Summary
这里展示的是 Helicoverpa armigera （Hübner）胚胎显微注射和通过CRISPR / Cas9基因组编辑创建的敲除突变体鉴定的方案。突变昆虫能够进一步研究体内不同基因的功能和相互作用。
Abstract
棉铃虫， Helicoverpa armigera，是世界上最具破坏性的害虫之一。分子遗传学，生理学，功能基因组学和行为研究的结合使 H. armigera 成为鳞翅目夜蛾科的模型物种。为了研究不同基因的体内功能和相互作用，簇状规则间隔的短回文重复序列（CRISPR）/相关蛋白9（Cas9）基因组编辑技术是一种用于进行功能基因组研究的方便有效的方法。在这项研究中，我们提供了一种循序渐进的系统方法，使用CRISPR / Cas9系统完成 臂状芽胞 杆菌中的基因敲除。详细描述了引导RNA（gRNA）的设计和合成。然后，总结了由引导RNA（gRNA）创建，胚胎收集，显微注射，昆虫饲养和突变体检测的基因特异性引物设计组成的后续步骤。最后，提供故障排除建议和注释，以提高基因编辑的效率。我们的方法将作为CRISPR / Cas9基因组编辑在 臂状芽孢 杆菌以及其他鳞翅目蛾中的应用的参考。
Introduction
基因组编辑技术的应用为实现不同物种的靶基因突变体提供了有效的工具。簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）/相关蛋白9（Cas9）系统的出现提供了一种操纵基因组的新方法1。CRISPR/Cas9系统由引导RNA（gRNA）和Cas9内切酶2，3组成，而gRNA可以进一步分为两部分，靶向互补CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）。gRNA与Cas9内切酶整合并形成核糖核蛋白（RNP）。使用gRNA，Cas9内切酶可以通过碱基互补被引导到基因组的特定位点。Cas9的RuvC和HNH结构域在原始间隔体相邻基序（PAM）序列之前切割基因组的三个碱基的靶位点，并产生双链断裂（DSB）。然后，DNA切割可以通过两种机制进行修复，即非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）4。DSB的修复引入了插入或缺失作为灭活靶向基因的方法，可能导致基因功能完全丧失。因此，CRISPR/Cas9系统的可异性和特异性使其成为表征体内基因功能和分析基因相互作用的可靠方法5。
CRISPR/Cas9系统具有诸多优点，已应用于生物医学6、7、基因治疗8、9、农业等各个领域10、11、12，并已用于各种生物系统，包括微生物13、植物14、15、线虫16 和哺乳动物17.在无脊椎动物中，许多昆虫物种都经过CRISPR/Cas9基因组编辑，如果蝇 果蝇黑腹果 蝇等18，19，20，21，22。
Helicoverpa armigera是全球最具破坏性的害虫之一23，并损害了许多作物，包括棉花，大豆和高粱24，25。随着测序技术的发展，阿米格拉氏菌的基因组以及一系列鳞翅目昆虫物种的基因组已经完全测序26，27，28，29。近年来，从这些昆虫中鉴定和表征了大量的抗性和嗅觉受体基因19，27，28，29。在臂状螺旋体中已经发现了一些与抗性相关的基因，例如编码钙粘蛋白30，ATP结合盒转运蛋白31，32以及HaTSPAN133的基因。使用CRISPR / Cas9技术敲除这些基因可导致对易感菌株中苏云金芽孢杆菌（BT）毒素的高度抗性。此外，Chang等人（2017）敲除了一种信息素受体，这验证了其在交配时间调节方面的重要功能19。这些报告表明，CRISPR/Cas9可以作为研究昆虫系统中体内基因功能的有效工具。然而，CRISPR/Cas9修饰在昆虫系统中的详细程序仍不完整，这限制了其在昆虫功能基因组学中的应用范围。
在这里，我们提出了一种使用CRISPR / Cas9系统敲除 臂状 芽蒿蒿中功能基因的方案。提供了详细的分步方案，包括设计和制备用于gRNA生产，胚胎收集，显微注射，昆虫饲养和突变体鉴定的基因特异性引物。该协议可作为操纵 臂状蛊 虫中任何功能基因的宝贵参考，并且可以扩展到其他鳞翅目物种。
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Protocol
1. 基因特异性引物的设计及sgRNA的制备
- 通过PCR扩增和测序分析验证目标基因中的保守基因组区域。从 臂状 芽胞杆菌的基因组DNA中扩增靶基因，并区分外显子和内含子。
注意：引导位点的序列特异性对于避免脱靶基因编辑是必要的。在外显子中搜索可能的引导位点接近基因的5'UTR。然后，重要的是要确保基因完全无功能。用于制备sgRNA的流路摘要如图 1所示。 - 选择sgRNA靶标。使用CRISPR在线网站 CRISPO（版本4.97）（http://crispor.tefor.net/crispor.py）在靠近基因5'UTR的外显子中搜索可能的引导位点。将外显子序列输入文本框，然后选择 黑 猩猩（Harm_1.0）的靶基因组。选择"20 bp-NGG"的原型间隔相邻图案（PAM）选项，并根据网站的用户手册将其他设置保留在默认参数上。
- 比较软件中预测的引导序列，选择预测效率最高、失配最少的导轨序列，提高编辑效率，减少脱靶编辑。建议在 5' UTR 上使用包含一个或两个 G 的 20 bp 导向序列，因为它可以提高切割效率。
注意：还建议跨外显子区域使用一对gRNA来获得大片段缺失，从而简化了后续步骤中的突变检测。确保两个选定导轨序列之间的间距至少为 100 bp。在这个方案中，我们选择常用的SpCas9蛋白，它识别NGG基序。根据制造商的说明，在选择T7启动子时，缺少G的引导序列也是可以接受的，因为启动子在序列的5'UTR中增加了一个G。 - 设计正向和反向寡核苷酸。将序列顺序设置为5'-20 bp引导序列-NGG-3'，并反向补充引导序列。将T7启动子序列分别加入正向和反向链引导序列中，分别根据gRNA合成试剂盒的用户指南。
注意：PAM序列NGG应从寡核苷酸序列中排除。 - 使用gRNA合成试剂盒生成sgRNA。该过程包括三个步骤：DNA模板组装，体外转录和sgRNA纯化（图2）。按照用户说明执行每个步骤。
2. 胚胎制备和收集
- 如Hongtao等人34 所描述的那样，将雄性和雌性蛹分开，并将它们分成两个不同的网箱。关闭后，在培养皿中用吸收棉喂养〜30 mL的10%（w / v）白糖溶液。
注意：将3g白糖溶解在30mL无菌水中，以制备10%（w / v）白糖溶液。 - 分别从3日龄的雄性和2日龄的雌性中选择50个健康个体，并将它们混合在干净的网笼中。将一块含有10%（w / v）糖溶液的棉花放入笼子中，并保持棉花湿润。用纱布盖住网架，并用橡皮筋固定纱布。将水喷洒在纱布上以保持湿润。
- 让步骤2中选定的雄性和雌性蛾完全交配并观察产卵量。
注： 阿米格拉 嗜血杆菌的产卵高峰出现在.m 9：00之后。因此，应考虑交配的时间，以确保在随后的步骤中有足够的卵。在产卵高峰期，用黑布代替纱布，使游离产卵30分钟。每30分钟更换一次黑布以收集新鲜鸡蛋（图3A）。 - 将黑布切成形状不规则的斑块，大小约为3毫米。确保每个贴片上有更多的卵子。
注意：避免选择有皱纹的卵子，因为它们通常是未受精的。 - 将双面胶带粘贴到显微镜载玻片（25 mm x 75 mm）上（图3B）。使用镊子，将带有卵的贴片连续粘贴在双面胶带的表面上。按每个贴片的边缘，确保它们牢固地粘在胶带上。每个显微镜载玻片收集50-100个卵（图3C）。
注意：贴片需要覆盖双面胶带的整个表面，否则孵化幼虫将难以爬出。 - 在显微注射之前，将显微镜载玻片保持在冰上以延缓胚胎的发育。
3. 胚胎显微注射
- 使用微量移液器拉动毛细管玻璃准备针头（图4A）。将 "热量 "设置为 540， 将"拉力" 设置为 80， 将"维尔 "设置为 75， 将"时间" 设置为 170，将 "压力" 设置为 450。使用微型研磨机研磨针尖。理想的针头显示一个锋利的尖端（图4B）。
- 注射液的制备。在PCR管中向不含RNase的水中加入2μL商业化的Cas9蛋白（1mg / mL）和sgRNA（300-500ng / μL终浓度），以获得10μL体积的混合物。sgRNA的体积取决于其浓度。通过移液混合，然后将其放在冰上。
注意：本步骤中使用的所有移液器吸头和PCR管均不含RNase。 - 设置电子微注射器的参数。将注射压力（pi）设置为1，500 hPa，注射时间（ti）设置为0.1 s，补偿压力（pc）设置为30 hPa。
- 使用微型装载机移液器尖端将2μL混合物加载到针中。针尖的残余空气应尽可能排出。
- 将注射针连接到显微操作器，并确保两个部件之间的紧密连接。
- 将载玻片放入培养皿（100 mm）中，并将它们放在显微镜的载物台上（图5A）。
- 在光学显微镜下调整针尖的位置，直到针尖和胚胎在显微镜下都可见（图5B）。
- 调整液滴的体积。踩下踏板并观察针尖处的液滴。调节微注射器的注射压力，直到液滴的体积约为胚胎体积的十分之一。
注意：注射针的质量对于胚胎的存活率至关重要。 - 小心地将针尖以45度角插入胚胎的上半球（图5C）。踩踏板将混合物输送到胚胎中。注射导致胚胎的轻微扩张。立即从胚胎中取出针头，用一只手移动培养皿，直到下一个胚胎靠近针头，然后用相同的程序注射下一个胚胎。
注意：针孔处的细胞质流出是可以接受的。如果细胞质泄漏过多，请将针头的角度调整到更严重的角度，直到流体流出得到控制。 - 注射至少300个胚胎，以确保足够的孵化量。注射后盖上培养皿的盖子。
注意：从产卵到注射50-100个胚胎的时间限制为2小时。在这个时间框架内，大多数胚胎仍处于单细胞阶段。通常，在胚胎注射期间重复产卵过程以提高效率是有用的。
4. 注射后养虫
- G0胚胎的繁殖。
- 将胚胎在60%相对湿度和28°C的人造气候箱中孵育，光线为14小时/ 10小时黑暗。
- 注射后每天检查胚胎的发育情况。当胚胎的表面颜色变暗时，将人造饮食放入显微镜载玻片周围的培养皿中，并每12小时检查一次胚胎的发育情况。
注：人工饮食的制备方法如Wu等人35 和Jha等人36所述。 - 准备24孔培养板，并用人工饮食填充每个孔的体积容量的三分之一。
- 使用小画笔挑选出孵化的幼虫（图5D），并将它们转移到24孔培养板中。每孔插入一个幼虫，以确保每个幼虫有足够的食物来生存。
注： 阿米格拉 氏菌的幼虫在每个井中单独饲养，因为它们通常相互蚕食。
- G0幼虫饲养
- 在与胚胎相同的条件下饲养幼虫。
- 每天检查孵化的幼虫。当幼虫长到第三龄阶段时，将每个幼虫转移到新的玻璃指状芽孢子中，用人工饲料填充五分之一的体积。
- 孵育后约12天，成熟的幼虫应开始化蛹。
- G0成熟蛹根据性别进行区分，并在关闭前放置在单独的笼子中。还准备了野生型的同龄蛹。
- G0成人饲养
- 每天检查野生型和突变蛹的关闭情况。
- 将新近关闭的G0雄性成虫和野生型雌性成虫转移到新鲜的网笼中，使G0和野生型之间的比例约为1：1。向他们提供10%（w / v）糖溶液滴在棉球中。
- 尾部昆虫使用上述常规方法，直到第一代（G1）化蛹。
- 使用指状耳蜗，将新近关闭的一对G1成虫转移到塑料罐（13 cm x 12 cm x 12 cm）中，该罐子提供10%（w / v）糖溶液。用纱布盖住每个罐子。总共约50对G1成人。
注：雌蛾的关闭时间早于雄蛾。一般来说，3天大的雄性和2天大的雌性在性方面是成熟的，并准备交配。新近关闭的成虫在没有进食的情况下不会在第一个光照期间交配。 - 将G1成虫产卵后收集在塑料罐中。将每只成年飞蛾放入1.5 mL离心管中。
5. 敲除突变体检测
- 设计一对跨越预测截断位点的引物。引物应设置在距离靶点至少50 bp的两侧（上游和下游）距离。
注意：用于鉴定靶序列的引物通常覆盖大跨度以有效扩增。 - 使用在第1节中提取的基因组DNA的基因分型引物进行PCR反应。在95°C下进行PCR循环20秒;35次循环，95°C持续20秒，55°C持续20秒，72°C持续1分钟;72°C持续5分钟，4°C保持。通过1%（w / v）琼脂糖凝胶验证反应产物。所选的检测引物对通过PCR产物的质量得到确认。如果条带明显且特异性，则引物可用于基于扩增子大小的进一步突变体检测。
- 筛选潜在的编辑人员。使用镊子小心地取出后腿，并将每条腿分别放入裂解基质管中。标记裂解基质管与玻璃指状体上的数字一致。
- 使用组织均质器使后腿均质化。将速度设置为 6.0 m/s，将时间设置为 60 s。根据制造商的说明，使用商用gDNA提取试剂盒提取均质化样品的基因组DNA。
- 使用基因分型引物扩增基因片段，其PCR反应条件与步骤2中所述相同。通过基因测序服务确认基因型。一旦检测到同一罐子中包含的G1突变基因型（靶向同一位点），保留G1后代并将其重命名为第二代（G2）。
- 将相同基因型的G1个体放入一个网笼中。自我穿越G1后代并继续使用相同的方法进行筛选。
- 扩增基因片段并使用步骤2中概述的相同程序确认基因型。获得G2纯合子系并保持敲除突变系。
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Representative Results
该协议提供了使用CRISPR / Cas9技术获得 臂状芽蒿 的基因敲除系的详细步骤。总结了通过该协议获得的代表性结果，用于gDNA选择，胚胎收集和注射，昆虫饲养和突变体检测。
在这项研究中，我们感兴趣的基因的靶位点位于其第二个外显子中（图2A）。该位点高度保守，使用琼脂糖凝胶电泳确认合成sgRNA的目标条带片段（图2B，C，D）。
雄蛾和雌蛾最初在单独的网笼中饲养，以防止提前交配，并确保尽可能多的胚胎。一般来说，在单细胞阶段收集总共300个受精卵，并立即注射sgRNA / Cas9蛋白混合物（300-500ng / μL的sgRNA，200 ng / μL的Cas9蛋白）。注射量约为胚胎的十分之一。显微注射后，胚胎按照第4节所述进行饲养，40%-60%的注射胚胎存活下来。
通过对来自G1亲本成体的PCR产物进行测序来检测单个sgRNA靶标的突变体检测（图6B）。我们还测试了在不同外显子上使用非重叠sgRNA对的有效性。突变体的大量缺失（图6C，D）可以很容易地与野生型条带区分开来（图6A）。
当随机测试16个人时，该协议中计算的突变率为87.50%，表明该协议是高效的。基因敲除结果显示在几种基因型中，但从我们的筛选中鉴定出的大多数突变体是-2 bp型。突变导致基因组中蛋白质翻译的过早终止，随后导致基因功能的丧失。
图 1：制备 sgRNA 的流程图。请单击此处查看此图的放大版本。
图2：来自臂状芽孢杆菌的靶sgRNA的选择和合成（A）黄色结构域代表外显子，而黑线代表内含子。红色序列表示目标序列，蓝色序列表示原始间隔相邻基序（PAM）。（B）SGRNA DNA模板的PCR组装。（三）体外转录产物。（D）纯化sgRNA。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：胚胎收集。 （A）用黑布覆盖的网笼。H. armigera的雄性和雌性飞蛾正在交配。（B）显微镜载玻片没有胚胎。（C）将含有50-100个胚胎的显微镜载玻片放在黑布片上。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：针头准备。 （A）微量移液器拉拔器。（B）微量吸管拉拔器拉动后微注射针的尖端。虚线框表示放大的针尖。比例尺代表 1 mm。 请单击此处查看此图的放大版本。
图5：胚胎显微注射。（A）整套显微注射系统，包含显微镜（中）和电子显微注射器（左）连接到显微操作器（右）。（B）胚胎和显微注射针。（C）胚胎的注射部位用红色箭头标记。比例尺代表200μm.（D）显微镜下孵化的幼虫。比例尺代表 1 mm。 请单击此处查看此图的放大版本。
图6：通过PCR和凝胶电泳检测突变体。 黑色箭头和红线表示sgRNA的目标位点。（A）通道1中的带表示从野生型派生的扩增片段。（B）泳道2和3中的条带代表使用单个sgRNA靶标从突变体衍生的扩增片段。（C）使用一对不重叠的sgRNA检测杂合子。泳道4和5中的条带代表来自两个sgRNA靶标突变的扩增片段。较低的波段表示大片段删除。（D）结果来自纯合子。通道 6 和 7 中的波段表示大片段缺失。请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
CRISPR/Cas9系统的应用为分析基因功能和基因间相互作用提供了有力的技术支持。我们在这里介绍的详细方案证明了通过CRISPR / Cas9基因组编辑在 H. armigera 中产生纯合子突变体。这种可靠的程序为 臂状芽孢杆菌的定向基因诱变提供了一种直接的方法。
CRISPR靶点的选择可能会影响诱变效率37.在该协议中，我们比较并分析了来自在线网站CRISOR的多个结果，以获得合适的目标站点。在计算机技术中，gRNA预测具有一些优势。首先，他们在设计sgRNA时分析 了H. armigera 的整个基因组，以最大限度地减少脱靶效应。上面提到的在线资源，以及CHOPCHOP（http://chopchop.cbu.uib.no/），与许多鳞翅目基因组一起起作用，这可能有利于其他鳞翅目飞蛾的基因编辑。其次，候选sgRNA的排名直接比较了可能性，但可能包括基于不同算法的一些变化。在两个列表中具有高评级的候选序列往往更可靠。然而，该协议的一个主要局限性是网站数据库中没有大量昆虫基因组，因此有可能产生脱靶效应。另一个限制是PAM序列对于sgRNA设计是必要的，这可能导致无法找到合适的靶位点。
用于突变体筛选的组织也是一个关键因素。昆虫的存活率、生命周期和生理功能不应受到影响。在我们探索最佳gDNA提取方法的过程中，尝试从幼虫中提取微血淋巴进行突变体检测，以节省时间并避免交配（未发表的数据）。然而，这种方法在PCR扩增效率和成体存活率方面带来了更多挑战（数据未显示）。此外，Zheng等人38 报道了一种使用外显液或蛹提取gDNA的非破坏性方法。基于这些发现，我们修改并探索了一种使用后腿进行gDNA提取的方法，该方法允许成年飞蛾自然生存和交配，显着提高给定基因型的检测准确性。因此，我们开发了一种新方法，通过从每个成年候选者身上去除一条后腿来提高gDNA提取的成功率。我们进一步证实，该操作不会影响成年飞蛾的存活率和交配频率。此外，我们发现，当与一对gRNA共注射到外显子区域时，凝胶电泳可以很容易地观察到大片段缺失（图6），这简化了筛选时突变体鉴定的过程。
将H. armigera的卵收集在黑布上，这使得在显微注射过程中在显微镜下很容易区分卵子（图5B）。由于鳞翅蛾的繁殖行为常见，如交配，产卵，孵化和eclosion39，40，41，这种收集卵的技术也可以应用于其他鳞翅目蛾。
总之，CRISPR/ Cas9系统已被证明是促进 臂状芽 胞杆菌功能基因组学研究的可靠工具。分步描述使用户能够完成完整的基因编辑过程。
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Disclosures
作者没有任何利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金（31725023，31861133019 GW，31171912 CY）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
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