Summary
מוצג כאן פרוטוקול של Helicoverpa armigera (Hübner) עובר microinjection וזיהוי מוטציה נוקאאוט שנוצר על ידי עריכת הגנום CRISPR / Cas9. חרקים מוטנטיים מאפשרים מחקר נוסף של תפקוד הגנים ואינטראקציה בין גנים שונים ב- vivo.
Abstract
תולעת הכותנה, הליקוברפה ארמיגרה, היא אחד המזיקים ההרסניים ביותר בעולם. שילוב של גנטיקה מולקולרית, פיזיולוגיה, גנומיקה תפקודית ומחקרים התנהגותיים הפך את H. armigera למין מודל ב- Lepidoptera Noctuidae. כדי לחקור את הפונקציות in vivo של ואינטראקציות בין גנים שונים, מקובצים באופן קבוע interspaceed חזרות פלינדרומיות קצרות (CRISPR)/ הקשורים חלבון 9 (Cas9) טכנולוגיית עריכת גנום היא שיטה נוחה ויעילה המשמשת לביצוע מחקרים גנומיים פונקציונליים. במחקר זה, אנו מספקים שיטה שיטתית שלב אחר שלב כדי להשלים נוקאאוט גנים ב H. armigera באמצעות מערכת CRISPR / Cas9. העיצוב והסינתזה של מדריך RNA (gRNA) מתוארים בפירוט. לאחר מכן, השלבים הבאים המורכבים מתכנון פריימר ספציפי לגנים ליצירת RNA מדריך (gRNA), איסוף עוברים, מיקרו-גירוי, גידול חרקים וזיהוי מוטציות מסוכמים. לבסוף, עצות והערות לפתרון בעיות מסופקות כדי לשפר את היעילות של עריכת גנים. השיטה שלנו תשמש התייחסות ליישום של עריכת גנום CRISPR / Cas9 ב H. armigera , כמו גם עשים אחרים Lepidopteran.
Introduction
היישום של טכנולוגיית עריכת הגנום מספק כלי יעיל להשגת מוטציות גן יעד במינים מגוונים. הופעתה של מערכת החזרות הפלינדרומיות הקצרות המקובצות באופן קבוע (CRISPR)/חלבון קשור 9 (Cas9) מספקת שיטה חדשנית לתפעול הגנום1. מערכת CRISPR/Cas9 מורכבת מ-RNA מדריך (gRNA) ו-Cas9 endonuclease2,3, בעוד שניתן לחלק עוד יותר את ה-gRNA לשני חלקים, RNA CRISPR משלים מטרה (crRNA) וקרנ"א טרנס-הפעלה (tracrRNA). ה- gRNA משתלב עם אנדונוקלאז Cas9 ויוצר ריבונוקלאופרוטאין (RNP). עם gRNA, ניתן להפנות אנדונוקלאז Cas9 לאתר מסוים של הגנום באמצעות השלמת בסיס. תחומי RuvC ו- HNH של ה- Cas9 מבקעים את אתר היעד של הגנום שלושה בסיסים לפני רצף המוטיב הסמוך לפרוטו-חלל (PAM) ויוצרים הפסקה כפולת גדילים (DSB). לאחר מכן ניתן לתקן את מחשוף ה- DNA באמצעות שני מנגנונים, צירוף קצה לא הומולוגי (NHEJ) או תיקון מונחה הומולוגיה (HDR)4. תיקון של DSB מציג הוספות או מחיקות כדרך להשבית את הגן הממוקד, שעלול לגרום לאובדן מוחלט של תפקוד הגנים. לפיכך, הגילוי והספציפיות של מערכת CRISPR/Cas9 הופכים אותה לשיטה חזקה לאפיון פונקציות גנים ב- vivo ולניתוח אינטראקציות גנים5.
עם יתרונות רבים, מערכת CRISPR/Cas9 יושמה בתחומים שונים, כולל ביו-רפואה6,7, טיפול גנטי8,9 וחקלאות10,11,12, ושימשה למערכות ביולוגיות שונות כולל מיקרואורגניזמים13, צמחים14,15, נמטודות16 , ויונקים17 . אצל חסרי חוליות, מינים רבים של חרקים נחשפו לעריכת גנום CRISPR/Cas9, כגון זבוב הפירות Drosophila melanogaster ומעבר ל-18,19,20,20,21,22.
ארמיגרה הליקוברפה הוא אחד המזיקים ההרסניים ביותר ברחבי העולם23, ופוגע ביבולים רבים, כולל כותנה, פולי סויה וסורגום24,25. עם התפתחות טכנולוגיית הרצף, הגנום של H. armigera, כמו גם של מגוון של מיני חרקים לפידופטרה, כבר רצף לחלוטין 26,27,28,29. מספר רב של גנים של התנגדות קולטן חוש הריח זוהו ואופיינו מחרקים אלה בשנים האחרונות19,27,28,29. כמה גנים הקשורים להתנגדות זוהו H. armigera, כגון קידוד הגנים עבור cadherin30, טרנספורטר קלטות מחייב ATP31,32, כמו גם HaTSPAN133. נוקאאוט של גנים אלה באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9 גורם לרמה גבוהה של עמידות לרעלן Bacillus thuringiensis (BT) בזנים רגישים. כמו כן, צ'אנג ואח ' (2017) דפק את קולטן פרומון, אשר אימת את תפקידו המשמעותי ברגולציה זמן ההזדווגות19. דיווחים אלה מצביעים על כך ש-CRISPR/Cas9 יכול לשמש ככלי יעיל לחקר תפקוד הגנים במערכות חרקים. עם זאת, הליך מפורט לשינוי CRISPR/Cas9 במערכות החרקים נותר לא שלם, מה שמגביל את טווח היישום שלו בגנומיקה תפקודית של חרקים.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפלת גן פונקציונלי ב H. armigera באמצעות מערכת CRISPR / Cas9. פרוטוקול מפורט מפורט שלב אחר שלב מסופק, כולל תכנון והכנה של פריימרים ספציפיים לגן לייצור gRNA, איסוף עוברים, מיקרו-חדירה, גידול חרקים וזיהוי מוטציות. פרוטוקול זה משמש התייחסות בעלת ערך למניפולציה של כל הגנים התפקודיים ב - H. armigera וניתן להרחיבו למינים אחרים של לפידופטרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. עיצוב פריימרים ספציפיים לגן והכנת sgRNA
- אמת אזור גנומי שמור בגן העניין באמצעות הגברת PCR וניתוחי רצף. הגבר את גן המטרה מהדנ"א הגנומי של H. armigera והבדיל בין האקסונים והאינטרונים.
הערה: הספציפיות של הרצף של אתר המדריך נחוצה כדי למנוע עריכת גנים מחוץ למטרה. חיפוש אתרי מדריך אפשריים אקסונים קרובים 5 ' UTR של הגן. לאחר מכן, חשוב לוודא כי הגן הוא לגמרי לא פונקציונלי. סיכום נתיב הזרימה להכנת sgRNA מומחש באיור 1. - בחר את מטרות sgRNA. השתמש באתר האינטרנט המקוון CRISPR CRISPOR (גרסה 4.97) (http://crispor.tefor.net/crispor.py) כדי לחפש אתרי מדריך אפשריים באקסונים קרוב ל- 5' UTR של הגן. הזן את רצף האקסון בתיבת הטקסט ובחר את הגנום המשמש כיעד להליקוברפה ארמיגרה (Harm_1.0). בחר את האפשרות המוטיב הסמוך protospacer (PAM) של "20 bp-NGG" ולהשאיר את ההגדרות האחרות על הפרמטרים ברירת המחדל על פי מדריכים המשתמש של אתרי האינטרנט.
- השווה את רצפי המדריך החזויים מהתוכנה ובחר את רצף המדריכים עם היעילות החזויה הגבוהה ביותר והפחות אי-התאמות כדי לשפר את יעילות העריכה ולהפחית את העריכה מחוץ ליעד. מומלץ רצף מדריך של 20 bp המכיל G אחד או שניים ב- UTR 5' מכיוון שהוא יכול להגביר את יעילות החיתוך.
הערה: זוג gRNAs על פני אזורי אקסון מומלץ גם לקבל מחיקת מקטע גדולה, אשר מפשטת זיהוי מוטציות בשלבים מאוחרים יותר. ודא שמרחק המרווח בין שני רצפי קו היישור שנבחרו הוא לפחות 100 bp. בפרוטוקול זה, אנו בוחרים את חלבון SpCas9 הנפוץ, המזהה את מוטיב NGG. על פי הוראת היצרן, רצף המדריך חסר G מקובל גם בעת בחירת מקדם T7 כי האמרגן מוסיף G ל 5 ' UTR של הרצף. - עצבו קדימה והפוך אוליגונוקלאוטידים. הגדר את סדר הרצף לרצף מדריך 5'-20 bp-NGG-3' והפוך להשלים את רצף המדריך. הוסף את רצף מקדם T7 לרצף מדריך גדיל קדימה והפוך, בהתאמה על פי מדריך המשתמש של ערכת סינתזת gRNA.
הערה: יש לא לכלול את רצף PAM NGG ברצף האוליגונוקלאוטיד. - צור את sgRNA באמצעות ערכת סינתזת gRNA. תהליך זה כולל שלושה שלבים: הרכבת תבנית DNA, תמלול הפריה חוץ גופית וטיהור של sgRNA (איור 2). בצע כל שלב בהתאם להוראות המשתמש.
2. הכנה ואיסוף עוברים
- הפרד בין גולם זכר לנקבה כפי שתואר על ידי Hongtao et al.34 ולהפריד אותם לשני כלובי רשת שונים. לאחר עיקול, להאכיל אותם ~ 30 מ"ל של 10% (w / v) פתרון סוכר לבן כותנה סופגת בצלחת פטרי.
הערה: 3 גרם של סוכר לבן הומס ב 30 מ"ל של מים סטריליים כדי להכין את 10% (w / v) פתרון סוכר לבן. - בחרו 50 אנשים בריאים מזכרים בני 3 ימים ונקבות בנות יומיים, בהתאמה, וערבבו אותם בכלוב רשת נקי. מניחים חתיכת כותנה המכילה 10% (w / v) פתרון סוכר בכלוב ולשמור על הכותנה לחה. לכסות את כלובי הרשת עם גזה ולתקן את הגזה עם גומייה. לרסס מים על הגזה כדי לשמור על לחות.
- אפשר לעשים זכריים ונקביים נבחרים בשלב 2 להזדווג לחלוטין ולהתבונן בכמות הטלת הביצים.
הערה: שיא ההוויה של H. armigera מופיע לאחר 21:00.m. לכן, יש לשקול את זמן ההזדווגות כדי להבטיח מספר מספיק של ביצים בשלבים הבאים. בשיאה של oviposition, להחליף את הגזה עם בד שחור ולאפשר oviposition חינם במשך 30 דקות. החליפו את הבד השחור כל 30 דקות לאיסוף ביצים טריות (איור 3A). - חותכים את הבד השחור לכתמים בצורה לא סדירה בגודל של 3 מ"מ בערך. ודא ביצים נוספות על כל תיקון.
הערה: הימנעו מבחירת ביצים מקומטות מכיוון שהן בדרך כלל לא מופרות. - הדבק סרט דו-צדדי על שקופית מיקרוסקופ (25 מ"מ x 75 מ"מ) (איור 3B). בעזרת מלקחיים, הדבק את הטלאים בביצים בשורה על פני השטח של הסרט הדו-צדדי. הקש על השוליים של כל תיקון כדי לוודא שהם נדבקים בחוזקה לקלטת. אסוף 50-100 ביצים לכל שקופית מיקרוסקופ (איור 3C).
הערה: הטלאים צריכים לכסות את המשטח המלא של הסרט הדו-צדדי, אחרת הזחל הבוקע יתקשה לזחול החוצה. - לפני המיקרו-הנדסה, שמור את החלקת המיקרוסקופ על הקרח כדי לעכב את התפתחות העוברים.
3. מיקרו-חדירה של עוברים
- הכינו את המחט על ידי משיכת זכוכית נימית באמצעות משיכת מיקרופיפט (איור 4A). הגדר חום ל 540, למשוך ל 80, Vel ל 75, זמן ל 170 , ולחץ ל 450. טחון קצה המחט באמצעות מטחנת מיקרו. המחט האידיאלית מציגה קצה חד (איור 4B).
- הכנת פתרונות הזרקה. הוסף 2 μL של חלבון Cas9 ממוסחר (1 מ"ג / מ"ל) ו sgRNA (300-500-500 ng / μL ריכוז סופי) למים ללא RNase בצינור PCR כדי לקבל תערובת נפח 10 μL. נפח ה- sgRNA תלוי בריכוז שלו. מערבבים היטב על ידי צנרת ולשים אותו על קרח.
הערה: כל הטיפים לפיפטה וצינורות PCR המשמשים בשלב זה הם ללא RNase. - הגדר את הפרמטרים של המיקרו-מגרר האלקטרוני. הגדר את לחץ ההזרקה (pi) ל 1,500 hPa, זמן ההזרקה (ti) ל 0.1 s, ואת לחץ הפיצוי (pc) ל 30 hPa.
- טען 2 μL של התערובת לתוך מחט באמצעות קצה פיפטה מעמיס מיקרו. האוויר השיורי בקצה המחט צריך להיות מותש ככל האפשר.
- חבר את מחט ההזרקה למיקרו-מניפולטור והבטח חיבור הדוק בין שני החלקים.
- מניחים שקופית בצלחת פטרי (100 מ"מ) ומניחים אותה על הבמה של המיקרוסקופ (איור 5A).
- התאימו את מיקום קצה המחט מתחת למיקרוסקופ אור עד שגם קצה המחט וגם העוברים יהיו גלויים מתחת למיקרוסקופ (איור 5B).
- כוונן את עוצמת הקול של הטיפה. לחץ על הדוושה וצפה טיפת הנוזל בקצה המחט. התאם את לחץ ההזרקה של המיקרו-גנרטור עד שהנפח של ירידה נוזלית הוא כעשירית מנפח העוברים.
הערה: איכות מחט ההזרקה חיונית לשיעור ההישרדות של עוברים. - הכנס בזהירות את קצה המחט לחצי הכדור העליון של עובר בזווית של 45 מעלות (איור 5C). לחץ על הדוושה כדי להעביר את התערובת לתוך העובר. הזריקה מובילה להתרחבות קלה של העובר. משכו את המחט מיד מהעובר והזיזו את צלחת הפטרי ביד אחת עד שהעובר הבא נמצא בסמיכות למחט והזריקו לעובר הבא את אותו הליך.
הערה: היציאה הציטופלסמית בחור הסיכה מקובלת. אם הדליפה הציטופלסמית היא יותר מדי, התאם את זווית המחט לזווית חמורה יותר עד שזרימת הנוזלים נשלטת. - הזריקו לפחות 300 עוברים כדי להבטיח כמות בקיעה מספקת. מכסים את המכסה של צלחת פטרי (es) לאחר ההזרקה.
הערה: הזמן מ oviposition להזרקה של 50-100 עוברים מוגבל ל 2 שעות. רוב העוברים עדיין נמצאים בשלב של תא אחד במסגרת זמן זו. באופן כללי, כדאי לחזור על הליך oviposition במהלך הזרקת עובר כדי לקדם את היעילות.
4. גידול חרקים לאחר הזרקה
- הפצת עוברים G0.
- לדגור על העוברים ב 60% לחות יחסית ו 28°C בתיבת אקלים מלאכותית עם 14 שעות אור / 10 שעות כהה.
- בדוק את התפתחות העוברים מדי יום לאחר ההזרקה. כאשר צבע פני השטח של העוברים החשיך, לשים דיאטה מלאכותית בצלחת פטרי סביב שקופית מיקרוסקופ, ולבדוק את התפתחות העוברים כל 12 שעות.
הערה: הדיאטה המלאכותית מוכנה כמתואר על ידי Wu et al.35 ו Jha et al.36. - הכינו צלחות תרבית של 24 בארות ומלאו כל באר עד שליש מקיבולת הנפח שלה בתזונה מלאכותית.
- בחרו זחלים בוקעים (איור 5D) בעזרת מברשת צבע קטנה והעבירו אותם לצלחת התרבותית בת 24 הבארות. הכנס זחל אחד לבאר כדי להבטיח שלכל זחל יש מספיק מזון כדי לשרוד.
הערה: הזחלים של H. armigera גדלו בנפרד בכל באר מאז הם בדרך כלל קניבלים זה את זה.
- גידול זחלי G0
- עורף את הזחלים באותם תנאים כמו העוברים.
- תבדוק את הזחלים שבקעו כל יום. כאשר הזחלים גדלים לשלב האינסטאר השלישי, מעבירים כל זחל לדקטילטרה זכוכית חדשה, וממלאים חמישית מהנפח בתזונה מלאכותית.
- כ 12 d לאחר הדגירה, הזחלים הבוגרים צריכים להתחיל גור.
- הגולם הבוגר G0 נבדלים על בסיס מין ומונחים בכלובים נפרדים לפני עיקול. כמו כן מכינים את הגלמים בני הגיל הרך מסוג בר.
- G0 מבוגרים גדלים
- בדוק את העיקול של סוג פראי וגולם מוטנטי מדי יום.
- העבר את זכרי G0 שזה עתה עיקלו ונקבות בוגרות מסוג בר לכלוב רשת טרי והפוך את היחס בין G0 לסוג הפראי בערך 1:1. לספק להם עם 10% (w / v) פתרון סוכר ירד כדורי כותנה.
- חרקים אחוריים בשיטה השגרתית לעיל עד הגור של דור אחד (G1).
- בעזרת dactylethrae, העבירו את הזוג הבודד החדש של בוגרי G1 לצנצנת פלסטיק (13 ס"מ x 12 ס"מ על 12 ס"מ על 12 ס"מ) המסופקת עם תמיסת סוכר של 10% (w/v). מכסים כל צנצנת בגאזה. קח בערך 50 זוגות של מבוגרים G1 בסך הכל.
הערה: עיקול של עשים נקביים קדם לזה של עש זכר. באופן כללי, גבר בן 3 ימים ונקבה בת יומיים בוגרים מינית ומוכנים להזדווג. המבוגרים שזה עתה עיקלו לא יזדווגו בתקופת האור הראשונה שלהם ללא האכלה. - לאסוף את המבוגרים G1 בצנצנת פלסטיק לאחר שהטילו ביצים. שים כל עש מבוגר בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל.
5. זיהוי מוטציות נוק-אאוט
- עצב זוג פריימרים המשתרעים על פני האתר החתוך החזוי. יש להגדיר את הפריימרים במרחק של לפחות 50 bp משני הצדדים (במעלה הזרם ובמורד הזרם) מאתר היעד.
הערה: הפריימרים לזיהוי רצף היעד מכסים לעתים קרובות טווחים גדולים כדי להגביר ביעילות. - בצע את תגובת PCR באמצעות פריימרים genotyping עם DNA הגנום שחולצו בסעיף 1. בצע רכיבה על אופניים PCR ב 95 °C (50 °F) עבור 20 s; 35 מחזורים של 95 °C עבור 20 s, 55 °C (55 °F) עבור 20 s, 72 °C (72 °F) במשך 1 דקות; 72 °C (7 °F) במשך 5 דקות, ו 4 °C (60 °F) בהמתנה. לאמת את מוצר התגובה באמצעות 1% (w / v) ג'ל agarose. הזוג הנבחר של פריימרים לזיהוי אושר על ידי האיכות של מוצר PCR. אם הרצועות ברורות וספציפיות, הפריימרים יכולים לשמש לגילוי מוטציות נוסף בהתבסס על גודל האמפליקונים.
- מסך עבור אנשים ערוכים פוטנציאליים. הסר רגל אחורית בזהירות באמצעות מלקחיים ולשים כל רגל בצינור מטריצה lysing, בהתאמה. סמן את צינור מטריצת הליסינג בהתאם למספר על דקטילטרה הזכוכית.
- הומוגניזציה של הרגל האחורית באמצעות הומוגניזר רקמות. הגדר את המהירות ל-6.0 מ'/ש' ואת השעה ל-60 שניות. לחלץ את ה- DNA הגנומי של המדגם הומוגני באמצעות ערכת מיצוי gDNA מסחרית על פי הוראות היצרן.
- הגבר את מקטע הגנים באמצעות פריימרים genotyping עם אותם תנאי תגובת PCR כמתואר בשלב 2. אשר את הגנוטיפ על-ידי שירות ריצוף גנים. לאחר שזוהו גנוטיפים מוטנטיים G1 (היעד לאותו אתר) הכלולים באותה צנצנת, שמור על צאצאי G1 ושנה את שמו לדור השני (G2).
- שים G1 אנשים מאותו גנוטיפ בכלוב רשת אחד. חוצים את צאצאי ה-G1 וממשיכים לסנן באותן שיטות.
- הגבר את מקטע הגנים ואשר את הגנוטיפ באותו הליך כפי שמתואר בשלב 2. להשיג קווי הומוזיגוס G2 ולשמור על קו מוטציה נוק-אאוט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מספק שלבים מפורטים להשגת קווי נוק-אאוט גנטיים של H. armigera באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9. התוצאות הייצוגיות שהושגו על ידי פרוטוקול זה מסוכמות עבור בחירת gDNA, איסוף עוברים והזרקה, גידול חרקים וזיהוי מוטציות.
במחקר זה, אתר היעד של גן העניין שלנו היה ממוקם באקסון השני שלו (איור 2A). אתר זה נשמר מאוד, ורסיס רצועת היעד של sgRNA מסונתז אושר באמצעות אלקטרופורזה ג'ל agarose (איור 2B, C,D).
העשים הזכרים והנקבות גודלו בתחילה בכלובי רשת נפרדים כדי למנוע הזדווגות מוקדם מהמתוכנן ולהבטיח כמות מספקת של עוברים ככל האפשר. באופן כללי, מספר כולל של 300 ביצים מופרות נאספו והוזרקו מיד עם תערובת חלבון sgRNA / Cas9 (300-500 ng/μL של sgRNA, 200 ng/ μL של חלבון Cas9) בשלב של תא אחד. נפח ההזרקה היה בערך עשירית מזה של העוברים. לאחר מיקרו-חדירה, העוברים גודלו כמתואר בסעיף 4, ו-40%-60% מהעוברים המוזרקים שרדו.
זיהוי המוטציות של יעד sgRNA יחיד בוצע על ידי ריצוף מוצרי PCR ממבוגרים הוריים G1 (איור 6B). בדקנו גם את האפקטיביות של שימוש בזוגות sgRNA שאינם חופפים על פני אקסונים שונים. ניתן להבחין בקלות בין המחיקה הגדולה של המוטנטים (איור 6C,D) לבין להקות מסוג פראי (איור 6A).
שיעור המוטציה המחושב בפרוטוקול זה היה 87.50% כאשר 16 אנשים נבדקים באופן אקראי, מה שמצביע על כך שפרוטוקול זה היה יעיל ביותר. תוצאות נוקאאוט גנים הוצגו במספר גנוטיפים, אבל רוב המוטנטים שזוהו מההקרנה שלנו היו מסוג מינוס 2 bp. מוטציות גרמו להפסקה מוקדמת של תרגום חלבונים בגנום, מה שהוביל לאחר מכן לאובדן תפקוד הגנים.
איור 1: תרשים הזרימה להכנת sgRNA. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: בחירה וסינתזה של sgRNAs יעד מ H. armigera. (A) התחום הצהוב מייצג את האקסון, בעוד הקו השחור מייצג את האינטרון. הרצפים האדומים מציינים את רצף היעד, והרצפים הכחולים מציינים את המוטיב הסמוך לפרוטו-חלל (PAM). (ב) הרכבת PCR של תבנית ה- DNA של sgRNA. (ג) מוצר שעתוק במבחנה. (ד) טיהור של sgRNA. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אוסף עוברים. (א) כלוב רשת מכוסה בד שחור. העשים הזכרים והנקביים של ה. ארמיגרה הזדווגו. (ב) שקופית המיקרוסקופ ללא עוברים. (ג) שקופית המיקרוסקופ המכילה 50-100 עוברים על חתיכות בד שחור. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הכנת מחט. (א) מושך מיקרופיפט. (B) קצה של מחט microinjection לאחר משיכה על ידי מושך micropipette. הקופסה המנוקדת מציינת את קצה המחט המוגדל. סרגל קנה המידה מייצג 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מיקרו-ג'ינג'ים עובריים. (A) כל הסט של מערכת מיקרו-הנדסה המכילה מיקרוסקופ (אמצע) ומיקרו-מקרן אלקטרוני (משמאל) המחובר למיקרו-מניפולטור (מימין). (B) עוברים ומחט מיקרו-חדירה. (ג) אתר ההזרקה של העובר מסומן בחץ האדום. סרגל קנה המידה מייצג 200 מיקרומטר. (D) זחל בקעה מתחת למיקרוסקופ. סרגל קנה המידה מייצג 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: זיהוי מוטנטים באמצעות אלקטרופורזה PCR וג'ל. החצים השחורים והקווים האדומים מציינים את אתרי היעד של ה-sgRNA. (א) הרצועה בנתיב 1 מייצגת את קטע ההגברה הנגזר מסוג פראי. (B) הרצועות בנתיבים 2 ו-3 מייצגות את קטע ההגברה הנגזר ממוטנט באמצעות מטרה אחת של sgRNA. (ג) זיהוי הטרוזיגוטה באמצעות זוג sgRNA שאינו חופף. הרצועות בנתיבים 4 ו-5 מייצגות את שבר ההגברה הנגזר מהמוטציה של שתי מטרות sgRNA. הרצועות התחתונות מציינות מחיקת מקטע גדולה. (ד) התוצאות נגזרות מהומוזיגוטה. הרצועות בנתיבים 6 ו-7 מציינות את מחיקת הרסיסים הגדולה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היישום של מערכת CRISPR/Cas9 סיפק תמיכה טכנית רבת עוצמה לניתוח תפקוד הגנים ואינטראקציה בין גנים שונים. הפרוטוקול המפורט שאנו מציגים כאן מדגים את הדור של מוטציה הומוזיגוטה ב H. armigera באמצעות עריכת גנום CRISPR / Cas9. הליך אמין זה מספק דרך פשוטה עבור mutagenesis גנים מכוונים ב H. armigera.
הבחירה באתרי היעד של CRISPR עשויה להשפיע על יעילות המוטגנזה37. בפרוטוקול זה, השווינו וניתחנו תוצאות מרובות מאתר האינטרנט המקוון CRISPOR כדי להשיג אתר יעד מתאים. בסיליקו, תחזיות gRNA מציגות כמה יתרונות. ראשית, הם מנתחים את כל הגנום של H. armigera בעת עיצוב sgRNAs כדי למזער את ההשפעות מחוץ למטרה. המשאבים המקוונים שהוזכרו לעיל, כמו גם CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/), פונקציה עם מספר גנומים Lepidoptera, אשר יכול להיות מועיל לעריכת גנים בעשים Lepidopteran אחרים. שנית, הדירוג של sgRNAs המועמד משווה ישירות אפשרויות אך עשוי לכלול כמה וריאציות המבוססות על האלגוריתמים השונים. רצף המועמדים עם דירוגים גבוהים בשתי הרשימות נוטה להיות אמין יותר. עם זאת, מגבלה מרכזית של פרוטוקול זה היא כי מספר רב של גנום חרקים נעדרים במאגרי הנתונים של אתרי האינטרנט, ולכן יש פוטנציאל להשפעות מחוץ למטרה. מגבלה נוספת היא כי רצף PAM הכרחי עבור עיצוב sgRNA, אשר עלול לגרום לחוסר היכולת למצוא אתר יעד מתאים.
הרקמות המשמשות להקרנת מוטציות הן גם גורם מכריע. אין להשפיע על שיעור ההישרדות, מחזור החיים והתפקודים הפיזיולוגיים של החרקים. בתהליך שלנו של חקר שיטת החילוץ האופטימלית gDNA, מיצוי מיקרו המולימפה מזחלים נעשה ניסיון לגילוי מוטציות כדי לחסוך זמן ולהימנע מהזדווגות (נתונים שלא פורסמו). עם זאת, שיטה זו הביאה אתגרים נוספים לגבי היעילות של הגברת PCR ואת שיעורי ההישרדות של מבוגרים (נתונים לא מוצגים). בנוסף, Zheng et al.38 דיווח על שיטה לא הרסנית עבור מיצוי gDNA באמצעות exuviate או puparia. בהתבסס על ממצאים אלה, שינינו ובחנו גישה באמצעות רגליים אחוריות לחילוץ gDNA, המאפשרת לעשים בוגרים לשרוד ולהזדווג באופן טבעי, ובכך לשפר באופן משמעותי את דיוק הזיהוי של גנוטיפ נתון. לכן, פיתחנו שיטה חדשה כדי להגדיל את שיעור ההצלחה של מיצוי gDNA על ידי הסרת אחת הרגליים האחוריות מכל מועמד מבוגר. עוד אישרנו כי פעולה זו לא השפיעה על שיעור ההישרדות ותדירות ההזדווגות של עשים בוגרים. יתר על כן, מצאנו כי מחיקת שבר גדול ניתן לראות בקלות על ידי אלקטרופורזה ג'ל כאשר מוזרק שיתוף עם זוג gRNAs על פני אזורי exon (איור 6), אשר מפשט את תהליך זיהוי מוטציה בעת ההקרנה.
הביצים של H. armigera נאספות על בד שחור, מה שמקל על ההבחנה בין הביצים מתחת למיקרוסקופ בתהליך המיקרו-הנדסה (איור 5B). בשל התנהגויות הרבייה הנפוצות של עשים Lepidopteran כגון הזדווגות, oviposition, בקיעה, ו eclosion39,40,41, טכניקה זו איסוף ביצים יכול להיות מיושם גם עבור עשים Lepidopteran אחרים.
לסיכום, מערכת CRISPR/Cas9 הוכיחה את עצמה ככלי אמין להקלה על מחקרי גנומיקה פונקציונליים ב - H. armigera. התיאורים שלב אחר שלב מאפשרים למשתמשים להשלים תהליך אינטגרלי לעריכת גנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31725023, 31861133019 ל- GW, 31171912 ל- CY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
References
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR. Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).
- Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. CRISPR editing in biological and biomedical investigation. Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).
- Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model. DNA Repair. 46, 1-8 (2016).
- Wu, J., et al. Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).
- Jiao, R., Gao, C. The CRISPR/Cas9 genome editing revolution. Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).
- Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems. World Patent Information. 60, 101944 (2020).
- Es, I., et al. The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges. Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).
- Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes. Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).
- Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -G. CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications. Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).
- Pandey, P. K., et al. Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research. Seminars in Cell & Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
- Mojica, F. J., Montoliu, L. On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals. Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Koutroumpa, F., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).
- Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).
- Fitt, G. P. The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems. Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).
- Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (Hübner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management. Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).
- Ai, D., et al. Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera Hübner (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).
- Wan, F., et al. A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Cheng, T., et al. Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest. Nature Ecology & Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).
- Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore. Science Reports. 6, 23666 (2016).
- Gouin, A., et al. Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Wang, J., et al. Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).
- Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins. Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).
- Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm. PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).
- Jin, L., et al. Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).
- Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision. Tobacco Sciene & Technology. 53 (2), 21-26 (2019).
- Wu, K., Gong, P. A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm. Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).
- Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics. Environmental Entomology. (1), 30 (2012).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).
- Zheng, M. -Y., et al. A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia. Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).
- Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae). Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).
- Kamimura, M., Tatsuki, S. Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).
- Edwards, K. D. Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE). Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).
