı CRISPR RNA (crRNA) ve trans-aktive edici crRNA (tracrRNA). gRNA, Cas9 endonucleaz ile entegredir ve ribonikleoprotein (RNP) oluşturur. gRNA ile Cas9 endonucleaz, baz tamamlayıcısı yoluyla genomun belirli bir bölgesine yönlendirilebilir. Cas9'un RuvC ve HNH etki alanları, protospacer bitişik motif (PAM) dizisinden önce genomun hedef bölgesini üç temele ayırır ve çift iplikçikli bir mola (DSB) oluşturur. DNA bölünmesi daha sonra homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya homolojiye yönelik onarım (HDR)4 olmak üzere iki mekanizma ile onarılabilir. DSB'nin onarımı, hedeflenen geni devre dışı bırakmanın bir yolu olarak eklemeleri veya silmeleri tanıtır ve potansiyel olarak gen fonksiyonunun tamamen kaybına neden olur. Bu nedenle, CRISPR/Cas9 sisteminin sapkınlığı ve özgüllüğü, gen fonksiyonlarını in vivo olarak karakterize etmek ve gen etkileşimlerini analiz etmek için sağlam bir yöntem haline getirir5.
Crispr/Cas9 sistemi, biyotıp6,7, gen tedavisi8,9 ve tarım10,11,12 dahil olmak üzere çeşitli alanlara uygulanmıştır ve mikroorganizmalar13, bitkiler14,15, nematodlar16 ve memeliler dahil olmak üzere çeşitli biyolojik sistemler için kullanılmıştır17 . Omurgasızlarda, meyve sineği Drosophila melanogaster ve 18,19,20,21,22 ötesi gibi birçok böcek türü CRISPR / Cas9 genom düzenlemesine tabi tutulmuştur.
Helicoverpa armigera dünya çapında en yıkıcı zararlılardan biridir23 ve pamuk, soya fasulyesi ve sorgum24,25 dahil olmak üzere çok sayıda ürüne zarar verir. Sıralama teknolojisinin gelişmesiyle, H. armigera'nın genomunun yanı sıra bir dizi Lepidoptera böcek türünün genomları tamamen sıralanmıştır26,27,28,29. Son yıllarda bu böceklerden çok sayıda direnç ve koku reseptör geni tanımlanmış ve karakterize edilmiştir19,27,28,29. H. armigera'da cadherin30, ATP bağlayıcı kaset taşıyıcı31,32 ve HaTSPAN133 için kodlanan genler gibi dirençle ilgili bazı genler tanımlanmıştır. CRISPR/Cas9 teknolojisi kullanılarak bu genlerin nakavtı, hassas suşlarda Bacillus thuringiensis (BT) toksinine karşı yüksek düzeyde dirençle sonuçlanır. Ayrıca, Chang ve arkadaşları (2017), çiftleşme süresi düzenlemesinde önemli işlevini doğrulayan bir feromon reseptörü devirdi19. Bu raporlar CRISPR/Cas9'un böcek sistemlerinde in vivo gen fonksiyonunu incelemek için etkili bir araç olarak işlev görebildiğini göstermektedir. Bununla birlikte, böcek sistemlerinde CRISPR / Cas9 modifikasyonu için ayrıntılı bir prosedür eksik kalır, bu da böcek fonksiyonel genomiklerinde uygulama aralığını sınırlar.
Burada, CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak H. armigera'daki fonksiyonel bir geni yok etmek için bir protokol sunuyoruz. GRNA üretimi, embriyo toplama, mikroenjeksiyon, böcek yetiştirme ve mutant tanımlama için gen spesifik astarların tasarımı ve hazırlanması dahil olmak üzere ayrıntılı bir adım adım protokol sağlanmaktadır. Bu protokol, H. armigera'daki herhangi bir fonksiyonel geni manipüle etmek için değerli bir referans görevi görür ve diğer Lepidoptera türlerine genişletilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Genlere özgü astarların tasarımı ve sgRNA'nın hazırlanması
- PCR amplifikasyonu ve dizileme analizleri ile ilgi geninde korunmuş bir genomik bölgeyi doğrulayın. Hedef geni H. armigera'nın genom DNA'sından yükseltin ve eksonları ve intronları ayırt edin.
NOT: Hedef dışı gen düzenlemesini önlemek için kılavuz sitesinin sıra özgüllüğü gereklidir. Eksonlardaki olası kılavuz bölgeleri arama, genin 5' UTR'sine yakındır. Daha sonra, genin tamamen işlevsiz olduğundan emin olmak önemlidir. SgRNA'nın hazırlanması için akış yolunun bir özeti Şekil 1'de gösterilmiştir. - sgRNA hedeflerini seçin. Genin 5' UTR'sine yakın eksonlarda olası kılavuz sitelerini aramak için CRISPR çevrimiçi web sitesi CRISPOR'ı (Sürüm 4.97) (http://crispor.tefor.net/crispor.py) kullanın. Ekson dizisini metin kutusuna girin ve Helicoverpa armigera 'ya (Harm_1.0) hedef genomun işaretini seçin. "20 bp-NGG" protospacer bitişik motif (PAM) seçeneğini seçin ve diğer ayarları web sitelerinin kullanım kılavuzlarına göre varsayılan parametrelerde bırakın.
- Yazılımdan tahmin edilen kılavuz dizilerini karşılaştırın ve düzenleme verimliliğini artırmak ve hedef dışı düzenlemeyi azaltmak için en yüksek tahmin edilen verimlilik ve en az uyumsuzlukla kılavuz dizisini seçin. Kesme verimliliğini artırabileceğinden, 5' UTR üzerinde bir veya iki G içeren 20 bp kılavuz dizisi önerilir.
NOT: Daha sonraki adımlarda mutant algılamayı basitleştiren büyük bir segment silme elde etmek için ekson bölgelerindeki bir çift gRNA da önerilir. Seçilen iki kılavuz dizisi arasındaki aralık mesafesinin en az 100 bp olduğundan emin olun. Bu protokolde, NGG motifini tanıyan yaygın olarak kullanılan SpCas9 proteinini seçiyoruz. Üreticinin talimatına göre, T7 organizatörü seçerken G'den yoksun kılavuz dizisi de kabul edilebilir, çünkü organizatör sıranın 5' UTR'sine bir G ekler. - İleri ve ters oligonükleotidler tasarlayin. Sıra sırasını 5'-20 bp kılavuz sırası-NGG-3' olarak ayarlayın ve kılavuz sırasını ters tamamlayın. GRNA sentez kitinin kullanım kılavuzuna göre sırasıyla ileri ve ters iplik kılavuz dizisine T7 promotör dizisini ekleyin.
NOT: PAM dizisi NGG oligonükleotid dizisinin dışında tutulmalıdır. - gRNA sentez kitini kullanarak sgRNA'yı oluşturun. Bu işlem üç adım içerir: DNA şablonu montajı, in vitro transkripsiyon ve sgRNA'nın saflaştırılması (Şekil 2). Her adımı kullanıcı talimatlarına uygun olarak gerçekleştirin.
2. Embriyo hazırlama ve toplama
- Hongtao ve ark.34 tarafından tanımlandığı gibi erkek ve dişi pupaları ayır ve iki farklı ağ kafesine ayır. Eklozyondan sonra, onları bir Petri kabındaki emici pamukta% 10 (w / v) beyaz şeker çözeltisinin ~ 30 mL'sini besleyin.
NOT: %10 (w/v) beyaz şeker çözeltisini hazırlamak için 30 mL steril suda 3 g beyaz şeker eritilmiştir. - Sırasıyla 3 günlük erkeklerden ve 2 günlük kadınlardan 50 sağlıklı birey seçin ve bunları temiz bir ağ kafesinde karıştırın. %10 (w/v) şeker çözeltisi içeren bir parça pamuğu kafese yerleştirin ve pamuğu nemli tutun. Ağ kafeslerini gazlı bezle örtün ve gazlı bezi bir lastik bantla sabitleyin. Nemli tutmak için gazlı bez üzerine su püskürtün.
- 2. adımdaki seçili erkek ve dişi güvelerin tamamen çiftleşmelerine ve yumurtlama miktarını gözlemlemelerine izin verin.
NOT: H. armigera'nın yumurtlama zirvesi saat 21:00'den sonra ortaya çıkar.m. Bu nedenle, sonraki adımlarda yeterli sayıda yumurta sağlamak için çiftleşme zamanı düşünülmelidir. Yumurtlamanın zirvesinde, gazlı bezi siyah bir bezle değiştirin ve 30 dakika boyunca serbest yumurtlamayı etkinleştirin. Taze yumurta toplamak için siyah bezi her 30 dakikada bir değiştirin (Şekil 3A). - Siyah bezi yaklaşık 3 mm büyüklüğünde düzensiz şekilli yamalar halinde kesin. Her yamada daha fazla yumurta sağlayın.
NOT: Genellikle kısırlaştırılmamış olduğu için buruşuk yumurtaları seçmekten kaçının. - Çift taraflı bandı mikroskop slaydına (25 mm x 75 mm) yapıştırın (Şekil 3B). Kümesleri kullanarak, çift taraflı bandın yüzeyine yumurtaları bir sıra halinde yapıştırın. Teybe sıkıca yapıştıklarından emin olmak için her yamanın kenar boşluğuna basın. Mikroskop slayt başına 50-100 yumurta toplayın (Şekil 3C).
NOT: Yamaların çift taraflı bandın tam yüzeyini kaplaması gerekir, aksi takdirde kuluçkalık larvalar sürünmede zorluk çeker. - Mikroenjeksiyondan önce, embriyoların gelişimini geciktirmek için mikroskobu buz üzerinde tutun.
3. Embriyoların mikroenjeksiyon
- Bir mikropipette çekme makinesi kullanarak kılcal cam çekerek iğneyi hazırlayın (Şekil 4A). Isıyı 540'a, Vel'i 75'e, Süreyi 170'e ve Basıncı 450'ye ayarlayın. İğne ucunu bir mikro öğütücü kullanarak topraklayın. İdeal iğne keskin kenarlı bir uç gösterir (Şekil 4B).
- Enjeksiyon çözeltilerinin hazırlanması. 10 μL hacimli bir karışım elde etmek için PCR tüpündeki RNase içermeyen suya 2 μL ticarileştirilmiş Cas9 proteini (1 mg/mL) ve sgRNA (300-500 ng/μL son konsantrasyon) ekleyin. SgRNA'nın hacmi konsantrasyonuna bağlıdır. Pipetle iyice karıştırın ve buza koyun.
NOT: Bu adımda kullanılan tüm pipet uçları ve PCR tüpleri RNase içermez. - Elektronik mikroinjektörün parametrelerini ayarlayın. Enjeksiyon basıncını (pi) 1.500 hPa'ya, enjeksiyon süresini (ti) 0,1 s'ye ve kompanzasyon basıncını (pc) 30 hPa'ya ayarlayın.
- Karışımın 2 μL'sini mikro yükleyici pipet ucu kullanarak bir iğneye yükleyin. İğnenin ucundaki artık hava mümkün olduğunca tüketilmelidir.
- Enjeksiyon iğnesini bir mikromanipülatöre bağlayın ve iki parça arasında sıkı bir bağlantı sağlayın.
- Bir petri kabına (100 mm) bir slayt yerleştirin ve mikroskop aşamasına koyun (Şekil 5A).
- Hem iğne ucu hem de embriyolar mikroskop altında görünene kadar iğne ucunun konumunu hafif bir mikroskop altında ayarlayın (Şekil 5B).
- Damlacık sesini ayarlayın. Pedala basın ve iğne ucundaki sıvı damlasını gözlemleyin. Bir sıvı damlasının hacmi embriyoların hacminin yaklaşık onda biri olana kadar mikroinjektörün enjeksiyon basıncını ayarlayın.
NOT: Enjeksiyon iğnesinin kalitesi embriyoların hayatta kalma oranı için hayati öneme sahiptir. - İğne ucunu bir embriyonun üst yarımküresine 45 derecelik bir açıyla dikkatlice yerleştirin (Şekil 5C). Karışımı embriyoya teslim etmek için pedala basın. Enjeksiyon embriyonun hafif bir genişlemesine yol açar. İğneyi embriyodan hemen geri çek ve petri kabını bir elinle bir sonraki embriyo iğneye yakın olana kadar hareket ettir ve bir sonraki embriyoya aynı prosedürü enjekte edin.
NOT: İğne deliğinde sitoplazmik çıkış kabul edilebilir. Sitoplazmik sızıntı çok fazlaysa, sıvı çıkışı kontrol edilene kadar iğnenin açısını daha şiddetli bir açıya ayarlayın. - Yeterli kuluçka miktarını sağlamak için en az 300 embriyo enjekte edin. Enjeksiyondan sonra Petri kabının kapağını kapatın.
NOT: 50-100 embriyonun yumurtlamasından enjeksiyonuna kadar geçen süre 2 saat ile sınırlıdır. Embriyoların çoğu bu zaman dilimi içinde hala tek hücreli aşamadadır. Genel olarak, verimliliği artırmak için embriyo enjeksiyonu sırasında yumurtlama prosedürünü tekrarlamak yararlıdır.
4. Enjeksiyon sonrası böcek yetiştirme
- G0 embriyolarının yayılması.
- Embriyoları % 60 bağıl nemde ve 28 °C'de 14 saat açık/10 saat karanlık yapay bir iklim kutusunda kuluçkaya yatırın.
- Enjeksiyondan sonra günlük embriyo gelişimini kontrol edin. Embriyoların yüzey rengi karardığında, mikroskop kaydırağının etrafındaki Petri kabına yapay diyet koyun ve her 12 saat içinde embriyoların gelişimini kontrol edin.
NOT: Yapay diyet Wu ve ark.35 ve Jha ve ark.36 tarafından açıklandığı gibi hazırlanır. - 24 kuyulu kültür tabakları hazırlayın ve her kuyuyu yapay diyetle hacimsel kapasitesinin üçte birine doldurun.
- Kuluçka larvalarını (Şekil 5D) küçük bir boya fırçası kullanarak seçin ve 24 kuyu kültür plakasına aktarın. Her larvanın hayatta kalmak için yeterli yiye erk yiye sahip olduğundan emin olmak için kuyu başına bir larva ekleyin.
NOT: H. armigera larvaları genellikle birbirlerini yamyamlaştırdıkları için her kuyuda ayrı ayrı yetiştirildi.
- G0 larva yetiştirme
- Larvaları embriyolarla aynı koşullarda arkala.
- Yumurtadan çıkan larvaları her gün kontrol edin. Larvalar üçüncü başlangıç aşamasına büyüdüğünde, her larvayı yeni bir cam dactylethrae'ye aktarın ve hacmin beşte birini yapay diyetle doldurun.
- Kuluçkadan yaklaşık 12 d sonra, olgun larvalar yavrulanmaya başlamalıdır.
- G0 olgun pupalar cinsiyete göre ayırt edilir ve eklosyondan önce ayrı kafeslere yerleştirilir. Vahşi tipteki aynı yaşlı pupalar da hazırlanır.
- G0 yetişkin yetiştirme
- Her gün hem vahşi tip hem de mutant pupaların eklozyonunu kontrol edin.
- Yeni eklenen G0 erkek yetişkinlerini ve vahşi tip kadın yetişkinleri taze bir ağ kafesine aktarın ve G0 ile vahşi tip arasındaki oranı yaklaşık 1:1'de yapın. Onlara pamuk toplarına bırakılan% 10 (w / v) şeker çözeltisi sağlayın.
- Birinci neslin (G1) yavrulanmasına kadar yukarıdaki rutin yöntemi kullanan arka böcekler.
- Bir dactylethrae kullanarak, yeni eklenen tek çift G1 yetişkinini% 10 (w / v) şeker çözeltisi ile birlikte verilen plastik bir kavanoza (13 cm x 12 cm x 12 cm) aktarın. Her kavanozu gazlı bezle örtün. Toplamda yaklaşık 50 çift G1 yetişkin alın.
NOT: Dişi güvelerin eklosyonu erkek güvelerden öncesine aittir. Genel olarak, 3 günlük bir erkek ve 2 günlük bir kadın cinsel olarak olgun ve çiftleşmeye hazırdır. Yeni eklenen yetişkinler beslenmeden ilk ışık dönemlerinde çiftleşmeyecekler. - G1 yetişkinlerini yumurta bıraktıktan sonra plastik bir kavanozda toplayın. Her yetişkin güveyi 1,5 mL santrifüj tüpüne koyun.
5. Nakavt mutant tespiti
- Tahmin edilen kesilmiş siteyi kapsayan bir çift astar tasarlayın. Astarlar, hedef siteden her iki tarafta (yukarı ve aşağı akış) en az 50 bp mesafe ayarlanmalıdır.
NOT: Hedef sıranın tanımlanması için astarlar genellikle verimli bir şekilde yükseltmek için büyük açıklıkları kapsar. - Bölüm 1'de çıkarılan genom DNA'sı ile genotipleme astarlarını kullanarak PCR reaksiyonuna gerçekleştirilen. 20 sn için 95 °C'de PCR döngüsü gerçekleştirin; 20 s için 95 °C 35 döngü, 20 s için 55 °C, 1 dakika için 72 °C; 5 dakika için 72 °C ve beklemede 4 °C. Reaksiyon ürününü %1 (w/v) agarose jel ile doğrulayın. Seçilen algılama astarları çifti PCR ürününün kalitesi ile doğrulandı. Bantlar belirgin ve spesifikse, astarlar amplicon boyutuna göre daha fazla mutant tespiti için kullanılabilir.
- Potansiyel düzenlenmiş bireyler için ekran. Bir arka bacağı dikkatlice ön ayak kullanarak çıkarın ve her bacağı sırasıyla bir lising matris tüpüne koyun. Lising matris tüpünü cam dactylethrae'deki sayıyla tutarlı olarak etiketleyin.
- Doku homojenizatör kullanarak arka bacağı homojenize edin. Hızı 6,0 m/s'ye ve süreyi 60 s'ye ayarlayın. Homojenize numunenin genomik DNA'sını, üreticinin talimatlarına göre ticari bir gDNA ekstraksiyon kiti kullanarak çıkarın.
- Gen segmentini, 2. Gen dizilim servisi tarafından genotipi onaylayın. Aynı kavanozda bulunan G1 mutant genotipleri (aynı bölgeyi hedefleyin) tespit edildikten sonra, G1 soylarını koruyun ve ikinci nesil (G2) olarak yeniden adlandırın.
- Aynı genotipteki G1 bireylerini bir ağ kafesine koyun. G1 soylarını kendinden geçin ve aynı yöntemleri kullanarak taramaya devam edin.
- Gen segmentini güçlendirin ve genotipi adım 2'de belirtildiği gibi aynı prosedürle onaylayın. G2 homozigous çizgileri elde edin ve nakavt mutant hattını koruyun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, CRISPR/Cas9 teknolojisini kullanarak H. armigera'nın gen nakavt hatlarını elde etmek için ayrıntılı adımlar sağlar. Bu protokol ile elde edilen temsili sonuçlar gDNA seçimi, embriyo toplama ve enjeksiyon, böcek yetiştirme ve mutant tespiti için özetlenmiştir.
Bu çalışmada, ilgi genimizin hedef bölgesi ikinci eksonunda yer meydana geldi (Şekil 2A). Bu bölge oldukça korunmuştur ve sentezlenmiş sgRNA'nın hedef bant parçası agarose jel elektroforezi kullanılarak doğrulanmıştır (Şekil 2B, C,D).
Erkek ve dişi güveler başlangıçta planlanandan önce çiftleşmeyi önlemek ve mümkün olduğunca yeterli miktarda embriyo sağlamak için ayrı ağ kafeslerinde yetiştirildi. Genel olarak, toplam 300 döllenmiş yumurta toplandı ve hemen tek hücreli aşamada sgRNA/Cas9 protein karışımı (300-500 ng/μL sgRNA, 200 ng/μL Cas9 proteini) enjekte edildi. Enjeksiyon hacmi embriyoların onda biri kadardı. Mikroenjeksiyondan sonra embriyolar bölüm 4'te açıklandığı gibi yetiştirildi ve enjekte edilen embriyoların%40-60'ı hayatta kaldı.
Tek bir sgRNA hedefinin mutant tespiti, PCR ürünlerinin G1 ebeveyn yetişkinlerden sıralanarak gerçekleştirildi (Şekil 6B). Ayrıca, farklı eksonlarda örtüşmeyen sgRNA çiftleri kullanmanın etkinliğini test ettik. Mutantların büyük ölçüde silinmesi (Şekil 6C,D) vahşi tip bantlardan kolayca ayırt edilebilir (Şekil 6A).
Bu protokolde hesaplanan mutasyon oranı, 16 kişi rastgele test edildiğinde% 87.50 idi ve bu da bu protokolün yüksek verimli olduğunu gösteriyor. Gen nakavt sonuçları birkaç genotipte gösterilmiştir, ancak taramamızdan tanımlanan mutantların çoğunluğu -2 bp tipiydi. Mutasyonlar, genomdaki protein çevirisinin erken sonlandırılmasına neden oldu ve daha sonra gen fonksiyonunun kaybına yol açtı.
Şekil 1: sgRNA'nın hazırlanması için akış çizelgesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: H. armigera'dan hedef sgRNA'ların seçimi ve sentezi. (A) Sarı alan adı ekson,siyah çizgi ise intron'u temsil eder. Kırmızı diziler hedef sırayı, mavi diziler ise protospacer bitişik motifini (PAM) gösterir. (B) sgRNA DNA şablonunun PCR montajı. (C) Tüp bebek transkripsiyon ürünü. (D) sgRNA'nın saflaştırılması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Embriyo toplanması. (A) Siyah bezle kaplı bir ağ kafesi. H. armigera'nın erkek ve dişi güveleri çiftleşiyordu. (B) Mikroskop embriyosuz kayar. (C) Siyah bez parçaları üzerinde 50-100 embriyo içeren mikroskop kaydırağı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İğne hazırlama. (A) Mikropipette puller. (B) Mikropipette çektikten sonra mikroenjeksiyon iğnesinin ucu. Noktalı kutu büyütülmüş iğne ucunu gösterir. Ölçek çubuğu 1 mm'yi temsil eder .
Şekil 5: Embriyo mikroenjections. (A) Mikroskop (ortada) ve mikromanipülatöre (sağda) bağlı elektronik bir mikroenjektör (solda) içeren bir mikroenjeksiyon sisteminin tüm seti. (B) Embriyolar ve mikroenjeksiyon iğnesi. (C) Embriyonun enjeksiyon bölgesi kırmızı ok ile etiketlenmiştir. Ölçek çubuğu mikroskop altında 200 μm. (D) Yumurtadan çıkmış bir larvayı temsil eder. Ölçek çubuğu 1 mm'yi temsil eder .
Şekil 6: Mutantların PCR ve jel elektroforezi ile tespiti. Siyah oklar ve kırmızı çizgiler sgRNA'nın hedef bölgelerini gösterir. (A) Şerit 1'deki bant, vahşi tipten türetilen amplifikasyon parçasını temsil eder. (B) Şerit 2 ve 3'teki bantlar, tek bir sgRNA hedefi kullanılarak mutanttan elde edilen amplifikasyon parçasını temsil eder. (C) Örtüşmeyen bir çift sgRNA kullanılarak bir heterozygote'un tespiti. 4. ve 5. şeritlerdeki bantlar, iki sgRNA hedefinin mutasyonundan elde edilen amplifikasyon parçasını temsil eder. Alt bantlar büyük bir parça silme gösterir. (D) Sonuçlar homozigottan elde edilir. Şerit 6 ve 7'deki bantlar büyük parça silmeyi gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRISPR/Cas9 sisteminin uygulanması, gen fonksiyonunun ve çeşitli genler arasındaki etkileşimin analizi için güçlü teknik destek sağlamıştır. Burada sunduğumuz ayrıntılı protokol, CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi ile H. armigera'da homozigot mutantının neslini göstermektedir. Bu güvenilir prosedür, H. armigera'da yönlendirilmiş gen mutajenisi için basit bir yol sağlar.
CRISPR hedef sahalarının seçimi mutajensis verimliliğini etkileyebilir37. Bu protokolde, uygun bir hedef site elde etmek için çevrimiçi web sitesi CRISPOR'dan birden fazla sonucu karşılaştırdık ve analiz ettik. Silikoda gRNA tahminleri bazı avantajlar sunar. İlk olarak, hedef dışı etkileri en aza indirmek için sgRNA'lar tasarlarken H. armigera'nın tüm genomunu analiz ederler. Yukarıda belirtilen çevrimiçi kaynaklar ve CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/), diğer Lepidopteran güvelerinde gen düzenleme için yararlı olabilecek bir dizi Lepidoptera genomu ile çalışır. İkinci olarak, aday sgRNA'ların sıralaması olasılıkları doğrudan karşılaştırır, ancak farklı algoritmalara dayalı bazı varyasyonlar içerebilir. Her iki listede de yüksek puan alan aday sırası daha güvenilir olma eğilimindedir. Bununla birlikte, bu protokolün önemli bir sınırlaması, web sitelerinin veritabanlarında çok sayıda böcek genomunun bulunmamasıdır, bu nedenle hedef dışı etkiler için potansiyel vardır. Başka bir sınırlama, PAM dizisinin sgRNA tasarımı için gerekli olmasıdır, bu da uygun bir hedef sitenin bulunamamasına neden olabilir.
Mutant taraması için kullanılan dokular da çok önemli bir faktördür. Böceklerin hayatta kalma oranı, yaşam döngüsü ve fizyolojik işlevleri etkilenmemelidir. Optimal gDNA ekstraksiyon yöntemini keşfetme sürecimizde, mutant tespiti için larvalardan mikro hemolimf ekstraksiyonu zaman kazanmak ve çiftleşmeyi önlemek için denendi (yayınlanmamış veriler). Bununla birlikte, bu yöntem PCR amplifikasyonunun verimliliği ve yetişkinin hayatta kalma oranları ile ilgili daha fazla zorluk getirdi (veriler gösterilmedi). Ek olarak, Zheng ve ark.38 exuviate veya puparia kullanarak gDNA ekstraksiyonu için tahribatsız bir yöntem bildirdi. Bu bulgulara dayanarak, yetişkin güvelerin doğal olarak hayatta kalmalarını ve çiftleşmelerini sağlayan gDNA ekstraksiyonu için arka ayakları kullanarak bir yaklaşımı değiştirdik ve araştırdık, belirli bir genotipin algılama doğruluğunu önemli ölçüde artırdık. Bu nedenle her yetişkin adaydan arka ayaklardan birini çıkararak gDNA ekstraksiyonunun başarı oranını artırmak için yeni bir yöntem geliştirdik. Ayrıca bu operasyonun yetişkin güvelerin hayatta kalma oranını ve çiftleşme sıklığını etkilemediğini doğruladık. Ayrıca, büyük parça silme işleminin, ekson bölgelerinde bir çift gRNA ile birlikte enjekte edildiğinde jel elektroforezi tarafından kolayca gözlemlenebileceğini bulduk (Şekil 6), bu da tarama sırasında mutant tanımlama sürecini basitleştirir.
H. armigera'nın yumurtaları siyah bir bez üzerinde toplanır, bu da mikroenjeksiyon sürecinde yumurtaların mikroskop altında ayırtlanmasını kolaylaştırır (Şekil 5B). Lepidopteran güvelerinin çiftleşme, yumurtlama, kuluçka ve eklosiyon39,40,41 gibi yaygın üreme davranışları nedeniyle, bu yumurta toplama tekniği diğer Lepidopteran güveleri için de uygulanabilir.
Sonuç olarak CRISPR/Cas9 sisteminin H. armigera'da fonksiyonel genomik çalışmaları kolaylaştırmak için güvenilir bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Adım adım açıklamalar, kullanıcıların entegre bir gen düzenleme işlemini tamamlamasını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (gw 31861133019 31725023 ve CY için 31171912) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
References
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR. Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).
- Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. CRISPR editing in biological and biomedical investigation. Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).
- Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model. DNA Repair. 46, 1-8 (2016).
- Wu, J., et al. Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).
- Jiao, R., Gao, C. The CRISPR/Cas9 genome editing revolution. Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).
- Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems. World Patent Information. 60, 101944 (2020).
- Es, I., et al. The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges. Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).
- Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes. Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).
- Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -G. CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications. Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).
- Pandey, P. K., et al. Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research. Seminars in Cell & Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
- Mojica, F. J., Montoliu, L. On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals. Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Koutroumpa, F., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).
- Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).
- Fitt, G. P. The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems. Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).
- Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (Hübner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management. Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).
- Ai, D., et al. Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera Hübner (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).
- Wan, F., et al. A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Cheng, T., et al. Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest. Nature Ecology & Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).
- Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore. Science Reports. 6, 23666 (2016).
- Gouin, A., et al. Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Wang, J., et al. Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).
- Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins. Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).
- Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm. PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).
- Jin, L., et al. Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).
- Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision. Tobacco Sciene & Technology. 53 (2), 21-26 (2019).
- Wu, K., Gong, P. A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm. Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).
- Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics. Environmental Entomology. (1), 30 (2012).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).
- Zheng, M. -Y., et al. A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia. Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).
- Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae). Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).
- Kamimura, M., Tatsuki, S. Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).
- Edwards, K. D. Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE). Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).
