Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd van Helicoverpa armigera (Hübner) embryo micro-injectie en knock-out mutant identificatie gemaakt door CRISPR / Cas9 genoombewerking. Gemuteerde insecten maken verder onderzoek naar genfunctie en interactie tussen verschillende genen in vivo mogelijk.
Abstract
De katoenbolworm, Helicoverpa armigera, is een van de meest destructieve plagen ter wereld. Een combinatie van moleculaire genetica, fysiologie, functionele genomica en gedragsstudies heeft van H. armigera een modelsoort gemaakt in Lepidoptera Noctuidae. Om de in vivo functies van en interacties tussen verschillende genen te bestuderen, is geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR) / geassocieerd eiwit 9 (Cas9) genoombewerkingstechnologie een handige en effectieve methode die wordt gebruikt voor het uitvoeren van functionele genomische studies. In deze studie bieden we een stapsgewijze systematische methode om gen knock-out in H. armigera te voltooien met behulp van het CRISPR / Cas9-systeem. Het ontwerp en de synthese van gids-RNA (gRNA) worden in detail beschreven. Vervolgens worden de volgende stappen, bestaande uit genspecifiek primerontwerp voor het maken van gids-RNA (gRNA), embryoverzameling, micro-injectie, insectenopfok en mutantendetectie samengevat. Ten slotte worden advies en opmerkingen over het oplossen van problemen verstrekt om de efficiëntie van genbewerking te verbeteren. Onze methode zal dienen als referentie voor de toepassing van CRISPR/Cas9 genoombewerking in H. armigera en andere Lepidoptera motten.
Introduction
De toepassing van genoombewerkingstechnologie biedt een efficiënt hulpmiddel om doelgenmutanten in diverse soorten te bereiken. De opkomst van het clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/associated protein 9 (Cas9) systeem biedt een nieuwe methode om genomen te manipuleren1. Het CRISPR/Cas9-systeem bestaat uit een geleidings-RNA (gRNA) en het Cas9-endonuclease2,3, terwijl het gRNA verder kan worden onderverdeeld in twee delen, een doel complementair CRISPR-RNA (crRNA) en een trans-activerend crRNA (tracrRNA). Het gRNA integreert met Cas9 endonuclease en vormt een ribonucleoproteïne (RNP). Met het gRNA kan Cas9-endonuclease via basecomplementatie naar een specifieke plaats van het genoom worden geleid. De RuvC- en HNH-domeinen van de Cas9 splitsen de doellocatie van het genoom drie basen voor de protospacer-adjacent motif (PAM) -sequentie en creëren een dubbelstrengsbreuk (DSB). De DNA-splitsing kan vervolgens worden gerepareerd via twee mechanismen, niet-homologe eindverbinding (NHEJ) of homologiegerichte reparatie (HDR)4. Reparatie van de DSB introduceert inserties of deleties als een manier om het beoogde gen te inactiveren, wat mogelijk een volledig verlies van genfunctie veroorzaakt. Vandaar dat de herbewerkbaarheid en specificiteit van het CRISPR/Cas9-systeem het een robuuste methode maken om genfuncties in vivo te karakteriseren en geninteracties te analyseren5.
Met tal van verdiensten is het CRISPR/Cas9-systeem toegepast op verschillende gebieden, waaronder biogeneeskunde6,7, gentherapie8,9 en landbouw10,11,12, en is het gebruikt voor verschillende biologische systemen, waaronder micro-organismen13, planten14,15, nematoden16 en zoogdieren17 . Bij ongewervelde dieren zijn veel insectensoorten onderworpen aan CRISPR/Cas9-genoombewerking, zoals de fruitvlieg Drosophila melanogaster en verder dan 18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera is een van de meest destructieve plagen ter wereld23 en beschadigt tal van gewassen, waaronder katoen, sojabonen en sorghum24,25. Met de ontwikkeling van sequencingtechnologie zijn het genoom van H. armigera, evenals dat van een reeks Lepidoptera-insectensoorten, volledig gesequenced26,27,28,29. Een groot aantal resistentie- en reukreceptorgenen is de afgelopen jaren geïdentificeerd en gekarakteriseerd van deze insecten19,27,28,29. Sommige resistentiegerelateerde genen zijn geïdentificeerd in H. armigera, zoals de genen die coderen voor cadherin30, een ATP-bindende cassettetransporter31,32, evenals HaTSPAN133. Knock-out van deze genen met behulp van CRISPR/Cas9-technologie resulteert in een hoge mate van resistentie tegen Bacillus thuringiensis (BT) toxine in gevoelige stammen. Ook sloegen Chang et al. (2017) een feromoonreceptor uit, die zijn significante functie in paringstijdregulatie valideerde19. Deze rapporten suggereren dat CRISPR/Cas9 kan fungeren als een effectief hulpmiddel om de genfunctie in vivo in insectensystemen te bestuderen. Een gedetailleerde procedure voor CRISPR/Cas9-modificatie in insectensystemen blijft echter onvolledig, wat het toepassingsgebied ervan in functionele genomica voor insecten beperkt.
Hier presenteren we een protocol voor het uitschakelen van een functioneel gen in H. armigera met behulp van het CRISPR / Cas9-systeem. Een gedetailleerd stapsgewijs protocol wordt verstrekt, inclusief het ontwerp en de voorbereiding van genspecifieke primers voor gRNA-productie, embryoverzameling, micro-injectie, insectenopfok en mutantidentificatie. Dit protocol dient als een waardevolle referentie om functionele genen in H. armigera te manipuleren en kan worden uitgebreid naar andere Lepidoptera-soorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ontwerp van genspecifieke primers en bereiding van sgRNA
- Verifieer een geconserveerd genomisch gebied in het gen van belang door middel van PCR-amplificatie- en sequencinganalyses. Amplificeer het doelgen uit het genoom-DNA van H. armigera en onderscheid de exonen en introns.
OPMERKING: De sequentiespecificiteit van de gidssite is noodzakelijk om off-target genbewerking te voorkomen. Zoek mogelijke gidsplaatsen in de exonen liggen dicht bij de 5' UTR van het gen. Dan is het belangrijk om ervoor te zorgen dat het gen volledig niet-functioneel is. Een samenvatting van het stromingspad voor de bereiding van sgRNA is geïllustreerd in figuur 1. - Kies de sgRNA-doelen. Gebruik de CRISPR online website CRISPOR (versie 4.97) (http://crispor.tefor.net/crispor.py) om te zoeken naar mogelijke gidsplaatsen in de exonen in de buurt van de 5' UTR van het gen. Voer de exonsequentie in het tekstvak in en selecteer het doelgenoom van Helicoverpa armigera (Harm_1.0). Kies de protospacer adjacent motif (PAM) optie van "20 bp-NGG" en laat de andere instellingen op de standaardparameters volgens de gebruikershandleidingen van de websites.
- Vergelijk de voorspelde gidssequenties uit de software en kies de gidsvolgorde met de hoogste voorspelde efficiëntie en de minste mismatches om de bewerkingsefficiëntie te verbeteren en off-target bewerkingen te verminderen. Een 20 bp geleidingssequentie met een of twee G op de 5 'UTR wordt aanbevolen omdat dit de snij-efficiëntie zou kunnen verhogen.
OPMERKING: Een paar gRNA's in exon-regio's worden ook aanbevolen om een grote segmentdeletie te verkrijgen, wat de detectie van mutanten in latere stappen vereenvoudigt. Zorg ervoor dat de afstand tussen de twee geselecteerde geleidereeksen ten minste 100 bp is. In dit protocol kiezen we voor het veelgebruikte SpCas9-eiwit, dat het NGG-motief herkent. Volgens de instructies van de fabrikant is de geleidingsvolgorde zonder G ook acceptabel bij het kiezen van de T7-promotor omdat de promotor een G toevoegt aan de 5 'UTR van de reeks. - Ontwerp voorwaartse en omgekeerde oligonucleotiden. Stel de volgorde van de sequentie in op 5'-20 bp guide sequence-NGG-3' en vul de gidsvolgorde om. Voeg de T7-promotorsequentie toe aan de voorwaartse en omgekeerde strenggeleidingssequentie, respectievelijk volgens de gebruikershandleiding van de gRNA-synthesekit.
OPMERKING: De PAM-sequentie NGG moet worden uitgesloten van de oligonucleotidesequentie. - Genereer het sgRNA met behulp van de gRNA-synthesekit. Dit proces omvat drie stappen: DNA-sjabloonassemblage, in vitro transcriptie en zuivering van sgRNA (figuur 2). Voer elke stap uit in overeenstemming met de gebruikersinstructies.
2. Bereiding en verzameling van embryo's
- Scheid mannelijke en vrouwelijke poppen zoals beschreven door Hongtao et al.34 en scheid ze in twee verschillende netkooien. Voer ze na eclosie ~ 30 ml 10% (w / v) witte suikeroplossing in absorberend katoen in een petrischaal.
OPMERKING: 3 g witte suiker werd opgelost in 30 ml steriel water om de 10% (w / v) witte suikeroplossing te bereiden. - Selecteer 50 gezonde individuen uit respectievelijk 3 dagen oude mannetjes en 2 dagen oude vrouwtjes en meng ze in een schone netkooi. Leg een stuk katoen met 10% (w/v) suikeroplossing in de kooi en houd het katoen vochtig. Bedek de netkooien met gaas en bevestig het gaas met een elastiekje. Spuit water op het gaas om vochtig te blijven.
- Laat geselecteerde mannelijke en vrouwelijke motten in stap 2 volledig paren en observeer de hoeveelheid eieren leggen.
OPMERKING: De piek van ovipositie van H. armigera verschijnt na 21:00 uur.m. Daarom moet de tijd van de paring worden overwogen om een voldoende aantal eieren in de volgende stappen te garanderen. Vervang op het hoogtepunt van de ovipositie het gaas door een zwarte doek en schakel vrije ovipositie in gedurende 30 minuten. Vervang de zwarte doek elke 30 minuten voor het verzamelen van verse eieren (figuur 3A). - Snijd de zwarte doek in onregelmatig gevormde vlekken met een grootte van ongeveer 3 mm. Zorg voor meer eieren op elke pleister.
OPMERKING: Vermijd het kiezen van gerimpelde eieren omdat ze meestal onbevrucht zijn. - Plak dubbelzijdige tape op een microscoopglaasje (25 mm x 75 mm) (figuur 3B). Plak met een tang de pleisters met eieren op een rij op het oppervlak van de dubbelzijdige tape. Druk op de marge van elke patch om ervoor te zorgen dat ze stevig aan de tape blijven plakken. Verzamel 50-100 eieren per microscoopglaasje (figuur 3C).
OPMERKING: De patches moeten het volledige oppervlak van de dubbelzijdige tape bedekken, anders zal de uitkomende larve moeite hebben om eruit te kruipen. - Houd vóór micro-injectie de microscoopglaas op ijs om de ontwikkeling van embryo's te vertragen.
3. Micro-injectie van embryo's
- Bereid de naald voor door aan een capillair glas te trekken met behulp van een micropipettetrekker (figuur 4A). Stel Warmte in op 540, Trek op 80, Vel op 75, Tijd op 170 en Druk op 450. Aard de naaldpunt met behulp van een micromolen. De ideale naald toont een scherpe punt (figuur 4B).
- Bereiding van injectieoplossingen. Voeg 2 μL gecommercialiseerd Cas9-eiwit (1 mg/ml) en sgRNA (eindconcentratie van 300-500 ng/μL) toe aan RNase-vrij water in een PCR-buis om een volumemengsel van 10 μL te verkrijgen. Het volume sgRNA hangt af van de concentratie. Meng goed door te pipetteren en leg het op ijs.
OPMERKING: Alle pipetpunten en PCR-buizen die in deze stap worden gebruikt, zijn RNase-vrij. - Stel de parameters van de elektronische micro-injector in. Stel de injectiedruk (pi) in op 1.500 hPa, de injectietijd (ti) op 0,1 s en de compensatiedruk (pc) op 30 hPa.
- Laad 2 μL van het mengsel in een naald met behulp van een pipetpunt van een microlader. De restlucht in de punt van de naald moet zoveel mogelijk worden afgevoerd.
- Sluit de injectienaald aan op een micromanipulator en zorg voor een nauwe verbinding tussen de twee delen.
- Plaats een dia in een petrischaal (100 mm) en leg ze op het podium van de microscoop (figuur 5A).
- Pas de positie van de naaldpunt onder een lichtmicroscoop aan totdat zowel de naaldpunt als de embryo's zichtbaar zijn onder de microscoop (figuur 5B).
- Pas het volume van de druppel aan. Druk op het pedaal en observeer de vloeistofdruppel aan de punt van de naald. Pas de injectiedruk van de micro-injector aan totdat het volume van een vloeistofdruppel ongeveer een tiende van het volume van de embryo's is.
OPMERKING: De kwaliteit van de injectienaald is van vitaal belang voor de overlevingskans van embryo's. - Steek de naaldpunt voorzichtig in de bovenste halve bol van een embryo in een hoek van 45 graden (figuur 5C). Druk op het pedaal om het mengsel in het embryo af te geven. De injectie leidt tot een lichte uitbreiding van het embryo. Trek de naald onmiddellijk uit het embryo en beweeg de petrischaal met één hand totdat het volgende embryo zich in de buurt van de naald bevindt en injecteer het volgende embryo met dezelfde procedure.
OPMERKING: De cytoplasmatische uitstroom bij het gaatje is acceptabel. Als de cytoplasmatische lekkage te groot is, stel dan de hoek van de naald in een zwaardere hoek in totdat de vloeistofuitstroom is geregeld. - Injecteer ten minste 300 embryo's om te zorgen voor een voldoende broedhoeveelheid. Dek het deksel van de petrischaal(en) na injectie af.
OPMERKING: De tijd van ovipositie tot injectie van de 50-100 embryo's is beperkt tot 2 uur. De meeste embryo's bevinden zich binnen dit tijdsbestek nog in het eencellige stadium. Over het algemeen is het nuttig om de ovipositieprocedure tijdens embryo-injectie te herhalen om de efficiëntie te bevorderen.
4. Insectenopfok na injectie
- Vermeerdering van G0-embryo's.
- Incubeer de embryo's bij 60% relatieve vochtigheid en 28°C in een kunstmatige klimaatbox met 14 uur licht/10 uur donker.
- Controleer de ontwikkeling van embryo's dagelijks na injectie. Wanneer de oppervlaktekleur van embryo's donkerder is geworden, plaatst u kunstmatige voeding in de petrischaal rond de microscoopglaasje en controleert u de ontwikkeling van embryo's elke 12 uur.
OPMERKING: Het kunstmatige dieet wordt bereid zoals beschreven door Wu et al.35 en Jha et al.36. - Bereid 24-well kweekplaten en vul elke put tot een derde van zijn volumetrische capaciteit met kunstmatig dieet.
- Kies uit broedende larven (figuur 5D) met een kleine verfkwast en breng ze over op de 24-well kweekplaat. Plaats één larve per put om ervoor te zorgen dat elke larve voldoende voedsel heeft om te overleven.
OPMERKING: De larven van H. armigera werden individueel in elke put grootgebracht, omdat ze elkaar meestal kannibaliseerden.
- G0 larven kweken
- Fok de larven in dezelfde omstandigheden als de embryo's.
- Controleer de uitgekomen larven elke dag. Wanneer larven groeien tot het derde instar-stadium, breng elke larve over in een nieuwe glazen dactylethrae en vult een vijfde van het volume met kunstmatig dieet.
- Ongeveer 12 d na incubatie moeten de volwassen larven beginnen te verpoppen.
- De G0 volwassen poppen worden onderscheiden op basis van geslacht en in aparte kooien geplaatst voor eclosie. De poppen van dezelfde leeftijd van het wilde type worden ook bereid.
- G0 volwassenen opvoeden
- Controleer dagelijks de eclosie van zowel wilde als gemuteerde poppen.
- Breng de nieuw gesloten G0 mannelijke volwassenen en wilde type vrouwelijke volwassenen over in een verse netkooi en maak de verhouding tussen G0 en wildtype op ongeveer 1: 1. Voorzie ze van 10% (w / v) suikeroplossing die in wattenbollen is gevallen.
- Kweek insecten met behulp van de routinemethode hierboven tot de verpopping van generatie één (G1).
- Breng met behulp van een dactylethrae het nieuw gesloten enkele paar G1-volwassenen over in een plastic pot (13 cm x 12 cm x 12 cm) geleverd met 10% (w / v) suikeroplossing. Bedek elke pot met gaas. Neem in totaal ongeveer 50 paar G1-volwassenen.
OPMERKING: Eclosie van vrouwelijke motten dateert van vóór die van mannelijke motten. Over het algemeen zijn een 3 dagen oud mannetje en een 2 dagen oud vrouwtje geslachtsrijp en klaar om te paren. De pas gesloten volwassenen zullen in hun eerste lichtperiode niet paren zonder te voeden. - Verzamel de G1-volwassenen in een plastic pot nadat ze eieren hebben gelegd. Doe elke volwassen mot in een centrifugebuis van 1,5 ml.
5. Knock-out mutant detectie
- Ontwerp een paar primers over de voorspelde afgeknotte locatie. De primers moeten ten minste 50 bp afstand aan weerszijden (stroomopwaarts en stroomafwaarts) van de doellocatie worden ingesteld.
OPMERKING: De primers voor de identificatie van de doelsequentie bestrijken vaak grote overspanningen om efficiënt te versterken. - Voer de PCR-reactie uit met behulp van de genotyperingsprimers met genoom-DNA geëxtraheerd in sectie 1. Voer PCR-cycli uit bij 95 °C gedurende 20 s; 35 cycli van 95 °C gedurende 20 s, 55 °C gedurende 20 s en 72 °C gedurende 1 minuut; 72 °C gedurende 5 minuten en 4 °C in de wachtstand. Controleer het reactieproduct via 1% (w/v) agarosegel. Het geselecteerde paar detectieprimers werd bevestigd door de kwaliteit van het PCR-product. Als de banden duidelijk en specifiek zijn, kunnen de primers worden gebruikt voor verdere mutantdetectie op basis van amplicongrootte.
- Scherm voor potentiële bewerkte personen. Verwijder een achterbeen voorzichtig met een tang en plaats elk been in een liggende matrixbuis. Label de lysing matrix buis in overeenstemming met het nummer op de glazen dactylethrae.
- Homogeniseer het achterbeen met behulp van een weefselhomogenisator. Stel de snelheid in op 6,0 m/s en de tijd op 60 s. Extraheer het genomische DNA van het gehomogeniseerde monster met behulp van een commerciële gDNA-extractiekit volgens de instructies van de fabrikant.
- Versterk het gensegment met genotyperingsprimers met dezelfde PCR-reactiecondities als beschreven in stap 2. Bevestig het genotype door een gensequencingservice. Zodra G1-mutante genotypen (gericht op dezelfde plaats) in dezelfde pot werden gedetecteerd, behoudt u het G1-nageslacht en hernoemt u het als generatie twee (G2).
- Zet G1-individuen van hetzelfde genotype in één netkooi. Kruis zelf de G1-nakomelingen en blijf screenen met dezelfde methoden.
- Versterk het gensegment en bevestig het genotype met dezelfde procedure als beschreven in stap 2. Verkrijg G2 homozygote lijnen en handhaaf de knock-out mutantenlijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol biedt gedetailleerde stappen voor het verkrijgen van gen knock-out lijnen van H. armigera met behulp van CRISPR / Cas9-technologie. De representatieve resultaten verkregen door dit protocol worden samengevat voor gDNA-selectie, embryoverzameling en -injectie, insectenopfok en mutantendetectie.
In deze studie bevond de doelplaats van ons interessante gen zich in zijn tweede exon (figuur 2A). Deze site was sterk geconserveerd en het doelbandfragment van gesynthetiseerd sgRNA werd bevestigd met behulp van agarosegel-elektroforese (figuur 2B, C, D).
De mannelijke en vrouwelijke nachtvlinders werden aanvankelijk in aparte netkooien grootgebracht om paring voor op schema te voorkomen en zoveel mogelijk te zorgen voor voldoende embryo's. Over het algemeen werd een totaal aantal van 300 bevruchte eieren verzameld en onmiddellijk geïnjecteerd met het sgRNA / Cas9-eiwitmengsel (300-500 ng / μL sgRNA, 200 ng / μL Cas9-eiwit) in het eencellige stadium. Het injectievolume was ongeveer een tiende van dat van de embryo's. Na micro-injectie werden de embryo's gekweekt zoals beschreven in sectie 4 en 40% -60% van de geïnjecteerde embryo's overleefde.
De mutantdetectie van een enkel sgRNA-doelwit werd uitgevoerd door de PCR-producten van G1-oudervolwassenen te sequentiëren (figuur 6B). We hebben ook de effectiviteit getest van het gebruik van niet-overlappende sgRNA-paren over verschillende exonen. De grote deletie van de mutanten (figuur 6C,D) is gemakkelijk te onderscheiden van wilde banden (figuur 6A).
De mutatiesnelheid berekend in dit protocol was 87,50% wanneer 16 personen willekeurig worden getest, wat aangeeft dat dit protocol zeer efficiënt was. Gen knock-out resultaten werden getoond in verschillende genotypen, maar de meerderheid van de mutanten geïdentificeerd uit onze screening waren -2 bp type. Mutaties resulteerden in de voortijdige beëindiging van eiwittrans translatie in het genoom, wat vervolgens leidde tot het verlies van de genfunctie.
Figuur 1: Het stroomdiagram voor de bereiding van sgRNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Selectie en synthese van doel-sgRNA's uit H. armigera. (A) Het gele domein vertegenwoordigt het exon, terwijl de zwarte lijn het intron vertegenwoordigt. De rode sequenties geven de doelvolgorde aan en de blauwe sequenties geven het protospacer aangrenzende motief (PAM) aan. (B) PCR-assemblage van het sgRNA DNA-sjabloon. C) Het in vitro transcriptieproduct. (D) Zuivering van sgRNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Embryoverzameling. (A) Een met zwarte doek beklede netkooi. De mannelijke en vrouwelijke motten van H. armigera waren aan het paren. (B) Het microscoopglaasje zonder embryo's. (C) Het microscoopglaasje met 50-100 embryo's op stukjes zwarte doek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Naaldvoorbereiding. (A) Micropipettetrekker. (B) Punt van een micro-injectienaald na het trekken door een micropipettetrekker. Het gestippelde vak geeft de vergrote naaldpunt aan. Schaalbalk vertegenwoordigt 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Embryo micro-injecties. (A) De hele set van een micro-injectiesysteem met een microscoop (midden) en een elektronische micro-injector (links) verbonden met een micromanipulator (rechts). B) Embryo's en micro-injectienaald. (C) De injectieplaats van het embryo is gelabeld met de rode pijl. Schaalbalk vertegenwoordigt 200 μm. (D) Een uitgekomen larve onder de microscoop. Schaalbalk vertegenwoordigt 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Detectie van mutanten door PCR en gel-elektroforese. De zwarte pijlen en rode lijnen geven de doellocaties van het sgRNA aan. (A) De band in baan 1 vertegenwoordigt het versterkingsfragment afgeleid van het wildtype. (B) De banden in baan 2 en 3 vertegenwoordigen het versterkingsfragment afgeleid van mutant met behulp van een enkel sgRNA-doelwit. (C) De detectie van een heterozygoot met behulp van een paar niet-overlappende sgRNA. De banden in de banen 4 en 5 vertegenwoordigen het amplificatiefragment afgeleid van de mutatie van twee sgRNA-doelen. De onderste banden duiden op een grote fragmentdeletie. (D) De resultaten zijn afgeleid van een homozygoot. De banden in rijstrook 6 en 7 geven de grote fragmentverwijdering aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De toepassing van het CRISPR/Cas9-systeem heeft krachtige technische ondersteuning geboden voor de analyse van de genfunctie en interactie tussen verschillende genen. Het gedetailleerde protocol dat we hier presenteren, toont de generatie van een homozygote mutant in H. armigera via CRISPR / Cas9-genoombewerking. Deze betrouwbare procedure biedt een eenvoudige manier voor gerichte genmutagenese bij H. armigera.
De keuze van crispr-doellocaties kan van invloed zijn op de mutagenese-efficiëntie37. In dit protocol hebben we meerdere resultaten van de online website CRISPOR vergeleken en geanalyseerd om een geschikte doelsite te verkrijgen. In silico bieden gRNA-voorspellingen enkele voordelen. Ten eerste analyseren ze het hele genoom van H. armigera bij het ontwerpen van sgRNA's om de off-target effecten te minimaliseren. De hierboven genoemde online bronnen, evenals CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/), functioneren met een aantal Lepidoptera-genomen, wat gunstig kan zijn voor genbewerking in andere Lepidoptera-motten. Ten tweede vergelijkt de rangschikking van de kandidaat-sgRNA's de mogelijkheden rechtstreeks, maar kan deze enkele variaties bevatten op basis van de verschillende algoritmen. De kandidatenreeks met hoge beoordelingen in beide lijsten is meestal betrouwbaarder. Een belangrijke beperking van dit protocol is echter dat een groot aantal insectengenomen afwezig is in de databases van de websites, dus er is potentieel voor off-target effecten. Een andere beperking is dat de PAM-sequentie noodzakelijk is voor het sgRNA-ontwerp, wat kan resulteren in het onvermogen om een geschikte doellocatie te vinden.
De weefsels die worden gebruikt voor mutantenscreening zijn ook een cruciale factor. De overlevingskans, levenscyclus en fysiologische functies van insecten mogen niet worden beïnvloed. In ons proces van het verkennen van de optimale gDNA-extractiemethode, werd de micro-hemolymfe-extractie uit larven geprobeerd voor mutantendetectie om tijd te besparen en paring te voorkomen (ongepubliceerde gegevens). Deze methode bracht echter meer uitdagingen met zich mee met betrekking tot de efficiëntie van PCR-versterking en de overlevingskansen van volwassenen (gegevens niet weergegeven). Bovendien rapporteerden Zheng et al.38 een niet-destructieve methode voor gDNA-extractie met behulp van het exuviaat of puparia. Op basis van die bevindingen hebben we een aanpak aangepast en onderzocht met behulp van achterpoten voor gDNA-extractie, waardoor volwassen motten op natuurlijke wijze kunnen overleven en paren, waardoor de detectienauwkeurigheid van een bepaald genotype aanzienlijk wordt verbeterd. Daarom hebben we een nieuwe methode ontwikkeld om het slagingspercentage van gDNA-extractie te verhogen door een van de achterpoten van elke volwassen kandidaat te verwijderen. We bevestigden verder dat deze operatie geen invloed had op de overlevingskans en paringsfrequentie van volwassen motten. Bovendien ontdekten we dat de grote fragmentdeletie gemakkelijk kan worden waargenomen door de gel-elektroforese wanneer deze wordt geïnjecteerd met een paar gRNA's in exon-regio's (figuur 6), wat het proces van mutantenidentificatie bij screening vereenvoudigt.
De eieren van H. armigera worden verzameld op een zwarte doek, waardoor het gemakkelijk is om de eieren onder de microscoop te onderscheiden tijdens het micro-injectieproces (figuur 5B). Vanwege het algemene voortplantingsgedrag van Lepidoptera-motten zoals paring, ovipositie, uitkomen en eclosie39,40,41, kan deze methode voor het verzamelen van eieren ook worden toegepast op andere Lepidoptera-motten.
Kortom, het CRISPR/Cas9-systeem heeft bewezen een betrouwbaar hulpmiddel te zijn voor het faciliteren van functionele genomics-studies in H. armigera. De stapsgewijze beschrijvingen stellen gebruikers in staat om een integraal genbewerkingsproces te voltooien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (31725023, 31861133019 voor GW en 31171912 voor CY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
References
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR. Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).
- Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. CRISPR editing in biological and biomedical investigation. Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).
- Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model. DNA Repair. 46, 1-8 (2016).
- Wu, J., et al. Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).
- Jiao, R., Gao, C. The CRISPR/Cas9 genome editing revolution. Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).
- Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems. World Patent Information. 60, 101944 (2020).
- Es, I., et al. The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges. Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).
- Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes. Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).
- Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -G. CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications. Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).
- Pandey, P. K., et al. Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research. Seminars in Cell & Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
- Mojica, F. J., Montoliu, L. On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals. Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Koutroumpa, F., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).
- Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).
- Fitt, G. P. The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems. Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).
- Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (Hübner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management. Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).
- Ai, D., et al. Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera Hübner (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).
- Wan, F., et al. A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Cheng, T., et al. Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest. Nature Ecology & Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).
- Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore. Science Reports. 6, 23666 (2016).
- Gouin, A., et al. Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Wang, J., et al. Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).
- Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins. Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).
- Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm. PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).
- Jin, L., et al. Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).
- Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision. Tobacco Sciene & Technology. 53 (2), 21-26 (2019).
- Wu, K., Gong, P. A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm. Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).
- Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics. Environmental Entomology. (1), 30 (2012).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).
- Zheng, M. -Y., et al. A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia. Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).
- Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae). Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).
- Kamimura, M., Tatsuki, S. Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).
- Edwards, K. D. Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE). Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).
