Summary
يظهر هنا بروتوكول الحقن المجهري للأجنة Helicoverpa armigera (Hübner) وتحديد الطفرات بالضربة القاضية التي تم إنشاؤها بواسطة تحرير الجينوم CRISPR / Cas9. تتيح الحشرات الطافرة إجراء مزيد من الأبحاث حول وظيفة الجينات والتفاعل بين الجينات المختلفة في الجسم الحي.
Abstract
دودة القطن ، Helicoverpa armigera ، هي واحدة من أكثر الآفات تدميرا في العالم. مزيج من علم الوراثة الجزيئية ، وعلم وظائف الأعضاء ، وعلم الجينوم الوظيفي ، والدراسات السلوكية جعلت H. armigera نوعا نموذجيا في Lepidoptera Noctuidae. لدراسة وظائف الجينات المختلفة والتفاعلات بين الجينات المختلفة في الجسم الحي ، تعد تقنية تحرير الجينوم المجمعة بانتظام (CRISPR) / البروتين المرتبط بها 9 (Cas9) طريقة مريحة وفعالة تستخدم لإجراء دراسات جينومية وظيفية. في هذه الدراسة ، نقدم طريقة منهجية خطوة بخطوة لإكمال الضربة القاضية للجين في H. armigera باستخدام نظام CRISPR / Cas9. يتم وصف تصميم وتوليف الحمض النووي الريبي الإرشادي (gRNA) بالتفصيل. بعد ذلك ، يتم تلخيص الخطوات اللاحقة التي تتكون من تصميم تمهيدي خاص بالجينات لإنشاء الحمض النووي الريبي الموجه (gRNA) ، وجمع الأجنة ، والحقن المجهري ، وتربية الحشرات ، والكشف عن الطفرات. وأخيرا، يتم تقديم المشورة والملاحظات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها لتحسين كفاءة تحرير الجينات. ستكون طريقتنا بمثابة مرجع لتطبيق تحرير جينوم CRISPR / Cas9 في H. armigera بالإضافة إلى عث Lepidopteran الآخر.
Introduction
يوفر تطبيق تكنولوجيا تحرير الجينوم أداة فعالة لتحقيق طفرات الجينات المستهدفة في الأنواع المتنوعة. يوفر ظهور نظام التكرارات الباليندرومية القصيرة المجمعة بانتظام (CRISPR)/البروتين المرتبط به 9 (Cas9) طريقة جديدة للتعامل مع الجينوم1. يتكون نظام CRISPR/Cas9 من الحمض النووي الريبي الإرشادي (gRNA) و Cas9 endonuclease2,3، في حين يمكن تقسيم الحمض النووي الريبي للحمض النووي الريبي (gRNA) إلى قسمين، الحمض النووي الريبي التكميلي المستهدف (crRNA) والحمض النووي الريبي التكميلي المستهدف (crRNA). يتكامل الحمض النووي الريبي مع إندونوكلياز كاس9 ويشكل البروتين الريبي النووي (RNP). مع الحمض النووي الريبوزي المرسال ، يمكن توجيه Cas9 endonuclease إلى موقع معين من الجينوم عبر تكملة القاعدة. يشق مجالا RuvC و HNH في Cas9 الموقع المستهدف للجينوم ثلاث قواعد قبل تسلسل الزخارف المتاخمة للفاصل الأولي (PAM) ويخلقان كسرا مزدوجا (DSB). يمكن بعد ذلك إصلاح انقسام الحمض النووي من خلال آليتين ، الانضمام النهائي غير المتجانس (NHEJ) أو الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR)4. إصلاح DSB يقدم عمليات الإدراج أو الحذف كوسيلة لتعطيل الجين المستهدف ، مما قد يتسبب في فقدان كامل لوظيفة الجينات. وبالتالي، فإن وراثة وخصوصية نظام كريسبر/كاس9 تجعله طريقة قوية لتوصيف وظائف الجينات في الجسم الحي وتحليل التفاعلات الجينية5.
مع العديد من المزايا ، تم تطبيق نظام CRISPR / Cas9 في مختلف المجالات ، بما في ذلك الطب الحيوي 6،7 ، والعلاج الجيني 8،9 ، والزراعة 10،11،12 ، وتم استخدامه لمختلف الأنظمة البيولوجية بما في ذلك الكائنات الحية الدقيقة 13 ، والنباتات 14،15 ، والديدان الخيطية16 ، والثدييات17 . في اللافقاريات ، خضعت العديد من أنواع الحشرات لتحرير جينوم CRISPR / Cas9 ، مثل ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر وما بعدها 18،19،20،21،22.
Helicoverpa armigera هي واحدة من أكثر الآفات تدميرا في جميع أنحاء العالم23 ، وتضر بالعديد من المحاصيل ، بما في ذلك القطن وفول الصويا والذرة الرفيعة24،25. مع تطور تكنولوجيا التسلسل ، تم تسلسل جينوم H. armigera ، وكذلك جينوم مجموعة من أنواع الحشرات Lepidoptera ، بالكامل26،27،28،29. تم تحديد عدد كبير من جينات المقاومة والمستقبلات الشمية وتمييزها من هذه الحشرات في السنوات الأخيرة19،27،28،29. تم تحديد بعض الجينات المرتبطة بالمقاومة في H. armigera ، مثل الجينات المشفرة ل cadherin30 ، وهو ناقل كاسيت ملزم ATP31,32 ، وكذلك HaTSPAN133. يؤدي التخلص من هذه الجينات باستخدام تقنية CRISPR / Cas9 إلى مستوى عال من المقاومة لتوكسين Bacillus thuringiensis (BT) في السلالات الحساسة. أيضا ، قام Chang et al. (2017) بإخراج مستقبل الفيرومون ، والذي أثبت صحة وظيفته المهمة في تنظيم وقت التزاوج 19. تشير هذه التقارير إلى أن كريسبر / كاس9 يمكن أن يكون بمثابة أداة فعالة لدراسة وظيفة الجينات في الجسم الحي في أنظمة الحشرات. ومع ذلك، لا يزال الإجراء التفصيلي لتعديل كريسبر/كاس9 في أنظمة الحشرات غير مكتمل، مما يحد من نطاق تطبيقه في علم الجينوم الوظيفي للحشرات.
هنا ، نقدم بروتوكولا لضرب جين وظيفي في H. armigera باستخدام نظام CRISPR / Cas9. يتم توفير بروتوكول مفصل خطوة بخطوة ، بما في ذلك تصميم وإعداد الاشعال الخاصة بالجينات لإنتاج الحمض النووي الريبوزي المرسال ، وجمع الأجنة ، والحقن المجهري ، وتربية الحشرات ، وتحديد الطفرات. يعمل هذا البروتوكول كمرجع قيم للتعامل مع أي جينات وظيفية في H. armigera ويمكن توسيعه ليشمل أنواع Lepidoptera الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تصميم الاشعال الخاصة بالجينات وإعداد sgRNA
- التحقق من المنطقة الجينومية المحفوظة في الجين محل الاهتمام من خلال تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل وتحليلات التسلسل. تضخيم الجين المستهدف من الحمض النووي الجينوم ل H. armigera وتمييز الإكسونات والإنترونات.
ملاحظة: خصوصية تسلسل موقع الدليل ضرورية لتجنب تحرير الجينات خارج الهدف. البحث في مواقع الدليل المحتملة في exons قريبة من 5' UTR من الجين. بعد ذلك ، من المهم التأكد من أن الجين غير فعال تماما. يوضح الشكل 1 ملخصا لمسار التدفق لإعداد sgRNA. - اختر أهداف sgRNA. استخدم موقع كريسبر على الإنترنت CRISPOR (الإصدار 4.97) (http://crispor.tefor.net/crispor.py) للبحث عن مواقع إرشادية محتملة في الإكسونات القريبة من UTR مقاس 5 أقدام للجين. أدخل تسلسل exon في مربع النص وحدد الجينوم المستهدف إلى Helicoverpa armigera (Harm_1.0). اختر خيار الشكل المجاور للوسيط الأولي (PAM) ل "20 bp-NGG" واترك الإعدادات الأخرى على المعلمات الافتراضية وفقا لأدلة المستخدم لمواقع الويب.
- قارن تسلسلات الدليل المتوقعة من البرنامج واختر تسلسل الدليل بأعلى كفاءة متوقعة وأقل عدد من عدم التطابق لتحسين كفاءة التحرير وتقليل التحرير خارج الهدف. يوصى باستخدام تسلسل دليل 20 نقطة أساس يحتوي على واحد أو اثنين من G على UTR مقاس 5 أقدام لأنه يمكن أن يزيد من كفاءة القطع.
ملاحظة: يوصى أيضا بزوج من gRNAs عبر مناطق exon للحصول على حذف مقطع كبير، مما يبسط اكتشاف الطفرات في الخطوات اللاحقة. تأكد من أن مسافة التباعد بين تسلسلي الدليل المحددين لا تقل عن 100 نقطة أساس. في هذا البروتوكول ، نختار بروتين SpCas9 شائع الاستخدام ، والذي يتعرف على شكل NGG. وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، فإن تسلسل الدليل الذي يفتقر إلى G مقبول أيضا عند اختيار مروج T7 لأن المروج يضيف G إلى UTR 5 'من التسلسل. - تصميم أوليغونوكليوتيدات إلى الأمام والعكس. اضبط ترتيب التسلسل على تسلسل دليل 5'-20 bp-NGG-3' وعكس تكملة تسلسل الدليل. أضف تسلسل المروج T7 إلى تسلسل دليل الشريط الأمامي والعكسي ، على التوالي وفقا لدليل المستخدم لمجموعة توليف gRNA.
ملاحظة: يجب استبعاد تسلسل PAM NGG من تسلسل oligonucleotide. - قم بإنشاء sgRNA باستخدام مجموعة توليف gRNA. تتضمن هذه العملية ثلاث خطوات: تجميع قالب الحمض النووي ، والنسخ في المختبر ، وتنقية sgRNA (الشكل 2). نفذ كل خطوة وفقا لتعليمات المستخدم.
2. إعداد الأجنة وجمعها
- فصل الشرانق بين الذكور والإناث كما وصفها Hongtao et al.34 وفصلها إلى قفصين شبكيين مختلفين. بعد الإغلاق ، قم بإطعامهم ~ 30 مل من محلول السكر الأبيض بنسبة 10٪ (ث / v) في القطن الماص في طبق بتري.
ملاحظة: تم إذابة 3 غرام من السكر الأبيض في 30 مل من الماء المعقم لإعداد محلول السكر الأبيض بنسبة 10٪ (ث / v). - اختر 50 فردا سليما من الذكور الذين يبلغون من العمر 3 أيام والإناث في عمر 2 يوم ، على التوالي ، واخلطهم في قفص شبكي نظيف. ضع قطعة من القطن تحتوي على محلول سكر بنسبة 10٪ (ث / v) في القفص وحافظ على رطوبة القطن. قم بتغطية الأقفاص الصافية بالشاش وقم بإصلاح الشاش بشريط مطاطي. رش الماء على الشاش للحفاظ على الرطوبة.
- اسمح للعث المختار من الذكور والإناث في الخطوة 2 بالتزاوج تماما ومراقبة كمية وضع البيض.
ملاحظة: تظهر ذروة وضع البيض في H. armigera بعد الساعة 9:00 ص .m. لذلك ، ينبغي النظر في وقت التزاوج لضمان وجود عدد كاف من البيض في الخطوات اللاحقة. في ذروة وضع البيض ، استبدل الشاش بقطعة قماش سوداء وقم بتمكين وضع البيض الحر لمدة 30 دقيقة. استبدل قطعة القماش السوداء كل 30 دقيقة لجمع البيض الطازج (الشكل 3A). - قطع قطعة القماش السوداء إلى بقع غير منتظمة الشكل بحجم 3 مم تقريبا. تأكد من وجود المزيد من البيض على كل رقعة.
ملاحظة: تجنب اختيار البيض المجعد لأنه عادة ما يكون غير مخصب. - الصق شريطا على الوجهين على شريحة مجهرية (25 مم × 75 مم) (الشكل 3B). باستخدام الملقط ، الصق البقع بالبيض على التوالي على سطح الشريط على الوجهين. اضغط على هامش كل رقعة للتأكد من أنها تلتصق بإحكام بالشريط. جمع 50-100 بيضة لكل شريحة مجهرية (الشكل 3C).
ملاحظة: تحتاج البقع إلى تغطية السطح الكامل للشريط على الوجهين ، وإلا فإن يرقات الفقس ستواجه صعوبة في الزحف إلى الخارج. - قبل الحقن المجهري ، حافظ على انزلاق المجهر على الجليد لتأخير تطور الأجنة.
3. الحقن المجهري للأجنة
- تحضير الإبرة عن طريق سحب الزجاج الشعري باستخدام مجتذب ماصة دقيقة (الشكل 4A). اضبط الحرارة على 540 ، واسحب إلى 80 ، و vel إلى 75 ، والوقت إلى 170 ، والضغط على 450. قم بتأريض طرف الإبرة باستخدام مطحنة صغيرة. تظهر الإبرة المثالية طرفا حادا الحواف (الشكل 4B).
- إعداد حلول الحقن. أضف 2 ميكرولتر من بروتين Cas9 التجاري (1 ملغم / مل) و sgRNA (التركيز النهائي 300-500 نانوغرام / ميكرولتر) إلى الماء الخالي من RNase في أنبوب PCR للحصول على خليط بحجم 10 ميكرولتر. يعتمد حجم sgRNA على تركيزه. تخلط جيدا عن طريق السحب ووضعها على الجليد.
ملاحظة: جميع أطراف الماصة وأنابيب PCR المستخدمة في هذه الخطوة خالية من RNase. - تعيين معلمات الحاقن الإلكتروني الصغير. اضبط ضغط الحقن (pi) على 1500 هيكتوباسكال، ووقت الحقن (ti) على 0.1 ثانية، وضغط التعويض (PC) على 30 هيكتوباسكال.
- قم بتحميل 2 ميكرولتر من الخليط في إبرة باستخدام طرف ماصة محمل صغير. يجب استنفاد الهواء المتبقي في طرف الإبرة قدر الإمكان.
- قم بتوصيل إبرة الحقن بجهاز مناور دقيق وتأكد من وجود اتصال وثيق بين الجزأين.
- ضع شريحة في طبق بتري (100 مم) وضعها على مسرح المجهر (الشكل 5A).
- اضبط موضع طرف الإبرة تحت المجهر الضوئي حتى يصبح كل من طرف الإبرة والأجنة مرئيين تحت المجهر (الشكل 5B).
- اضبط حجم القطرة. اضغط على الدواسة وراقب انخفاض السائل عند طرف الإبرة. اضبط ضغط الحقن للحاقن الدقيق حتى يبلغ حجم قطرة السائل حوالي عشر حجم الأجنة.
ملاحظة: جودة إبرة الحقن أمر حيوي لمعدل بقاء الأجنة. - أدخل طرف الإبرة بعناية في نصف الكرة العلوي للجنين بزاوية 45 درجة (الشكل 5C). اضغط على الدواسة لتوصيل الخليط إلى الجنين. الحقن يؤدي إلى توسع طفيف في الجنين. سحب الإبرة فورا من الجنين وتحريك طبق بتري بيد واحدة حتى يكون الجنين التالي على مقربة من الإبرة وحقن الجنين التالي بنفس الإجراء.
ملاحظة: التدفق السيتوبلازمي في الثقب مقبول. إذا كان التسرب السيتوبلازمي أكثر من اللازم ، فاضبط زاوية الإبرة إلى زاوية أكثر شدة حتى يتم التحكم في تدفق السوائل. - حقن ما لا يقل عن 300 جنين لضمان كمية كافية من الفقس. غطي غطاء طبق (أطباق) بتري بعد الحقن.
ملاحظة: يقتصر الوقت من وضع البيض إلى حقن الأجنة 50-100 على 2 ساعة. لا تزال معظم الأجنة في مرحلة الخلية الواحدة خلال هذا الإطار الزمني. بشكل عام ، من المفيد تكرار إجراء وضع البيض أثناء حقن الجنين لتعزيز الكفاءة.
4. تربية الحشرات بعد الحقن
- انتشار أجنة G0.
- احتضن الأجنة عند رطوبة نسبية 60٪ و 28 درجة مئوية في صندوق مناخ اصطناعي مع 14 ساعة ضوء / 10 ساعات مظلمة.
- تحقق من تطور الأجنة يوميا بعد الحقن. عندما يصبح لون سطح الأجنة مظلما ، ضع نظاما غذائيا اصطناعيا في طبق بتري حول شريحة المجهر ، وتحقق من تطور الأجنة كل 12 ساعة.
ملاحظة: يتم إعداد النظام الغذائي الاصطناعي كما هو موضح من قبل Wu et al.35 و Jha et al.36. - قم بإعداد لوحات استزراع من 24 بئرا واملأ كل بئر إلى ثلث طاقتها الحجمية بنظام غذائي اصطناعي.
- اختر يرقات الفقس (الشكل 5D) باستخدام فرشاة طلاء صغيرة وانقلها إلى لوحة الاستزراع المكونة من 24 بئرا. أدخل يرقة واحدة لكل بئر للتأكد من أن كل يرقة لديها ما يكفي من الطعام للبقاء على قيد الحياة.
ملاحظة: تم تربية يرقات H. armigera بشكل فردي في كل بئر لأنها عادة ما تأكل بعضها البعض.
- تربية يرقات G0
- قم بتربية اليرقات في نفس ظروف الأجنة.
- تحقق من اليرقات الفقس كل يوم. عندما تنمو اليرقات إلى المرحلة الثالثة من instar ، انقل كل يرقة إلى dactylethrae زجاجي جديد ، وملء خمس الحجم بنظام غذائي اصطناعي.
- ما يقرب من 12 د بعد الحضانة ، يجب أن تبدأ اليرقات الناضجة في الجرو.
- يتم تمييز الشرانق الناضجة G0 على أساس الجنس وتوضع في أقفاص منفصلة قبل eclosion. كما يتم إعداد الشرانق نفس العمر من النوع البري.
- G0 تربية البالغين
- تحقق من إغلاق كل من النوع البري والشرانق المتحولة يوميا.
- انقل البالغين الذكور G0 المغلقين حديثا والإناث البالغات من النوع البري إلى قفص شبكي جديد واجعل النسبة بين G0 والنوع البري عند حوالي 1: 1. تزويدهم بمحلول سكر بنسبة 10٪ (ث / ف) يسقط في كرات قطنية.
- الحشرات الخلفية باستخدام الطريقة الروتينية أعلاه حتى الجرو من الجيل الأول (G1).
- باستخدام dactylethrae ، انقل الزوج الفردي المغلق حديثا من البالغين G1 إلى وعاء بلاستيكي (13 سم × 12 سم × 12 سم) مزود بمحلول سكر 10٪ (ث / v). تغطية كل جرة مع الشاش. خذ حوالي 50 زوجا من البالغين G1 في المجموع.
ملاحظة: إن عزل العث الأنثوي يسبق انعث العث الذكر. بشكل عام ، يكون الذكر البالغ من العمر 3 أيام والأنثى البالغة من العمر 2 يوما ناضجين جنسيا ومستعدين للتزاوج. لن يتزاوج البالغون المغلقون حديثا في فترة الضوء الأولى دون إطعام. - جمع البالغين G1 في جرة بلاستيكية بعد أن وضعوا البيض. ضع كل عثة بالغة في أنبوب طرد مركزي 1.5 مل.
5. الكشف عن الطفرات بالضربة القاضية
- صمم زوجا من الاشعال التي تغطي الموقع المبتور المتوقع. يجب ضبط الاشعال على مسافة 50 نقطة أساس على الأقل على كلا الجانبين (المنبع والمصب) من الموقع المستهدف.
ملاحظة: غالبا ما تغطي الاشعال لتحديد التسلسل المستهدف امتدادات كبيرة لتضخيمها بكفاءة. - قم بإجراء تفاعل PCR باستخدام التمهيدي للتنميط الجيني مع الحمض النووي الجيني المستخرج في القسم 1. أداء ركوب الدراجات PCR في 95 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ؛ 35 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، 55 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ؛ 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، و4 درجات مئوية مع الانتظار. تحقق من منتج التفاعل عبر 1٪ (ث / v) هلام الأغاروز. تم تأكيد الزوج المحدد من الاشعال للكشف من خلال جودة منتج PCR. إذا كانت النطاقات واضحة ومحددة ، فيمكن استخدام الاشعال لمزيد من الكشف عن الطفرات بناء على حجم الأمبليكون.
- شاشة للأفراد المحتملين الذين تم تحريرهم. قم بإزالة الساق الخلفية بعناية باستخدام ملقط وضع كل ساق في أنبوب مصفوفة التحلل ، على التوالي. قم بتسمية أنبوب مصفوفة التحلل بما يتفق مع الرقم الموجود على dactylethrae الزجاجي.
- تجانس الساق الخلفية باستخدام مجانس الأنسجة. اضبط السرعة على 6.0 m/s والوقت على 60 s. استخراج الحمض النووي الجينومي للعينة المتجانسة باستخدام مجموعة استخراج gDNA التجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- تضخيم الجزء الجيني باستخدام التمهيدي التنميط الجيني مع نفس ظروف تفاعل PCR كما هو موضح في الخطوة 2. تأكيد النمط الوراثي بواسطة خدمة تسلسل الجينات. بمجرد اكتشاف الأنماط الجينية المتحورة G1 (التي تستهدف نفس الموقع) الموجودة في نفس الجرة ، احتفظ بذرية G1 وأعد تسميتها باسم الجيل الثاني (G2).
- ضع أفراد G1 من نفس النمط الوراثي في قفص صافي واحد. اعبر ذرية G1 ذاتيا واستمر في الفحص باستخدام نفس الطرق.
- تضخيم الجزء الجيني وتأكيد النمط الوراثي بنفس الإجراء كما هو موضح في الخطوة 2. الحصول على خطوط G2 متماثلة الزيجوت والحفاظ على خط المتحور بالضربة القاضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوفر هذا البروتوكول خطوات مفصلة للحصول على خطوط الضربة القاضية الجينية ل H. armigera باستخدام تقنية CRISPR / Cas9. يتم تلخيص النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها بواسطة هذا البروتوكول لاختيار الحمض النووي ، وجمع الأجنة وحقنها ، وتربية الحشرات ، والكشف عن الطفرات.
في هذه الدراسة ، كان الموقع المستهدف لجيننا محل اهتمامنا موجودا في إكسون الثاني (الشكل 2A). تم الحفاظ على هذا الموقع بشكل كبير ، وتم تأكيد جزء النطاق المستهدف من sgRNA المركب باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز (الشكل 2B و C و D).
تم تربية العث الذكور والإناث في البداية في أقفاص شبكية منفصلة لمنع التزاوج قبل الموعد المحدد وضمان كمية كافية من الأجنة قدر الإمكان. بشكل عام ، تم جمع ما مجموعه 300 بيضة مخصبة وتم حقنها على الفور بخليط بروتين sgRNA / Cas9 (300-500 نانوغرام / ميكرولتر من sgRNA ، 200 نانوغرام / ميكرولتر من بروتين Cas9) في مرحلة الخلية الواحدة. كان حجم الحقن حوالي عشر حجم الأجنة. بعد الحقن المجهري ، تم تربية الأجنة كما هو موضح في القسم 4 ، ونجا 40٪ -60٪ من الأجنة المحقونة.
تم إجراء الكشف عن المتحور لهدف sgRNA واحد عن طريق تسلسل منتجات PCR من البالغين الأبوين G1 (الشكل 6B). اختبرنا أيضا فعالية استخدام أزواج sgRNA غير المتداخلة عبر إكسونات مختلفة. يمكن تمييز الحذف الكبير للمتحورات (الشكل 6C و D) بسهولة عن نطاقات النوع البري (الشكل 6A).
كان معدل الطفرة المحسوب في هذا البروتوكول 87.50٪ عندما تم اختبار 16 فردا عشوائيا ، مما يشير إلى أن هذا البروتوكول كان عالي الكفاءة. تم عرض نتائج الضربة القاضية الجينية في العديد من الأنماط الجينية ، ولكن غالبية الطفرات التي تم تحديدها من فحصنا كانت من نوع -2 نقطة أساس. أدت الطفرات إلى الإنهاء المبكر لترجمة البروتين في الجينوم ، مما أدى لاحقا إلى فقدان وظيفة الجينات.
الشكل 1: المخطط الانسيابي لإعداد sgRNA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: اختيار وتوليف sgRNAs المستهدفة من H. armigera . (A) يمثل المجال الأصفر الإكسون ، بينما يمثل الخط الأسود الإنترون. تشير التسلسلات الحمراء إلى التسلسل المستهدف ، وتشير التسلسلات الزرقاء إلى الشكل المجاور للفاصل الأولي (PAM). (ب) تجميع PCR لقالب الحمض النووي sgRNA. (ج) منتج النسخ في المختبر. (د) تنقية الحمض النووي الريبوزي المرسال. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: جمع الأجنة . (أ) قفص شبكي مغطى بقطعة قماش سوداء. كانت العث الذكور والإناث من H. armigera تتزاوج. (ب) ينزلق المجهر بدون أجنة. (ج) شريحة المجهر التي تحتوي على 50-100 جنين على قطع من القماش الأسود. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحضير الإبرة . (أ) مجتذب الماصة الدقيقة. (ب) طرف إبرة الحقن المجهري بعد سحبها بواسطة مجتذب ماصة دقيقة. يشير المربع المنقط إلى طرف الإبرة المكبر. يمثل شريط المقياس 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: الحقن المجهري للأجنة. (أ) المجموعة الكاملة لنظام الحقن المجهري الذي يحتوي على مجهر (وسط) وحاقن مجهري إلكتروني (يسار) متصل بجهاز مناور دقيق (يمين). (ب) الأجنة وإبرة الحقن المجهري. (ج) يتم وضع علامة على موقع حقن الجنين بالسهم الأحمر. يمثل شريط المقياس 200 ميكرومتر (D) يرقة فقست تحت المجهر. يمثل شريط المقياس 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: الكشف عن الطفرات عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل والرحلان الكهربائي الهلامي. تشير الأسهم السوداء والخطوط الحمراء إلى المواقع المستهدفة ل sgRNA. (أ) يمثل النطاق الموجود في الحارة 1 جزء التضخيم المستمد من النوع البري. (ب) يمثل النطاقان في الحارتين 2 و3 جزء التضخيم المستمد من المتحور باستخدام هدف واحد من أهداف sgRNA. (ج) الكشف عن متغاير الزيجوت باستخدام زوج من sgRNA غير المتداخلة. تمثل النطاقات الموجودة في الممرات 4 و 5 جزء التضخيم المستمد من طفرة هدفين من أهداف sgRNA. تشير النطاقات السفلية إلى حذف جزء كبير. (د) النتائج مشتقة من متماثل الزيجوت. تشير الأشرطة الموجودة في الحارة 6 و 7 إلى حذف الجزء الكبير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد وفر تطبيق نظام كريسبر/كاس9 دعما تقنيا قويا لتحليل وظيفة الجينات والتفاعل بين الجينات المختلفة. يوضح البروتوكول المفصل الذي نقدمه هنا توليد متحور متماثل الزيجوت في H. armigera عبر تحرير الجينوم CRISPR / Cas9. يوفر هذا الإجراء الموثوق به طريقة مباشرة لتكوين الطفرات الجينية الموجهة في H. armigera.
ويمكن أن يؤثر اختيار المواقع المستهدفة من كريسبر على كفاءة الطفرة37. في هذا البروتوكول ، قمنا بمقارنة وتحليل نتائج متعددة من موقع CRISPOR على الإنترنت للحصول على موقع مستهدف مناسب. في سيليكو ، تقدم تنبؤات gRNA بعض المزايا. أولا ، يقومون بتحليل الجينوم الكامل ل H. armigera عند تصميم sgRNAs لتقليل التأثيرات غير المستهدفة. تعمل الموارد عبر الإنترنت المذكورة أعلاه ، وكذلك CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) ، مع عدد من جينومات Lepidoptera ، والتي يمكن أن تكون مفيدة لتحرير الجينات في عث Lepidopteran الأخرى. ثانيا ، يقارن ترتيب sgRNAs المرشحة مباشرة الاحتمالات ولكن قد يتضمن بعض الاختلافات بناء على الخوارزميات المختلفة. يميل تسلسل المرشحين ذوي التصنيفات العالية في كلتا القائمتين إلى أن يكون أكثر موثوقية. ومع ذلك ، فإن أحد القيود الرئيسية لهذا البروتوكول هو أن عددا كبيرا من جينومات الحشرات غائبة في قواعد بيانات مواقع الويب ، لذلك هناك احتمال لتأثيرات خارج الهدف. هناك قيد آخر هو أن تسلسل PAM ضروري لتصميم sgRNA ، مما قد يؤدي إلى عدم القدرة على العثور على موقع مستهدف مناسب.
الأنسجة المستخدمة لفحص الطفرات هي أيضا عامل حاسم. لا ينبغي أن يتأثر معدل البقاء على قيد الحياة ودورة الحياة والوظائف الفسيولوجية للحشرات. في عمليتنا لاستكشاف الطريقة المثلى لاستخراج gDNA ، تمت محاولة استخراج الهيموليمف الصغير من اليرقات للكشف عن الطفرات لتوفير الوقت وتجنب التزاوج (بيانات غير منشورة). ومع ذلك ، جلبت هذه الطريقة المزيد من التحديات فيما يتعلق بكفاءة تضخيم PCR ومعدلات البقاء على قيد الحياة للبالغين (البيانات غير معروضة). بالإضافة إلى ذلك ، أبلغ Zheng et al.38 عن طريقة غير مدمرة لاستخراج gDNA باستخدام exuviate أو puparia. وبناء على هذه النتائج، قمنا بتعديل واستكشاف نهج باستخدام الأرجل الخلفية لاستخراج الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين، والذي يسمح للعث البالغ بالبقاء والتزاوج بشكل طبيعي، مما يحسن بشكل كبير من دقة الكشف عن نمط وراثي معين. لذلك ، طورنا طريقة جديدة لزيادة معدل نجاح استخراج gDNA عن طريق إزالة إحدى الساقين الخلفيتين من كل مرشح بالغ. كما أكدنا أن هذه العملية لم تؤثر على معدل البقاء على قيد الحياة وتواتر التزاوج للعث البالغ. علاوة على ذلك ، وجدنا أن حذف الشظايا الكبيرة يمكن ملاحظته بسهولة بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي عند حقنه المشترك مع زوج من الحمض النووي الريبوزي المرسال عبر مناطق إكسون (الشكل 6) ، مما يبسط عملية تحديد المتحور عند الفحص.
يتم جمع بيض H. armigera على قطعة قماش سوداء ، مما يجعل من السهل التمييز بين البيض تحت المجهر في عملية الحقن المجهري (الشكل 5B). نظرا للسلوكيات التناسلية الشائعة لعث Lepidopteran مثل التزاوج ، ووضع البيض ، والفقس ، و eclosion39,40,41 ، يمكن أيضا تطبيق تقنية جمع البيض هذه على عث Lepidopteran الأخرى.
في الختام ، أثبت نظام CRISPR / Cas9 أنه أداة موثوقة لتسهيل دراسات الجينوم الوظيفية في H. armigera. تمكن الأوصاف خطوة بخطوة المستخدمين من إكمال عملية تحرير الجينات المتكاملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31725023 ، 31861133019 إلى GW ، و 31171912 إلى CY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
References
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR. Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).
- Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. CRISPR editing in biological and biomedical investigation. Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).
- Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model. DNA Repair. 46, 1-8 (2016).
- Wu, J., et al. Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).
- Jiao, R., Gao, C. The CRISPR/Cas9 genome editing revolution. Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).
- Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems. World Patent Information. 60, 101944 (2020).
- Es, I., et al. The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges. Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).
- Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes. Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).
- Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -G. CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications. Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).
- Pandey, P. K., et al. Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research. Seminars in Cell & Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
- Mojica, F. J., Montoliu, L. On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals. Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Koutroumpa, F., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).
- Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).
- Fitt, G. P. The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems. Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).
- Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (Hübner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management. Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).
- Ai, D., et al. Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera Hübner (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).
- Wan, F., et al. A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Cheng, T., et al. Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest. Nature Ecology & Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).
- Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore. Science Reports. 6, 23666 (2016).
- Gouin, A., et al. Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Wang, J., et al. Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).
- Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins. Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).
- Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm. PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).
- Jin, L., et al. Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).
- Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision. Tobacco Sciene & Technology. 53 (2), 21-26 (2019).
- Wu, K., Gong, P. A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm. Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).
- Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics. Environmental Entomology. (1), 30 (2012).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).
- Zheng, M. -Y., et al. A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia. Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).
- Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae). Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).
- Kamimura, M., Tatsuki, S. Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).
- Edwards, K. D. Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE). Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).
