Summary
Hier wird ein Protokoll der Helicoverpa armigera (Hübner) Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutantenidentifizierung vorgestellt, das durch CRISPR/Cas9-Genom-Editing erstellt wurde. Mutierte Insekten ermöglichen die weitere Erforschung der Genfunktion und Interaktion zwischen verschiedenen Genen in vivo.
Abstract
Der Baumwollkapselwurm, Helicoverpa armigera, ist einer der zerstörerischsten Schädlinge der Welt. Eine Kombination aus Molekulargenetik, Physiologie, funktioneller Genomik und Verhaltensstudien hat H. armigera zu einer Modellart in Lepidoptera Noctuidae gemacht. Um die In-vivo-Funktionen und Interaktionen zwischen verschiedenen Genen zu untersuchen, ist die Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) / Associated Protein 9 (Cas9) Genom-Editing-Technologie eine bequeme und effektive Methode zur Durchführung funktioneller genomischer Studien. In dieser Studie stellen wir eine schrittweise systematische Methode zur Verfügung, um den Gen-Knockout bei H. armigera mit dem CRISPR/Cas9-System abzuschließen. Das Design und die Synthese der Guide-RNA (gRNA) werden detailliert beschrieben. Anschließend werden die nachfolgenden Schritte, bestehend aus genspezifischem Primer-Design für die Erstellung von Guide-RNA (gRNA), Embryonenentnahme, Mikroinjektion, Insektenaufzucht und Mutantendetektion zusammengefasst. Schließlich werden Ratschläge und Hinweise zur Fehlerbehebung bereitgestellt, um die Effizienz der Genbearbeitung zu verbessern. Unsere Methode wird als Referenz für die Anwendung der CRISPR/Cas9-Genom-Editierung bei H. armigera sowie anderen Schmetterlingen dienen.
Introduction
Die Anwendung der Genom-Editing-Technologie bietet ein effizientes Werkzeug, um Ziel-Gen-Mutanten in verschiedenen Arten zu erreichen. Die Entstehung des Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Associated Protein 9 (Cas9)-Systems bietet eine neuartige Methode zur Manipulation von Genomen1. Das CRISPR/Cas9-System besteht aus einer Guide-RNA (gRNA) und der Cas9-Endonuklease2,3, während die gRNA weiter in zwei Teile unterteilt werden kann, eine zielkomplementäre CRISPR-RNA (crRNA) und eine transaktivierende crRNA (tracrRNA). Die gRNA integriert sich in die Cas9-Endonuklease und bildet ein Ribonukleoprotein (RNP). Mit der gRNA kann die Cas9-Endonuklease über Basenkomplementation auf eine bestimmte Stelle des Genoms gerichtet werden. Die RuvC- und HNH-Domänen des Cas9 spalten die Zielstelle des Genoms drei Basen vor der Pam-Sequenz (Protospacer-Adjacent Motif) und erzeugen einen Doppelstrangbruch (DSB). Die DNA-Spaltung kann dann durch zwei Mechanismen repariert werden, nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) oder homologiegesteuerte Reparatur (HDR)4. Die Reparatur des DSB führt Insertionen oder Deletionen ein, um das Zielgen zu inaktivieren, was möglicherweise zu einem vollständigen Verlust der Genfunktion führt. Daher machen die Hierisierbarkeit und Spezifität des CRISPR/Cas9-Systems es zu einer robusten Methode, um Genfunktionen in vivo zu charakterisieren und Geninteraktionen zu analysieren5.
Mit zahlreichen Vorzügen wurde das CRISPR/Cas9-System auf verschiedene Bereiche angewendet, darunter Biomedizin6,7, Gentherapie8,9 und Landwirtschaft10,11,12, und wurde für verschiedene biologische Systeme verwendet, darunter Mikroorganismen13, Pflanzen14,15, Nematoden16 und Säugetiere17 . Bei Wirbellosen wurden viele Insektenarten der CRISPR/Cas9-Genom-Editierung unterzogen, wie die Fruchtfliege Drosophila melanogaster und darüber hinaus18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera ist einer der zerstörerischsten Schädlinge weltweit23 und schädigt zahlreiche Nutzpflanzen, darunter Baumwolle, Sojabohnen und Sorghum24,25. Mit der Entwicklung der Sequenzierungstechnologie wurden das Genom von H. armigera sowie das einer Reihe von Lepidoptera-Insektenarten vollständig sequenziert26,27,28,29. Aus diesen Insekten wurde in den letzten Jahren eine große Anzahl von Resistenz- und Geruchsrezeptorgenen identifiziert und charakterisiert19,27,28,29. Einige resistenzbezogene Gene wurden in H. armigera identifiziert, wie die Gene, die für Cadherin30, einen ATP-bindenden Kassettentransporter31,32, sowie HaTSPAN133 kodieren. Das Ausschalten dieser Gene mittels CRISPR/Cas9-Technologie führt zu einer hohen Resistenz gegen Bacillus thuringiensis (BT)-Toxin in anfälligen Stämmen. Außerdem schalteten Chang et al. (2017) einen Pheromonrezeptor aus, der seine signifikante Funktion bei der Paarungszeitregulation bestätigte19. Diese Berichte deuten darauf hin, dass CRISPR/Cas9 als wirksames Instrument zur Untersuchung der Genfunktion in vivo in Insektensystemen dienen kann. Ein detailliertes Verfahren zur CRISPR/Cas9-Modifikation in Insektensystemen ist jedoch noch unvollständig, was sein Anwendungsspektrum in der funktionellen Genomik von Insekten einschränkt.
Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein funktionelles Gen in H. armigera mit dem CRISPR/Cas9-System auszuschalten. Ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll wird bereitgestellt, einschließlich des Designs und der Vorbereitung von genspezifischen Primern für die gRNA-Produktion, Embryonenentnahme, Mikroinjektion, Insektenaufzucht und Mutantenidentifizierung. Dieses Protokoll dient als wertvolle Referenz zur Manipulation beliebiger funktioneller Gene in H. armigera und kann auf andere Lepidoptera-Arten ausgedehnt werden.
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Protocol
1. Design genspezifischer Primer und Herstellung von sgRNA
- Verifizieren Sie eine konservierte genomische Region im interessierenden Gen durch PCR-Amplifikations- und Sequenzierungsanalysen. Amplifizieren Sie das Zielgen aus der Genom-DNA von H. armigera und unterscheiden Sie die Exons und Introns.
HINWEIS: Die Sequenzspezifität der Guide-Site ist notwendig, um eine Off-Target-Genbearbeitung zu vermeiden. Suchen Sie nach möglichen Leitstellen in den Exons, die nahe an der 5' UTR des Gens liegen. Dann ist es wichtig sicherzustellen, dass das Gen völlig funktionsuntüchtig ist. Eine Zusammenfassung des Fließweges zur Herstellung von sgRNA ist in Abbildung 1 dargestellt. - Wählen Sie die sgRNA-Ziele aus. Verwenden Sie die CRISPR-Online-Website CRISPOR (Version 4.97) (http://crispor.tefor.net/crispor.py), um nach möglichen Leitstellen in den Exons in der Nähe der 5' UTR des Gens zu suchen. Geben Sie die Exonsequenz in das Textfeld ein und wählen Sie das Zielgenom für Helicoverpa armigera (Harm_1.0) aus. Wählen Sie die Option Protospacer Adjacent Motif (PAM) von "20 bp-NGG" und belassen Sie die anderen Einstellungen auf den Standardparametern gemäß den Benutzerhandbüchern der Websites.
- Vergleichen Sie die vorhergesagten Führungssequenzen aus der Software und wählen Sie die Führungssequenz mit der höchsten vorhergesagten Effizienz und den geringsten Abweichungen, um die Bearbeitungseffizienz zu verbessern und die Bearbeitung außerhalb des Ziels zu reduzieren. Eine 20 bp Führungssequenz mit einem oder zwei G auf der 5' UTR wird empfohlen, da sie die Schneideffizienz erhöhen könnte.
HINWEIS: Ein Paar gRNAs über Exon-Regionen hinweg wird ebenfalls empfohlen, um eine große Segmentdeletion zu erhalten, was den Mutantennachweis in späteren Schritten vereinfacht. Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen den beiden ausgewählten Führungssequenzen mindestens 100 bp beträgt. In diesem Protokoll wählen wir das häufig verwendete SpCas9-Protein, das das NGG-Motiv erkennt. Gemäß den Anweisungen des Herstellers ist die Führungssequenz ohne G auch bei der Auswahl des T7-Promotors akzeptabel, da der Promotor dem 5' UTR der Sequenz ein G hinzufügt. - Entwerfen Sie Vorwärts- und Rückwärts-Oligonukleotide. Stellen Sie die Sequenzreihenfolge auf 5'-20 bp Führungssequenz-NGG-3' und ergänzen Sie die Führungssequenz um. Fügen Sie die T7-Promotorsequenz gemäß der Bedienungsanleitung des gRNA-Synthesekits zur Vorwärts- und Rückwärtsstrangsequenz hinzu.
HINWEIS: Die PAM-Sequenz NGG sollte aus der Oligonukleotidsequenz ausgeschlossen werden. - Generieren Sie die sgRNA mit dem gRNA-Synthese-Kit. Dieser Prozess umfasst drei Schritte: DNA-Template-Assemblierung, In-vitro-Transkription und Aufreinigung von sgRNA (Abbildung 2). Führen Sie jeden Schritt in Übereinstimmung mit den Benutzeranweisungen aus.
2. Aufbereitung und Entnahme des Embryos
- Trennen Sie männliche und weibliche Puppen, wie von Hongtao et al.34 beschrieben, und trennen Sie sie in zwei verschiedene Netzkäfige. Nach der Eklosion füttern Sie sie ~ 30 ml 10% (w / v) Weißzuckerlösung in saugfähiger Baumwolle in einer Petrischale.
ANMERKUNG: 3 g Weißzucker wurden in 30 ml sterilem Wasser gelöst, um die 10% ige (w/v) Weißzuckerlösung herzustellen. - Wählen Sie 50 gesunde Individuen aus 3 Tage alten Männchen bzw. 2 Tage alten Weibchen aus und mischen Sie sie in einem sauberen Netzkäfig. Legen Sie ein Stück Baumwolle mit 10% (w/v) Zuckerlösung in den Käfig und halten Sie die Baumwolle feucht. Bedecken Sie die Netzkäfige mit Gaze und fixieren Sie die Gaze mit einem Gummiband. Sprühen Sie Wasser auf die Gaze, um feucht zu bleiben.
- Lassen Sie ausgewählte männliche und weibliche Motten in Schritt 2 vollständig paaren und beobachten Sie die Eiablagemenge.
HINWEIS: Der Höhepunkt der Eiablage von H. armigera erscheint nach 21:00 Uhr.m. Daher sollte der Zeitpunkt der Paarung berücksichtigt werden, um eine ausreichende Anzahl von Eiern in den folgenden Schritten zu gewährleisten. Auf dem Höhepunkt der Eiablage ersetzen Sie die Gaze durch ein schwarzes Tuch und ermöglichen Sie die freie Eiablage für 30 Minuten. Ersetzen Sie das schwarze Tuch alle 30 Minuten, um frische Eier zu sammeln (Abbildung 3A). - Schneiden Sie das schwarze Tuch in unregelmäßig geformte Flecken mit einer Größe von ca. 3 mm. Sorgen Sie für mehr Eier auf jedem Beet.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, faltige Eier zu wählen, da sie normalerweise unbefruchtet sind. - Klebeband mit doppelseitigem Klebeband auf einen Objektträger (25 mm x 75 mm) (Abbildung 3B). Kleben Sie die Flecken mit der Pinzette mit den Eiern in einer Reihe auf die Oberfläche des doppelseitigen Klebebandes. Drücken Sie auf den Rand jedes Patches, um sicherzustellen, dass sie fest am Band haften. Sammeln Sie 50-100 Eier pro Objektträger (Abbildung 3C).
HINWEIS: Die Patches müssen die gesamte Oberfläche des doppelseitigen Klebebandes bedecken, da sonst die schlüpfende Larve Schwierigkeiten hat, herauszukriechen. - Halten Sie den Objektträger vor der Mikroinjektion auf Eis, um die Entwicklung der Embryonen zu verzögern.
3. Mikroinjektion von Embryonen
- Bereiten Sie die Nadel vor, indem Sie mit einem Mikropipettenzieher ein Kapillarglas ziehen (Abbildung 4A). Setzen Sie Heat auf 540, Pull auf 80, Vel auf 75, Time auf 170 und Pressure auf 450. Mahlen Sie die Nadelspitze mit einem Mikroschleifer. Die ideale Nadel zeigt eine scharfkantige Spitze (Abbildung 4B).
- Herstellung von Injektionslösungen. 2 μL des kommerzialisierten Cas9-Proteins (1 mg/ml) und sgRNA (300-500 ng/μL Endkonzentration) zu RNase-freiem Wasser in einem PCR-Röhrchen geben, um eine 10 μL Volumenmischung zu erhalten. Das Volumen der sgRNA hängt von ihrer Konzentration ab. Gut durch Pipettieren mischen und auf Eis legen.
HINWEIS: Alle pipettenspitzen und PCR-Röhrchen, die in diesem Schritt verwendet werden, sind RNase-frei. - Stellen Sie die Parameter des elektronischen Mikroinjektors ein. Stellen Sie den Einspritzdruck (pi) auf 1.500 hPa, die Einspritzzeit (ti) auf 0,1 s und den Kompensationsdruck (pc) auf 30 hPa.
- Laden Sie 2 μL der Mischung mit einer Mikrolader-Pipettenspitze in eine Nadel. Die Restluft in der Nadelspitze sollte so weit wie möglich abgesaugt werden.
- Schließen Sie die Injektionsnadel an einen Mikromanipulator an und sorgen Sie für eine enge Verbindung zwischen den beiden Teilen.
- Legen Sie einen Objektträger in eine Petrischale (100 mm) und legen Sie ihn auf die Bühne des Mikroskops (Abbildung 5A).
- Stellen Sie die Position der Nadelspitze unter einem Lichtmikroskop ein, bis sowohl die Nadelspitze als auch die Embryonen unter dem Mikroskop sichtbar sind (Abbildung 5B).
- Stellen Sie die Lautstärke des Tröpfchens ein. Drücken Sie das Pedal und beobachten Sie, wie die Flüssigkeit an der Nadelspitze abfällt. Stellen Sie den Injektionsdruck des Mikroinjektors ein, bis das Volumen eines Flüssigkeitstropfens etwa ein Zehntel des Volumens der Embryonen beträgt.
HINWEIS: Die Qualität der Injektionsnadel ist entscheidend für die Überlebensrate von Embryonen. - Führen Sie die Nadelspitze vorsichtig in die obere Hemisphäre eines Embryos in einem Winkel von 45 Grad ein (Abbildung 5C). Drücken Sie das Pedal, um die Mischung in den Embryo abzugeben. Die Injektion führt zu einer leichten Ausdehnung des Embryos. Ziehen Sie die Nadel sofort vom Embryo zurück und bewegen Sie die Petrischale mit einer Hand, bis sich der nächste Embryo in der Nähe der Nadel befindet, und injizieren Sie den nächsten Embryo mit dem gleichen Verfahren.
HINWEIS: Der zytoplasmatische Abfluss am Loch ist akzeptabel. Wenn die zytoplasmatische Leckage zu groß ist, stellen Sie den Winkel der Nadel auf einen strengeren Winkel ein, bis der Flüssigkeitsabfluss kontrolliert wird. - Injizieren Sie mindestens 300 Embryonen, um eine ausreichende Schlüpfmenge zu gewährleisten. Den Deckel der Petrischale(n) nach der Injektion abdecken.
HINWEIS: Die Zeit von der Eiablage bis zur Injektion der 50-100 Embryonen ist auf 2 h begrenzt. Die meisten Embryonen befinden sich innerhalb dieses Zeitrahmens noch im Einzellstadium. Im Allgemeinen ist es nützlich, den Eiablagevorgang während der Embryoneninjektion zu wiederholen, um die Effizienz zu fördern.
4. Insektenaufzucht nach der Injektion
- Vermehrung von G0-Embryonen.
- Inkubieren Sie die Embryonen bei 60% relativer Luftfeuchtigkeit und 28°C in einer künstlichen Klimabox mit 14 h Licht/10 h Dunkelheit.
- Überprüfen Sie die Entwicklung der Embryonen täglich nach der Injektion. Wenn sich die Oberflächenfarbe der Embryonen verdunkelt hat, legen Sie künstliche Diät in die Petrischale um den Objektträger herum und überprüfen Sie die Entwicklung der Embryonen alle 12 Stunden.
HINWEIS: Die künstliche Diät wird wie von Wu et al.35 und Jha et al.36 beschrieben zubereitet. - Bereiten Sie 24-Well-Kulturplatten vor und füllen Sie jede Vertiefung auf ein Drittel ihrer volumetrischen Kapazität mit künstlicher Ernährung.
- Wählen Sie schlüpfende Larven (Abbildung 5D) mit einem kleinen Pinsel aus und übertragen Sie sie auf die 24-Well-Kulturplatte. Fügen Sie eine Larve pro Vertiefung ein, um sicherzustellen, dass jede Larve genug Nahrung zum Überleben hat.
HINWEIS: Die Larven von H. armigera wurden in jedem Brunnen einzeln aufgezogen, da sie sich normalerweise gegenseitig kannibalisierten.
- G0-Larvenaufzucht
- Ziehen Sie die Larven unter den gleichen Bedingungen wie die Embryonen auf.
- Überprüfen Sie die geschlüpften Larven jeden Tag. Wenn die Larven bis zum dritten Stadium wachsen, übertragen Sie jede Larve in ein neues Glas Daktyletthrae und füllen Sie ein Fünftel des Volumens mit künstlicher Nahrung.
- Etwa 12 d nach der Inkubation sollten die reifen Larven anfangen, sich zu verpuppen.
- Die G0-Reifenpuppen werden nach Geschlecht unterschieden und vor der Eklosion in separate Käfige gelegt. Die gleichaltrigen Puppen des Wildtyps werden ebenfalls zubereitet.
- G0 Erwachsene Aufzucht
- Überprüfen Sie täglich die Eklosion von Wildtyp und mutierten Puppen.
- Übertragen Sie die neu ausgeschiedenen männlichen G0-Erwachsenen und wildtypischen weiblichen Erwachsenen in einen frischen Netzkäfig und stellen Sie das Verhältnis zwischen G0 und Wildtyp auf etwa 1: 1. Versorgen Sie sie mit 10% (w / v) Zuckerlösung, die in Wattebällchen fallen gelassen wird.
- Hinterinsekten mit der oben genannten Routinemethode bis zur Verpuppung der ersten Generation (G1).
- Mit einem Dactylethrae das neu ausgeschiedene einzelne Paar G1-Erwachsener in ein Plastikglas (13 cm x 12 cm x 12 cm) geben, das mit 10% (w/v) Zuckerlösung geliefert wird. Jedes Glas mit Gaze bedecken. Nehmen Sie insgesamt etwa 50 Paar G1-Erwachsene.
HINWEIS: Die Eklosion der weiblichen Motten ist älter als die der männlichen Motten. Im Allgemeinen sind ein 3 Tage altes Männchen und ein 2 Tage altes Weibchen geschlechtsreif und paarungsbereit. Die neu ausgeschiedenen Erwachsenen paaren sich in ihrer ersten Lichtperiode nicht ohne Fütterung. - Sammeln Sie die G1-Erwachsenen in einem Plastikglas, nachdem sie Eier gelegt haben. Legen Sie jede erwachsene Motte in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen.
5. Knock-out-Mutantenerkennung
- Entwerfen Sie ein Paar Primer, die die vorhergesagte abgeschnittene Site umfassen. Die Primer sollten mindestens 50 bp Abstand auf beiden Seiten (upstream und downstream) vom Zielstandort eingestellt werden.
HINWEIS: Die Primer zur Identifizierung der Zielsequenz decken oft große Spannen ab, um effizient zu verstärken. - Führen Sie die PCR-Reaktion unter Verwendung der Genotypisierungsprimer mit genomischer DNA durch, die in Abschnitt 1 extrahiert wurde. PCR-Zyklus bei 95 °C für 20 s durchführen; 35 Zyklen von 95 °C für 20 s, 55 °C für 20 s, 72 °C für 1 min; 72 °C für 5 min und 4 °C in der Warteschleife. Überprüfen Sie das Reaktionsprodukt über 1% (w/v) Agarosegel. Das ausgewählte Paar von Detektionsprimern wurde durch die Qualität des PCR-Produkts bestätigt. Wenn die Banden offensichtlich und spezifisch sind, könnten die Primer für den weiteren Mutantennachweis basierend auf der Amplikongröße verwendet werden.
- Bildschirm für potenziell bearbeitete Personen. Entfernen Sie ein Hinterbein vorsichtig mit einer Pinzette und legen Sie jedes Bein in ein Lysing-Matrix-Rohr. Beschriften Sie das Lysing-Matrix-Röhrchen mit der Nummer auf dem Glas dactylethrae.
- Homogenisieren Sie das Hinterbein mit einem Gewebehomogenisator. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf 6,0 m/s und die Zeit auf 60 s ein. Extrahieren Sie die genomische DNA der homogenisierten Probe mit einem kommerziellen gDNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Amplifizieren Sie das Gensegment mit Genotypisierungsprimern unter den gleichen PCR-Reaktionsbedingungen wie in Schritt 2 beschrieben. Bestätigen Sie den Genotyp durch einen Gensequenzierungsdienst. Sobald G1-mutierte Genotypen (zielt auf die gleiche Stelle) im selben Glas gefunden wurden, behalten Sie die G1-Nachkommen und benennen Sie sie in Generation zwei (G2) um.
- Legen Sie G1-Individuen desselben Genotyps in einen Netzkäfig. Kreuzen Sie die G1-Nachkommen selbst und screenen Sie weiterhin mit den gleichen Methoden.
- Amplifizieren Sie das Gensegment und bestätigen Sie den Genotyp mit dem gleichen Verfahren wie in Schritt 2 beschrieben. Erhalten Sie G2 homozygote Linien und halten Sie die Knock-out-Mutantenlinie aufrecht.
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Representative Results
Dieses Protokoll enthält detaillierte Schritte zur Gewinnung von Gen-Knock-out-Linien von H. armigera mithilfe der CRISPR/Cas9-Technologie. Die repräsentativen Ergebnisse dieses Protokolls werden für die gDNA-Selektion, die Embryonenentnahme und -injektion, die Insektenzucht und den Mutantennachweis zusammengefasst.
In dieser Studie befand sich die Zielstelle unseres interessierenden Gens in seinem zweiten Exon (Abbildung 2A). Diese Stelle war hoch konserviert, und das Zielbandfragment der synthetisierten sgRNA wurde mittels Agarosegelelektrophorese bestätigt (Abbildung 2B,C,D).
Die männlichen und weiblichen Motten wurden zunächst in getrennten Netzkäfigen aufgezogen, um eine vorzeitige Paarung zu verhindern und eine möglichst ausreichende Menge an Embryonen zu gewährleisten. Im Allgemeinen wurden insgesamt 300 befruchtete Eier gesammelt und sofort mit der sgRNA/Cas9-Proteinmischung (300-500 ng/μL sgRNA, 200 ng/μL Cas9-Protein) im Einzelzellstadium injiziert. Das Injektionsvolumen betrug etwa ein Zehntel des der Embryonen. Nach der Mikroinjektion wurden die Embryonen wie in Abschnitt 4 beschrieben aufgezogen, und 40%-60% der injizierten Embryonen überlebten.
Der mutierte Nachweis eines einzelnen sgRNA-Targets erfolgte durch Sequenzierung der PCR-Produkte von G1-Eltern (Abbildung 6B). Wir testeten auch die Wirksamkeit der Verwendung von nicht überlappenden sgRNA-Paaren über verschiedene Exons hinweg. Die große Deletion der Mutanten (Abbildung 6C,D) lässt sich leicht von Wildtypbändern unterscheiden (Abbildung 6A).
Die in diesem Protokoll berechnete Mutationsrate betrug 87,50%, wenn 16 Personen zufällig getestet wurden, was darauf hindeutet, dass dieses Protokoll hocheffizient war. Gen-Knockout-Ergebnisse wurden in mehreren Genotypen gezeigt, aber die Mehrheit der Mutanten, die aus unserem Screening identifiziert wurden, waren -2 bp Typ. Mutationen führten zum vorzeitigen Abbruch der Proteintranslation im Genom, was in der Folge zum Verlust der Genfunktion führte.
Abbildung 1: Das Flussdiagramm für die Herstellung von sgRNA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Auswahl und Synthese von Ziel-sgRNAs aus H. armigera. (A) Die gelbe Domäne stellt das Exon dar, während die schwarze Linie das Intron darstellt. Die roten Sequenzen zeigen die Zielsequenz an, und die blauen Sequenzen zeigen das Protospacer-benachbarte Motiv (PAM) an. (B) PCR-Assemblierung der sgRNA-DNA-Schablone. (C) Das In-vitro-Transkriptionsprodukt. (D) Aufreinigung von sgRNA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Embryonenentnahme. (A) Ein netzförmiger Käfig, der mit schwarzem Tuch bedeckt ist. Die männlichen und weiblichen Motten von H. armigera paarten sich. (B) Der Objektträger ohne Embryonen. (C) Der Objektträger mit 50-100 Embryonen auf schwarzen Stoffstücken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Nadelvorbereitung. (A) Mikropipettenabzieher. (B) Spitze einer Mikroinjektionsnadel nach dem Ziehen durch einen Mikropipettenzieher. Das gepunktete Kästchen zeigt die vergrößerte Nadelspitze an. Maßstabsleiste stellt 1 mm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Embryonen-Mikroinjektionen. (A) Der gesamte Satz eines Mikroinjektionssystems, bestehend aus einem Mikroskop (Mitte) und einem elektronischen Mikroinjektor (links), die mit einem Mikromanipulator (rechts) verbunden sind. (B) Embryonen und Mikroinjektionsnadel. (C) Die Injektionsstelle des Embryos ist mit dem roten Pfeil gekennzeichnet. Der Maßstabsbalken entspricht 200 μm. (D) Eine geschlüpfte Larve unter dem Mikroskop. Maßstabsleiste stellt 1 mm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Nachweis von Mutanten durch PCR und Gelelektrophorese. Die schwarzen Pfeile und roten Linien zeigen die Zielstellen der sgRNA an. (A) Das Band in Spur 1 stellt das vom Wildtyp abgeleitete Amplifikationsfragment dar. (B) Die Banden in Bahn 2 und 3 stellen das Amplifikationsfragment dar, das von der Mutante unter Verwendung eines einzigen sgRNA-Targets abgeleitet wurde. (C) Der Nachweis eines Heterozygoten unter Verwendung eines Paares nicht überlappender sgRNA. Die Banden in den Bahnen 4 und 5 stellen das Amplifikationsfragment dar, das aus der Mutation zweier sgRNA-Targets abgeleitet wurde. Die unteren Bänder weisen auf eine große Fragmentlöschung hin. (D) Die Ergebnisse stammen von einem Homozygoten. Die Bänder in Bahn 6 und 7 zeigen die große Fragmentlöschung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Anwendung des CRISPR/Cas9-Systems hat eine leistungsstarke technische Unterstützung für die Analyse der Genfunktion und -interaktion zwischen verschiedenen Genen bereitgestellt. Das detaillierte Protokoll, das wir hier vorstellen, zeigt die Erzeugung einer homozygoten Mutante in H. armigera mittels CRISPR/Cas9 Genome Editing. Dieses zuverlässige Verfahren bietet einen einfachen Weg für die gerichtete Genmutagenese bei H. armigera.
Die Wahl der CRISPR-Zielorte könnte die Mutageneseeffizienz beeinflussen37. In diesem Protokoll haben wir mehrere Ergebnisse der Online-Website CRISPOR verglichen und analysiert, um eine geeignete Zielseite zu erhalten. In silico bieten gRNA-Vorhersagen einige Vorteile. Erstens analysieren sie das gesamte Genom von H. armigera bei der Entwicklung von sgRNAs, um die Off-Target-Effekte zu minimieren. Die oben genannten Online-Ressourcen sowie CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) funktionieren mit einer Reihe von Lepidoptera-Genomen, die für die Genbearbeitung bei anderen Lepidoptera-Motten von Vorteil sein könnten. Zweitens vergleicht das Ranking der Kandidaten sgRNAs direkt die Möglichkeiten, kann aber basierend auf den verschiedenen Algorithmen einige Variationen enthalten. Die Kandidatenreihenfolge mit hohen Bewertungen in beiden Listen ist tendenziell zuverlässiger. Eine wesentliche Einschränkung dieses Protokolls besteht jedoch darin, dass eine große Anzahl von Insektengenomen in den Datenbanken der Websites fehlt, so dass das Potenzial für Off-Target-Effekte besteht. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass die PAM-Sequenz für das sgRNA-Design notwendig ist, was dazu führen kann, dass keine geeignete Zielstelle gefunden werden kann.
Die Gewebe, die für das Mutantenscreening verwendet werden, sind ebenfalls ein entscheidender Faktor. Die Überlebensrate, der Lebenszyklus und die physiologischen Funktionen von Insekten sollten nicht beeinträchtigt werden. Bei der Erforschung der optimalen gDNA-Extraktionsmethode wurde die Mikro-Hämolymph-Extraktion aus Larven zum Mutantennachweis versucht, um Zeit zu sparen und eine Paarung zu vermeiden (unveröffentlichte Daten). Diese Methode brachte jedoch mehr Herausforderungen in Bezug auf die Effizienz der PCR-Amplifikation und die Überlebensraten von Erwachsenen mit sich (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus berichteten Zheng et al.38 über eine zerstörungsfreie Methode zur gDNA-Extraktion unter Verwendung des Exuviats oder der Puparia. Basierend auf diesen Ergebnissen modifizierten und erforschten wir einen Ansatz mit Hinterbeinen für die gDNA-Extraktion, der es erwachsenen Motten ermöglicht, auf natürliche Weise zu überleben und sich zu paaren, was die Nachweisgenauigkeit eines bestimmten Genotyps signifikant verbessert. Daher haben wir eine neue Methode entwickelt, um die Erfolgsrate der gDNA-Extraktion zu erhöhen, indem eines der Hinterbeine von jedem erwachsenen Kandidaten entfernt wird. Wir bestätigten weiter, dass diese Operation die Überlebensrate und die Paarungshäufigkeit erwachsener Motten nicht beeinflusste. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die große Fragmentdeletion leicht durch die Gelelektrophorese beobachtet werden kann, wenn sie mit einem Paar gRNAs über Exon-Regionen injiziert wird (Abbildung 6), was den Prozess der Mutantenidentifizierung beim Screening vereinfacht.
Die Eier von H. armigera werden auf einem schwarzen Tuch gesammelt, wodurch die Eier unter dem Mikroskop bei der Mikroinjektion leicht zu unterscheiden sind (Abbildung 5B). Aufgrund des gemeinsamen Fortpflanzungsverhaltens von Lepidoptera-Motten wie Paarung, Eiablage, Schlüpfen und Eklosion39,40,41 könnte diese Eizellsammeltechnik auch auf andere Lepidoptera-Motten angewendet werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich das CRISPR/Cas9-System als zuverlässiges Werkzeug zur Erleichterung funktioneller Genomik-Studien bei H. armigera erwiesen hat. Die Schritt-für-Schritt-Beschreibungen ermöglichen es den Benutzern, einen integralen Gen-Editing-Prozess durchzuführen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31725023, 31861133019 gw und 31171912 cy) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
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