Summary
여기에 제시 헬 리코파 armigera 의 프로토콜입니다 (Hübner) 태아 미세 주입 및 CRISPR / Cas9 게놈 편집에 의해 생성 된 녹아웃 돌연변이 식별. 돌연변이 곤충은 생체 내의 다른 유전자 들 사이에서 유전자 기능 및 상호 작용의 추가 연구를 가능하게 합니다.
Abstract
면 볼웜헬 리코파 아미게라는 세계에서 가장 파괴적인 해충 중 하나입니다. 분자 유전학의 조합, 생리학, 기능적 유전체학, 행동 연구는 H. armigera 레피드 옵테라 녹투이대에서 모델 종했다. 다른 유전자 간의 생체 내 기능 및 상호 작용을 연구하기 위해 정기적으로 간격이 짧은 palindromic 반복 (CRISPR)/ 관련 단백질 9 (Cas9) 게놈 편집 기술은 기능적 게놈 연구를 수행하는 데 사용되는 편리하고 효과적인 방법입니다. 이 연구에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 H. armigera 에서 유전자 녹아웃을 완료하는 단계별 체계적인 방법을 제공합니다. 가이드 RNA(gRNA)의 설계 및 합성은 자세히 설명되어 있다. 이어서, 가이드 RNA(gRNA) 생성, 배아 수집, 미세주입, 곤충 사육 및 돌연변이 검출을 위한 유전자 특이적 프라이머 설계로 구성된 후속 단계를 요약한다. 마지막으로, 유전자 편집의 효율성을 개선하기 위해 문제 해결 조언과 메모가 제공됩니다. 우리의 방법은 H. 아미게라 뿐만 아니라 다른 Lepidopteran 나방에 CRISPR / Cas9 게놈 편집의 적용을위한 참조 역할을 할 것입니다.
Introduction
게놈 편집 기술의 응용 프로그램은 다양한 종에서 표적 유전자 돌연변이를 달성하기 위한 효율적인 도구를 제공합니다. 클러스터된 단락형 짧은 palindromic 반복(CRISPR)/관련 단백질 9(Cas9) 시스템의 출현은 게놈1을 조작하는 새로운 방법을 제공한다. CRISPR/Cas9 시스템은 가이드 RNA(gRNA)와 Cas9 endonuclease2,3로 구성되며, gRNA는 두 부분으로 더 나눌 수 있으며, 표적 보완 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스 활성화 crRNA(tracrRNA)로 나뉩니다. gRNA는 Cas9 엔도누클레스와 통합하고 리보뉴클레오단백질(RNP)을 형성한다. gRNA를 사용하면 Cas9 엔도누벨리스는 기본 보완을 통해 게놈의 특정 부위로 향할 수 있습니다. Cas9의 RuvC 및 HNH 도메인은 프로토스페서 인접 모티프(PAM) 서열 전에 게놈 3기의 표적 부위를 크리브하고 이중 가닥 브레이크(DSB)를 생성한다. DNA 분열은 다음 두 가지 메커니즘을 통해 복구 할 수 있습니다, 비 동종 종조 (NHEJ) 또는 homology 지향 수리 (HDR)4. DSB의 복구는 표적 유전자를 비활성화하는 방법으로 삽입 또는 삭제를 소개합니다, 잠재적으로 유전자 기능의 완전한 손실을 일으키는 원인이 됩니다. 따라서 CRISPR/Cas9 시스템의 퇴적및 특이성은 생체 내에서 유전자 기능을 특성화하고 유전자 상호 작용을 분석하는 견고한 방법입니다5.
CRISPR/Cas9 시스템은 생물의학6,7, 유전자 치료8,9, 농업 10,11,12 등 다양한 분야에 적용되었으며 미생물13, 식물14,15, 선충제16 및 포유류17을 포함한 다양한 생물학적 시스템에 사용되어 왔습니다. . 무척추 동물에서는 많은 곤충 종은 과일 플라이 드로소필라 멜라노가스터와 그 너머 18,19,20,21,22와 같은 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 실시했습니다.
헬리코파 아미게라는 전 세계적으로 가장 파괴적인 해충 중 하나이며, 면, 대두, 사탕수수를 포함한 수많은 작물을 손상시다. 시퀀싱 기술의 발달로, H. armigera의 게놈은 물론 Lepidoptera 곤충 종의 범위의 그, 완전히 시퀀싱되었습니다 26,27,28,29. 많은 수의 저항 및 후각 수용체 유전자가 최근 몇 년 동안 이들 곤충으로부터 확인되고 특징지어졌다19,27,28,29. 일부 저항 관련 유전자는 H. armigera에서 확인되었습니다, cadherin30에 대한 인코딩 유전자와 같은, ATP 결합 카세트 수송31,32, 뿐만 아니라 HaTSPAN133. CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 이 유전자의 녹아웃은 취약한 긴장에서 바실러스 thuringiensis (BT) 독소에 저항의 높은 수준을 초래합니다. 또한, Chang et al. (2017)는 페로몬 수용체를 쓰러뜨려 짝짓기 시간 규정19에서 중요한 기능을 검증했습니다. 이 보고는 CRISPR/Cas9가 곤충 시스템에서 생체 내 유전자 기능을 공부하는 효과적인 공구로 작동할 수 있다는 것을 건의합니다. 그러나 곤충 시스템의 CRISPR/Cas9 수정에 대한 자세한 절차는 불완전하게 남아 있어 곤충 기능적 유전체학의 적용 범위를 제한합니다.
여기서, 우리는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 H. armigera 에 있는 기능성 유전자를 노크하기 위한 프로토콜을 제시합니다. gRNA 생산을 위한 유전자 특이적 프라이머의 설계 및 준비, 배아 수집, 미세 주입, 곤충 사육 및 돌연변이 식별을 포함한 상세한 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 이 프로토콜은 H. 아미게라 에 있는 어떤 기능성 유전자든지 조작하기 위하여 귀중한 참조 역할을 하고 그밖 Lepidoptera 종으로 확장될 수 있습니다.
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Protocol
1. 유전자 특정 프라이머의 설계 및 sgRNA 의 준비
- PCR 증폭 및 시퀀싱 분석을 통해 관심 유전자에서 보존된 게놈 영역을 확인합니다. 표적 유전자를 H. 아미게라 의 게놈 DNA로부터 증폭시키고 엑손과 인트론을 구별한다.
참고: 오프 타겟 유전자 편집을 피하기 위해 가이드 사이트의 서열 특이성이 필요합니다. 엑슨에 있는 가능한 가이드 사이트를 검색하는 것은 유전자의 5' UTR에 가깝습니다. 그런 다음 유전자가 완전히 작동하지 않는지 확인하는 것이 중요합니다. sgRNA의 준비를 위한 유동 경로에 대한 요약은 도 1에 도시된다. - sgRNA 표적을 선택합니다. CRISPR 온라인 웹 사이트 CRISPOR (버전 4.97)를 사용하여 (버전 4.97) (http://crispor.tefor.net/crispor.py)를 사용하여 유전자의 5'UTR에 가까운 exons에서 가능한 가이드 사이트를 검색하십시오. 엑슨 서열을 텍스트 상자에 입력하고 목표 게놈을 헬리코파 아미게라 (Harm_1.0)로 선택한다. "20 bp-NGG"의 PROtospacer 인접 모티브 (PAM) 옵션을 선택하고 웹 사이트의 사용자 매뉴얼에 따라 기본 매개 변수에 다른 설정을 둡니다.
- 소프트웨어의 예측 가이드 시퀀스를 비교하고 가장 높은 예측 효율과 가장 적은 불일치로 가이드 시퀀스를 선택하여 편집 효율성을 개선하고 오프 타겟 편집을 줄입니다. 5'UTR에 하나 또는 두 개의 G를 포함하는 20 bp 가이드 시퀀스가 절단 효율을 높일 수 있으므로 권장됩니다.
참고: 엑슨 영역의 gRNA 쌍은 또한 큰 세그먼트 삭제를 얻는 것이 좋습니다, 이는 이후 단계에서 돌연변이 검출을 단순화. 선택한 두 가이드 시퀀스 사이의 간격 거리가 최소 100bp인지 확인합니다. 이 프로토콜에서는 NGG 모티프를 인식하는 일반적으로 사용되는 SpCas9 단백질을 선택합니다. 제조업체의 지시에 따르면, 프로모터가 시퀀스의 5'UTR에 G를 추가하기 때문에 T7 프로모터를 선택할 때 G가 부족한 가이드 시퀀스도 허용됩니다. - 앞으로 설계하고 올리고뉴클레오티드를 역방향으로 지정합니다. 시퀀스 순서를 5'-20 bp 가이드 시퀀스-NGG-3'로 설정하고 역방향 가이드 시퀀스를 보완합니다. gRNA 합성 키트의 사용자 가이드에 따라 T7 프로모터 서열을 전진 및 역가드 가이드 서열에 각각 추가합니다.
참고: PAM 서열 NGG는 올리고뉴클레오티드 서열에서 제외되어야 한다. - gRNA 합성 키트를 사용하여 sgRNA를 생성한다. 이 과정에는 DNA 템플릿 조립, 시험관 내 전사 및 sgRNA의 정화(도 2)의 세 가지 단계가 포함됩니다. 사용자 지침에 따라 각 단계를 수행합니다.
2. 배아 준비 및 수집
- Hongtao et al.34 에 의해 기술된 바와 같이 남성과 암컷 새끼를 분리하고 두 개의 다른 그물 케이지로 분리합니다. 백과착 후, 페트리 접시에 흡수성 면에 10 % (w / v) 백색 설탕 용액의 ~ 30 mL을 공급합니다.
참고: 백색 설탕 3 g을 멸균 수분 30mL에 용해하여 10%(w/v) 백색 설탕 용액을 준비했습니다. - 각각 3일 된 남성과 2 일 된 여성에서 50 명의 건강한 개인을 선택하고 깨끗한 그물 케이지에 섞습니다. 10% (w/v) 설탕 용액이 들어 있는 코튼 을 케이지에 넣고 면이 촉촉하게 유지합니다. 그물 케이지를 거즈로 덮고 거즈를 고무 밴드로 고정합니다. 촉촉한 상태를 유지하기 위해 거즈에 물을 뿌십시오.
- 2단계에서 선택된 수컷과 암컷 나방을 완전히 짝짓기하고 계란 누워양을 관찰하도록 허용합니다.
참고: H. 아미게라 의 난소의 피크는 9:00 p.m 후에 나타납니다. 따라서 짝짓기 의 시간은 후속 단계에서 충분한 수의 계란을 보장하기 위해 고려되어야합니다. oviposition의 절정에, 검은 천으로 거즈를 교체하고 30 분 동안 무료 oviposition을 가능하게. 신선한 계란을 수집하기 위해 30 분마다 검은 천을 교체하십시오 (그림 3A). - 검은 천을 불규칙한 모양의 패치로 자르고 약 3mm의 크기로. 각 패치마다 더 많은 계란을 확인하십시오.
참고: 주름이 있는 계란은 일반적으로 수정되지 않기 때문에 선택하지 마십시오. - 양면 테이프를 현미경 슬라이드(25mm x 75mm)에 붙여 넣습니다(그림 3B). 집게를 사용하여 양면 테이프 표면에 계란을 연달아 붙여 넣습니다. 각 패치의 여백을 눌러 테이프에 단단히 고정되도록 합니다. 현미경 슬라이드 당 50-100 계란을 수집 (그림 3C).
참고: 패치는 양면 테이프의 전체 표면을 커버해야 하며, 그렇지 않으면 부화 애벌레가 기어나가는 데 어려움을 가지게 됩니다. - 미세 주입 하기 전에, 배아의 개발을 지연 하는 얼음에 현미경 슬라이드를 유지.
3. 배아의 미세 주입
- 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 모세관 유리를 당겨 바늘을 준비합니다 (도 4A). 열을 540으로 설정하고, 80으로 당기고, 벨을 75로 당기고, 시간은 170으로, 압력은 450으로 설정합니다. 마이크로 그라인더를 사용하여 바늘 팁을 접지합니다. 이상적인 바늘은 날카로운 팁 (그림 4B)을 보여줍니다.
- 사출 솔루션의 준비. 상용화된 Cas9 단백질(1 mg/mL)과 sgRNA(300-500 ng/μL 최종 농도)를 PCR 튜브에 RNase 없는 물에 2μL을 추가하여 10μL 부피 혼합물을 얻습니다. sgRNA의 부피는 그것의 농도에 달려 있습니다. 파이펫팅으로 잘 섞어서 얼음 위에 놓습니다.
참고: 이 단계에서 사용되는 모든 파이펫 팁과 PCR 튜브는 RNase가 없습니다. - 전자 마이크로인젝터의 매개 변수를 설정합니다. 사출 압력(pi)을 1,500hPa로 설정하고, 주사 시간(ti)을 0.1s로, 보상 압력(pc)을 30hPa로 설정한다.
- 마이크로 로더 파이펫 팁을 사용하여 혼합물의 2 μL을 바늘에 적재합니다. 바늘 끝에 있는 잔류 공기는 가능한 한 많이 소진되어야 합니다.
- 주입 바늘을 마이크로 조작기에 연결하고 두 부분 간의 긴밀한 연결을 보장합니다.
- 페트리 접시(100mm)에 슬라이드를 넣고 현미경의 무대에 놓습니다(그림 5A).
- 바늘 끝과 배아가 현미경의 밑에 보일 때까지 가벼운 현미경의 밑에 바늘 끝의 위치를 조정합니다 (그림 5B).
- 물방울의 볼륨을 조정합니다. 페달을 누르고 바늘 끝에서 액체 방울을 관찰하십시오. 액체 방울의 부피가 배아의 부피의 약 10 분의 1이 될 때까지 마이크로 인젝터의 주입 압력을 조정합니다.
참고: 주사 바늘의 품질은 배아의 생존율에 매우 중요합니다. - 조심스럽게 45도 각도 (그림 5C)에서 배아의 상단 반구에 바늘 팁을 삽입합니다. 페달을 눌러 혼합물을 배아로 전달합니다. 주사는 태아의 약간의 팽창으로 이어집니다. 배아에서 바늘을 즉시 철회하고 다음 배아가 바늘에 근접할 때까지 한 손으로 페트리 접시를 이동하고 동일한 절차로 다음 배아를 주입합니다.
참고: 핀홀의 세포질 유출은 허용됩니다. 세포질 누설이 너무 많은 경우, 유체 유출이 제어 될 때까지 바늘의 각도를 더 심각한 각도로 조정합니다. - 충분한 부화량을 보장하기 위해 적어도 300개의 배아를 주입하십시오. 주입 후 페트리 접시(es)의 뚜껑을 덮습니다.
참고: oviposition에서 50-100 배아의 주입에 이르는 시간은 2시간으로 제한됩니다. 배아의 대부분은 이 시간 프레임 내의 1세포 단계에 아직도 있습니다. 일반적으로, 효율성을 촉진하기 위해 배아 주입 시 배아 주사 시술을 반복하는 것이 유용하다.
4. 사출 후 곤충 사육
- G0 배아의 전파.
- 14h 빛/10 h 어두운 인공 기후 상자에 60% 상대 습도 및 28°C에서 배아를 배양합니다.
- 주사 후 매일 배아의 발달을 확인하십시오. 배아의 표면 색이 어두워지면 현미경 슬라이드 주위에 페트리 접시에 인공 식단을 넣고 12 시간마다 배아의 발달을 확인하십시오.
참고: 인공 식단은 우 외 35 및 Jha 외.36에 의해 설명된 대로 준비됩니다. - 24웰 의 문화 판을 준비하고 인공 식단으로 볼륨 용량의 3 분의 1에 각각을 채웁니다.
- 작은 페인트 브러시를 사용하여 부화 애벌레(그림 5D)를 골라 24웰 배양판으로 옮겨 넣습니다. 각 애벌레가 생존하기에 충분한 음식이 있는지 확인하기 위해 우물당 하나의 애벌레를 삽입하십시오.
참고 : H. armigera 의 애벌레는 일반적으로 서로 식인화되었기 때문에 각 우물에서 개별적으로 사육되었습니다.
- G0 애벌레 사육
- 배아와 동일한 조건에서 애벌레를 후면합니다.
- 매일 부화한 애벌레를 확인하십시오. 애벌레가 세 번째 인스타 단계로 성장하면 각 유충을 새로운 유리 다틸레스레이로 옮기고, 볼륨의 5분의 1을 인공 식단으로 채웁니다.
- 잠복 후 약 12d, 성숙한 애벌레는 새끼를 시작해야합니다.
- G0 성숙한 강아지는 성별에 따라 구별되며 백과사전 전에 별도의 케이지에 배치됩니다. 야생 타입의 같은 나이 의 새끼도 준비되어 있습니다.
- G0 성인 양육
- 야생 유형과 돌연변이 푸파의 백과를 매일 확인하십시오.
- 새로 동봉 된 G0 남성 성인과 야생 유형 여성 성인을 신선한 그물 케이지로 옮기고 약 1 :1에서 G0과 야생 유형 사이의 비율을 만듭니다. 면봉에 떨어뜨린 설탕 용액을 10%(w/v)로 공급합니다.
- 상기 일상적인 방법을 사용하는 후방 곤충은 세대 1(G1)의 새끼까지.
- dactylethrae를 사용하여 새로 폐쇄 된 단일 G1 성인을 10 % (w / v) 설탕 용액으로 공급되는 플라스틱 항아리 (13cm x 12cm x 12cm)로 옮긴다. 각 항아리를 거즈로 덮습니다. 총 약 50 쌍의 G1 성인을 섭취하십시오.
참고 : 여성 나방의 백과 사전 남성 나방의. 일반적으로 3 일 된 남성과 2 일 된 여성은 성적으로 성숙하고 짝짓기를 할 준비가되어 있습니다. 새로 닫힌 성인은 먹이없이 첫 번째 가벼운 기간에 짝짓지 않습니다. - G1 성인을 플라스틱 항아리에 담그고 알을 낳은 후 수집합니다. 각 성인 나방을 1.5 mL 원심 분리 튜브에 넣습니다.
5. 녹아웃 돌연변이 감지
- 예측된 잘린 사이트에 걸쳐 프라이머 한 쌍을 디자인합니다. 프라이머는 대상 사이트에서 양쪽(업스트림 및 다운스트림)에서 최소 50bp 거리를 설정해야 합니다.
참고: 대상 시퀀스를 식별하기 위한 프라이머는 종종 큰 범위를 커버하여 효율적으로 증폭합니다. - 제1항에서 추출된 게놈 DNA를 사용한 지노피 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행한다. 20s에 대한 95 °C에서 PCR 사이클링을 수행; 20초동안 95°C의 35사이클, 20초용 55°C, 1분 동안 72°C; 72°C는 5분, 4°C를 보류한다. 1% (w/v) 아가로즈 젤을 통해 반응 제품을 확인합니다. 선택한 검출 프라이머는 PCR 제품의 품질에 의해 확인되었다. 밴드가 분명하고 구체적인 경우, 프라이머는 앰플리턴 크기에 따라 추가 돌연변이 감지에 사용될 수 있습니다.
- 편집된 잠재적인 개인을 위한 화면입니다. 집게를 사용하여 뒷다리를 조심스럽게 제거하고 각 다리를 각각 용액 매트릭스 튜브에 넣습니다. 유리 dactylethrae의 수와 일치하는 라이싱 매트릭스 튜브에 라벨을 부착합니다.
- 조직 균질화제를 사용하여 뒷다리를 균질화합니다. 속도를 6.0m/s로 설정하고 시간을 60s로 설정합니다. 제조업체의 지침에 따라 상용 gDNA 추출 키트를 사용하여 균질화된 샘플의 게놈 DNA를 추출합니다.
- 2단계에서 설명된 것과 동일한 PCR 반응 조건을 가진 유전자 계피를 사용하여 유전자 세그먼트를 증폭시한다. 유전자 염기서열 분석 서비스에 의한 유전자형을 확인한다. 동일한 항아리에 포함된 G1 돌연변이 유전자형(동일한 부위을 표적으로 삼은)이 감지되면 G1 자성을 유지하고 2세대(G2)로 이름을 바꿉니다.
- 동일한 유전자형의 G1 개인을 하나의 그물 케이지에 넣습니다. G1 자손을 자체 교차하고 동일한 방법을 사용하여 계속 화면을 합니다.
- 유전자 세그먼트를 증폭시키고 2단계에서 설명된 것과 동일한 절차로 유전자형을 확인합니다. G2 동종구선을 얻고 녹아웃 돌연변이 라인을 유지합니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 H. armigera 의 유전자 녹아웃 라인을 얻기 위한 상세한 단계를 제공합니다. 이 프로토콜에 의해 얻은 대표적인 결과는 gDNA 선택, 배아 수집 및 주입, 곤충 사육 및 돌연변이 검출을 위해 요약됩니다.
이 연구에서는, 관심있는 우리의 유전자의 표적 사이트는 두 번째 exon에 위치했다 (그림 2A). 본 사이트는 매우 보존되었고, 합성 된 sgRNA의 표적 대역 단편은 아가로즈 젤 전기 포진 (도 2B, C, D)을 사용하여 확인되었다.
남성과 여성 나방은 처음에 일정보다 짝짓기를 방지하고 가능한 한 충분한 양의 배아를 보장하기 위해 별도의 그물 케이지에서 사육되었습니다. 일반적으로, 총 300개의 수정란을 수집하였고, 1세포 단계에서 sgRNA/Cas9 단백질 혼합물(sgRNA의 300-500 ng/μL, 200 ng/μL)을 즉시 주입하였다. 주사 부피는 배아의 약 1/10이었다. 미세 주입 후, 배아는 섹션 4에 설명된 대로 사육되었고, 주입된 배아의 40%-60%가 살아남았다.
단일 sgRNA 표적의 돌연변이 검출은 G1 부모 성인으로부터 PCR 제품을 시퀀싱하여 수행하였다(그림 6B). 우리는 또한 다른 EXONs에 걸쳐 비 겹치는 sgRNA 쌍을 사용하는 효과를 테스트했습니다. 돌연변이체의 큰 삭제(도 6C,D)는 야생형 밴드(도 6A)와 쉽게 구별할 수 있다.
이 프로토콜에서 계산된 돌연변이 비율은 16명의 개별이 무작위로 시험될 때 87.50%이었습니다, 이 프로토콜이 높게 능률이었다는 것을 표시하. 유전자 녹아웃 결과는 몇몇 유전자형에서 보였습니다, 그러나 우리의 검열에서 확인된 돌연변이의 대다수는 -2 bp 모형이었습니다. 돌연변이는 게놈에 있는 단백질 번역의 조기 종결 귀착되었습니다, 그 후에 유전자 기능의 손실로 이끌어 냈습니다.
그림 1: sgRNA의 준비를 위한 순서도. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 2: H. armigera에서 대상 sgRNAs의 선택 및 합성. (A) 노란색 도메인은 엑손을 나타내고, 검은 선은 인트론을 나타낸다. 빨간색 시퀀스는 대상 시퀀스를 나타내고, 파란색 시퀀스는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 나타낸다. (B) sgRNA DNA 템플릿의 PCR 조립. (C) 시험관 내 전사 제품. (D) sgRNA의 정화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 배아 수집. (A) 검은 천으로 덮인 그물 케이지. H. 아미게라의 수컷과 암컷 나방은 짝짓기했다. (B) 현미경은 배아없이 미끄러. (C) 검은 천 조각에 50-100 배아를 포함하는 현미경 슬라이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 바늘 제제. (A) 마이크로피펫 풀러. (B) 마이크로피펫 풀러에 의해 당긴 후 미세 주입 바늘의 팁. 점선 상자는 확대된 바늘 끝을 나타냅니다. 배율 막대는 1mm 를 나타냅니다.
그림 5: 배아 미세 주입. (A) 현미경(middle)과 마이크로조작제(오른쪽)에 연결된 전자 마이크로인젝터(왼쪽)를 포함하는 미세 주입 시스템의 전체 세트. (B) 배아 및 미세 주입 바늘. (C) 배아의 주사 부위는 적색 화살표로 표지된다. 스케일 바는 현미경의 밑에 200 μm. (D) 부화한 애벌레를 나타냅니다. 배율 막대는 1mm 를 나타냅니다.
그림 6: PCR 및 젤 전기전도에 의한 돌연변이 검출. 검은 색 화살표와 빨간색 선은 sgRNA의 대상 사이트를 나타냅니다. (A) 레인 1의 대역은 야생 형으로부터 유래된 증폭 조각을 나타낸다. (b) 레인 2 및 3의 밴드는 단일 sgRNA 표적을 사용하여 돌연변이로부터 유래된 증폭 단편을 나타낸다. (C) 겹치지 않는 스그RNA 쌍을 사용하여 이종고테의 검출. 차선 4 및 5의 대역은 두 sgRNA 표적의 돌연변이로부터 유래된 증폭 단편을 나타낸다. 아래쪽 밴드는 큰 조각 삭제를 나타냅니다. (D) 결과는 호모자고테로부터 파생된다. 차선 6과 7의 밴드는 큰 조각 삭제를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
CRISPR/Cas9 시스템의 적용은 다양한 유전자 간의 유전자 기능 및 상호 작용의 분석을 위한 강력한 기술 지원을 제공하고 있습니다. 우리가 여기에서 제시하는 상세한 프로토콜은 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 통해 H. armigera 에 있는 homozygote 돌연변이의 생성을 보여줍니다. 이 믿을 수 있는 절차는 H. armigera에 있는 지시한 유전자 돌연변이 발생을 위한 간단한 쪽을 제공합니다.
CRISPR 대상 사이트의 선택은 돌연변이 발생 효율37에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 온라인 웹 사이트 CRISPOR의 여러 결과를 비교하고 분석하여 적절한 대상 사이트를 얻었습니다. 실리코에서 gRNA 예측은 몇 가지 장점을 제시합니다. 첫째, 그들은 오프 타겟 효과를 최소화하기 위해 sgRNA를 설계 할 때 H. armigera 의 전체 게놈을 분석합니다. 위에서 언급 한 온라인 자원뿐만 아니라 CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/), 다른 Lepidopteran 나방에서 유전자 편집에 도움이 될 수있는 Lepidoptera 게놈의 숫자와 기능. 둘째, 후보 sgRNAs의 순위는 직접 가능성을 비교하지만 다른 알고리즘에 따라 몇 가지 변형을 포함 할 수 있습니다. 두 목록에서 높은 평점을 가진 후보 순서는 더 신뢰할 수있는 경향이있다. 그러나, 이 프로토콜의 주요 한계는 곤충 게놈의 많은 수가 웹 사이트의 데이터베이스에 결석, 그래서 오프 대상 효과에 대 한 가능성이 있다. 또 다른 제한사항은 SgRNA 설계에 PAM 서열이 필요하며, 이로 인해 적절한 표적 사이트를 찾을 수 없다는 것입니다.
돌연변이 검열에 사용된 조직은 또한 중요한 요인입니다. 곤충의 생존율, 수명 주기 및 생리적 기능은 영향을 받지 않아야 합니다. 최적의 gDNA 추출 방법을 탐구하는 과정에서 애벌레의 미세 혈몰리프 추출은 시간을 절약하고 짝짓기를 피하기 위해 돌연변이 검출을 시도했습니다(게시되지 않은 데이터). 그러나, 이 방법은 PCR 증폭의 효율성과 성인의 생존율에 관하여 더 많은 도전을 가져왔습니다 (데이터는 표시되지 않음). 또한, 정 외.38 은 엑설비아테 또는 푸파리아를 이용한 gDNA 추출을 위한 비파괴적 방법을 보고했다. 그 사실 인정에 근거하여, 우리는 성인 나방이 자연적으로 생존하고 짝짓기를 허용하는 gDNA 추출을 위한 뒷다리를 사용하여 접근법을 수정하고 탐구하여 주어진 유전자형의 검출 정확도를 크게 향상시었습니다. 따라서, 각 성인 후보로부터 뒷다리 중 하나를 제거하여 gDNA 추출의 성공률을 높이는 새로운 방법을 개발하였다. 우리는 이 수술이 성인 나방의 생존율과 짝짓기 빈도에 영향을 미치지 않았다는 것을 추가로 확인했습니다. 더욱이, 우리는 큰 파편 삭제가 엑슨 영역(그림 6)에 걸쳐 gRNA 한 쌍을 공동 주입할 때 겔 전기포에 의해 쉽게 관찰될 수 있다는 것을 발견하여, 이는 스크리닝 시 돌연변이 식별 과정을 단순화한다.
H. armigera의 계란은 검은 천에 수집되어 미세 주입 과정에서 현미경으로 계란을 쉽게 구별 할 수 있습니다 (그림 5B). 짝짓기, oviposition, 부화 및 백closion39,40,41과 같은 Lepidopteran 나방의 일반적인 생식 행동으로 인해이 계란 수집 기술은 다른 Lepidopteran 나방에도 적용 될 수 있습니다.
결론적으로 CRISPR/Cas9 시스템은 H. 아미게라 에서 기능성 유전체학 연구를 용이하게 하는 신뢰할 수 있는 도구로 입증되었습니다. 단계별 설명을 통해 사용자는 통합 유전자 편집 프로세스를 완료할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (31725023, GW에 31861133019, CY에 31171912)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
References
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