Summary
Præsenteret her er en protokol over Helicoverpa armigera (Hübner) embryomikroinjektion og knockout mutant identifikation skabt af CRISPR / Cas9 genomredigering. Mutante insekter muliggør yderligere forskning i genfunktion og interaktion mellem forskellige gener in vivo.
Abstract
Bomuldsbollormen, Helicoverpa armigera, er et af de mest destruktive skadedyr i verden. En kombination af molekylær genetik, fysiologi, funktionel genomik og adfærdsstudier har gjort H. armigera til en modelart i Lepidoptera Noctuidae. For at studere in vivo-funktionerne af og interaktionerne mellem forskellige gener er clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/associated protein 9 (Cas9) genomredigeringsteknologi en praktisk og effektiv metode, der anvendes til at udføre funktionelle genomiske undersøgelser. I denne undersøgelse giver vi en trinvis systematisk metode til at fuldføre genknockout i H. armigera ved hjælp af CRISPR/Cas9-systemet. Design og syntese af guide RNA (gRNA) er beskrevet detaljeret. Derefter opsummeres de efterfølgende trin, der består af genspecifikt primerdesign til oprettelse af guide-RNA (gRNA), embryoopsamling, mikroinjektion, insektopdræt og mutantdetektion. Endelig gives fejlfindingsråd og noter for at forbedre effektiviteten af genredigering. Vores metode vil tjene som reference for anvendelsen af CRISPR/Cas9 genomredigering i H. armigera samt andre Lepidopteran møl.
Introduction
Anvendelsen af genomredigeringsteknologi giver et effektivt værktøj til at opnå målgenmutanter i forskellige arter. Fremkomsten af det klyngede system med regelmæssigt indbyrdes mellemrum med korte palindromiske gentagelser (CRISPR)/associeret protein 9 (Cas9) giver en ny metode til at manipulere genomer1. CRISPR/Cas9-systemet består af et guide-RNA (gRNA) og Cas9-endonuklease2,3, mens gRNA'et yderligere kan opdeles i to dele, et målkomplementært CRISPR-RNA (crRNA) og et transaktiverende crRNA (tracrRNA). GRNA'et integreres med Cas9-endonuklease og danner et ribonukleoprotein (RNP). Med gRNA'et kan Cas9-endonuklease ledes til et bestemt sted i genomet via basekomplementering. RuvC- og HNH-domænerne i Cas9 spalter målet for genomet tre baser før den protospacer-tilstødende motivsekvens (PAM) og skaber en dobbeltstrengsbrud (DSB). DNA-spaltningen kan derefter repareres gennem to mekanismer, ikke-homolog endesammenføjning (NHEJ) eller homologistyret reparation (HDR)4. Reparation af DSB introducerer indsættelser eller deletioner som en måde at inaktivere det målrettede gen på, hvilket potentielt kan forårsage et fuldstændigt tab af genfunktion. Derfor gør CRISPR/Cas9-systemets arvelighed og specificitet det til en robust metode til at karakterisere genfunktioner in vivo og analysere geninteraktioner5.
Med mange fordele er CRISPR/Cas9-systemet blevet anvendt på forskellige områder, herunder biomedicin6,7, genterapi8,9 og landbrug10,11,12, og er blevet anvendt til forskellige biologiske systemer, herunder mikroorganismer13, planter14,15, nematoder16 og pattedyr17 . Hos hvirvelløse dyr har mange insektarter været udsat for CRISPR/Cas9-genomredigering, såsom bananfluen Drosophila melanogaster og derover18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera er et af de mest ødelæggende skadedyr på verdensplan23 og beskadiger adskillige afgrøder, herunder bomuld, sojabønner og sorghum24,25. Med udviklingen af sekventeringsteknologi er genomet af H. armigera såvel som for en række Lepidoptera insektarter blevet sekventeret fuldstændigt26,27,28,29. Et stort antal resistens- og olfaktoriske receptorgener er blevet identificeret og karakteriseret fra disse insekter i de senere år19,27,28,29. Nogle resistensrelaterede gener er blevet identificeret i H. armigera, såsom de gener, der koder for cadherin30, en ATP-bindende kassettetransportør31,32 samt HaTSPAN133. Knockout af disse gener ved hjælp af CRISPR/Cas9-teknologi resulterer i en høj grad af resistens over for Bacillus thuringiensis (BT) toksin i modtagelige stammer. Chang et al. (2017) slog også en feromonreceptor ud, som validerede dens signifikante funktion i parringstidsregulering19. Disse rapporter tyder på, at CRISPR/Cas9 kan fungere som et effektivt redskab til at studere genfunktionen in vivo i insektsystemer. En detaljeret procedure for CRISPR/Cas9-modifikation i insektsystemer er dog fortsat ufuldstændig, hvilket begrænser dens anvendelsesområde inden for insektfunktionel genomik.
Her præsenterer vi en protokol til at slå et funktionelt gen ud i H. armigera ved hjælp af CRISPR/Cas9-systemet. En detaljeret trin-for-trin protokol leveres, herunder design og forberedelse af genspecifikke primere til gRNA-produktion, embryoopsamling, mikroinjektion, insektopdræt og mutantidentifikation. Denne protokol tjener som en værdifuld reference til at manipulere eventuelle funktionelle gener i H. armigera og kan udvides til andre Lepidoptera-arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Design af genspecifikke primere og fremstilling af sgRNA
- Bekræft en bevaret genomisk region i genet af interesse gennem PCR-amplifikation og sekventeringsanalyser. Forstærk målgenet fra genom-DNA'et fra H. armigera og skelne mellem exons og introner.
BEMÆRK: Sekvenssspecifikationen for guidestedet er nødvendig for at undgå genredigering uden for målet. Søg mulige guidesteder i exons er tæt på 5 'UTR af genet. Derefter er det vigtigt at sikre, at genet er helt ikke-funktionelt. Et resumé af strømningsvejen til fremstilling af sgRNA er illustreret i figur 1. - Vælg sgRNA-målene. Brug CRISPR's online hjemmeside CRISPOR (Version 4.97) (http://crispor.tefor.net/crispor.py) til at søge efter mulige guidesider i exons tæt på genets 5' UTR. Indtast exon-sekvensen i tekstfeltet, og vælg målgenomet til Helicoverpa armigera (Harm_1.0). Vælg protospacer tilstødende motiv (PAM) mulighed for "20 bp-NGG" og lad de andre indstillinger være på standardparametrene i henhold til brugermanualerne på webstederne.
- Sammenlign de forudsagte guidesekvenser fra softwaren, og vælg den guidesekvens med den højeste forudsagte effektivitet og færrest uoverensstemmelser for at forbedre redigeringseffektiviteten og reducere redigering uden for målet. En 20 bp styresekvens indeholdende et eller to G på 5' UTR anbefales, da det kan øge skæreeffektiviteten.
BEMÆRK: Et par gRNA'er på tværs af exon-regioner anbefales også for at opnå en stor segmentdeletning, hvilket forenkler mutantdetektion i senere trin. Sørg for, at afstanden mellem de to valgte styresekvenser er mindst 100 bp. I denne protokol vælger vi det almindeligt anvendte SpCas9-protein, som genkender NGG-motivet. Ifølge producentens instruktion er styresekvensen, der mangler G, også acceptabel, når du vælger T7-promotoren, fordi promotoren tilføjer et G til 5' UTR i sekvensen. - Design fremadgående og omvendte oligonukleotider. Indstil sekvensrækkefølgen til 5'-20 bp guidesekvens-NGG-3', og suppler omvendt guidesekvensen. Tilføj T7-promotorsekvensen til henholdsvis fremadgående og omvendt strengstyringssekvens i henhold til brugervejledningen til gRNA-syntesesættet.
BEMÆRK: PAM-sekvensen NGG bør udelukkes fra oligonukleotidsekvensen. - Generer sgRNA'et ved hjælp af gRNA-syntesesættet. Denne proces omfatter tre trin: DNA-skabelonsamling, in vitro-transkription og oprensning af sgRNA (figur 2). Udfør hvert trin i overensstemmelse med brugervejledningen.
2. Forberedelse og indsamling af embryoner
- Adskil han- og hunpupper som beskrevet af Hongtao et al.34 og adskil dem i to forskellige netbure. Efter eklosion fodres de ~ 30 ml 10% (w/ v) hvid sukkeropløsning i absorberende bomuld i en petriskål.
BEMÆRK: 3 g hvidt sukker blev opløst i 30 ml sterilt vand til fremstilling af den hvide sukkeropløsning på 10 % (w/v). - Vælg 50 raske individer fra henholdsvis 3 dage gamle hanner og 2 dage gamle hunner, og bland dem i et rent netbur. Anbring et stykke bomuld indeholdende 10% (w/v) sukkeropløsning i buret og hold bomulden fugtig. Dæk netburene med gasbind og fastgør gasbindet med et gummibånd. Sprøjt vand på gasbindet for at holde det fugtigt.
- Tillad udvalgte han- og hunmøl i trin 2 at parre sig fuldstændigt og observer æglægningsmængden.
BEMÆRK: Toppen af oviposition af H. armigera vises efter kl. 9:00 p.m. Derfor bør parringstidspunktet overvejes for at sikre et tilstrækkeligt antal æg i de efterfølgende trin. På toppen af oviposition skal du udskifte gasbindet med en sort klud og aktivere fri oviposition i 30 minutter. Udskift den sorte klud hvert 30. minut for at samle friske æg (figur 3A). - Skær den sorte klud i uregelmæssigt formede pletter med en størrelse på ca. 3 mm. Sørg for flere æg på hvert plaster.
BEMÆRK: Undgå at vælge rynkede æg, da de normalt er ubefrugtede. - Indsæt dobbeltsidet tape på et mikroskopdias (25 mm x 75 mm) (figur 3B). Brug tang til at indsætte pletterne med æg i træk på overfladen af det dobbeltsidede bånd. Tryk på margenen på hvert plaster for at sikre, at de klæber fast til båndet. Saml 50-100 æg pr. Mikroskop dias (figur 3C).
BEMÆRK: Plastrene skal dække den fulde overflade af det dobbeltsidede bånd, ellers vil rugelarven have svært ved at kravle ud. - Før mikroinjektion skal du holde mikroskopet glide på is for at forsinke udviklingen af embryoner.
3. Mikroinjektion af embryoner
- Forbered nålen ved at trække i et kapillærglas ved hjælp af en mikropipettetræk (figur 4A). Indstil heat til 540, træk til 80, Vel til 75, tid til 170 og tryk til 450. Jord nålespidsen ved hjælp af en mikrokværn. Den ideelle nål viser en skarpkantet spids (figur 4B).
- Fremstilling af injektionsopløsninger. Tilsæt 2 μL kommercialiseret Cas9-protein (1 mg/ml) og sgRNA (300-500 ng/μL endelig koncentration) til RNase-frit vand i et PCR-rør for at opnå en 10 μL volumenblanding. Volumenet af sgRNA afhænger af dets koncentration. Bland godt ved pipettering og læg det på is.
BEMÆRK: Alle pipettespidser og PCR-rør, der bruges i dette trin, er RNase-fri. - Indstil parametrene for den elektroniske mikroinjektor. Indstil injektionstrykket (pi) til 1.500 hPa, injektionstiden (ti) til 0,1 s og kompensationstrykket (pc) til 30 hPa.
- Læg 2 μL af blandingen i en nål ved hjælp af en pipettespids til mikrolæsseren. Den resterende luft i spidsen af nålen skal udtømmes så meget som muligt.
- Tilslut injektionsnålen til en mikromanipulator, og sørg for en tæt forbindelse mellem de to dele.
- Læg et dias i en petriskål (100 mm) og læg dem på mikroskopets scene (figur 5A).
- Juster nålespidsens position under et lysmikroskop, indtil både nålespidsen og embryonerne er synlige under mikroskopet (figur 5B).
- Juster dråbens volumen. Tryk på pedalen og observer væskefaldet ved nålespidsen. Juster mikroinjektorens injektionstryk, indtil volumenet af en væskedråbe er ca. en tiendedel af embryonernes volumen.
BEMÆRK: Kvaliteten af injektionsnålen er afgørende for embryonernes overlevelsesrate. - Indsæt forsigtigt nålespidsen i den øverste halvkugle af et embryo i en 45 graders vinkel (figur 5C). Tryk på pedalen for at levere blandingen ind i embryoet. Injektionen fører til en lille udvidelse af embryoet. Træk nålen straks tilbage fra embryoet og flyt petriskålen med den ene hånd, indtil det næste embryo er i nærheden af nålen og injicere det næste embryo med samme procedure.
BEMÆRK: Den cytoplasmatiske udstrømning ved pinhullet er acceptabel. Hvis den cytoplasmatiske lækage er for meget, skal du justere nålens vinkel til en mere alvorlig vinkel, indtil væskeudstrømningen styres. - Indsprøjt mindst 300 embryoner for at sikre en tilstrækkelig rugemængde. Dæk låget på petriskålen/-skålene efter injektionen.
BEMÆRK: Tiden fra oviposition til injektion af de 50-100 embryoner er begrænset til 2 timer. De fleste af embryonerne er stadig på encellestadiet inden for denne tidsramme. Generelt er det nyttigt at gentage ovipositionsproceduren under embryoinjektion for at fremme effektiviteten.
4. Insektopdræt efter injektion
- Formering af G0 embryoner.
- Inkuber embryonerne ved 60% relativ luftfugtighed og 28 ° C i en kunstig klimakasse med 14 timers lys / 10 timer mørkt.
- Kontroller udviklingen af embryoner dagligt efter injektion. Når embryonernes overfladefarve er blevet mørkere, skal du lægge kunstig kost i petriskålen omkring mikroskopdiaset og kontrollere udviklingen af embryoner hver 12. time.
BEMÆRK: Den kunstige kost fremstilles som beskrevet af Wu et al.35 og Jha et al.36. - Forbered 24-brønds kulturplader og fyld hver brønd til en tredjedel af dens volumetriske kapacitet med kunstig kost.
- Vælg rugelarver (figur 5D) ved hjælp af en lille pensel og overfør dem til kulturpladen med 24 brønde. Indsæt en larve pr. Brønd for at sikre, at hver larve har nok mad til at overleve.
BEMÆRK: Larverne af H. armigera blev opdrættet individuelt i hver brønd, da de normalt kannibaliserede hinanden.
- G0 larver opdræt
- Bag larverne under de samme forhold som embryonerne.
- Kontroller de klækkede larver hver dag. Når larver vokser til det tredje instar-stadium, skal du overføre hver larve til en ny glas dactylethrae, der fylder en femtedel af volumenet med kunstig kost.
- Ca. 12 d efter inkubation skal de modne larver begynde at forpuppe sig.
- G0 modne pupper skelnes ud fra køn og placeres i separate bure før eklosion. De samme alderen pupper af vild type fremstilles også.
- G0 voksne opdræt
- Kontroller eklosionen af både vildtype og mutante pupper dagligt.
- Overfør de nyligt lukkede G0-hanvoksne og de voksne af vildtypen til et frisk netbur, og forholdet mellem G0 og vildtype bliver ca. 1:1. Forsyn dem med 10% (w/v) sukkeropløsning faldet i bomuldskugler.
- Bageste insekter ved hjælp af rutinemetoden ovenfor indtil hvalpen af generation et (G1).
- Brug en dactylethrae til at overføre det nyligt lukkede enkelt par G1 voksne til en plastikbeholder (13 cm x 12 cm x 12 cm), der leveres med 10% (w/v) sukkeropløsning. Dæk hver krukke med gasbind. Tag ca. 50 par G1 voksne i alt.
BEMÆRK: Eclosion af kvindelige møller går forud for hanmøller. Generelt er en 3-dages gammel mand og en 2-dages gammel kvinde seksuelt modne og klar til at parre sig. De nyligt lukkede voksne vil ikke parre sig i deres første lysperiode uden fodring. - Saml G1-voksne i en plastikbeholder, når de har lagt æg. Sæt hver voksen møl i et 1,5 ml centrifugerør.
5. Knock-out mutant detektion
- Design et par primere, der spænder over det forudsagte afkortede sted. Primerne skal indstilles mindst 50 bp afstand på hver side (opstrøms og nedstrøms) fra målstedet.
BEMÆRK: Primerne til identifikation af målsekvensen dækker ofte store spændvidder for at forstærke effektivt. - PCR-reaktionen udføres ved hjælp af genotypningsprimere med genom-DNA ekstraheret i afsnit 1. Udfør PCR-cykling ved 95 °C i 20 s; 35 cyklusser på 95 °C i 20 s, 55 °C i 20 s, 72 °C i 1 min. 72 °C i 5 minutter og 4 °C i venteposition. Reaktionsproduktet verificeres via 1% (w/v) agarosegel. Det valgte par detektionsprimere blev bekræftet af PCR-produktets kvalitet. Hvis båndene er tydelige og specifikke, kan primerne bruges til yderligere mutantdetektion baseret på ampliconstørrelse.
- Skærm for potentielle redigerede personer. Fjern et bagben forsigtigt ved hjælp af tang og læg hvert ben i henholdsvis et lysningsmatrixrør. Mærk lysermatrixrøret i overensstemmelse med nummeret på glasdektylethraen.
- Homogeniser bagbenet ved hjælp af en vævshomogenisator. Indstil hastigheden til 6,0 m/s og tiden til 60 s. Uddrag det genomiske DNA fra den homogeniserede prøve ved hjælp af et kommercielt gDNA-ekstraktionssæt i henhold til producentens anvisninger.
- Forstærk gensegmentet ved hjælp af genoypingprimere med de samme PCR-reaktionsbetingelser som beskrevet i trin 2. Bekræft genotypen ved hjælp af en gensekventeringstjeneste. Når G1-mutante genotyper (målret mod det samme sted) indeholdt i den samme krukke blev detekteret, skal du beholde G1-afkommet og omdøbe det til generation to (G2).
- Sæt G1-individer af samme genotype i et netbur. Selvkryds G1-afkom og fortsæt med at screene ved hjælp af de samme metoder.
- Forstærk gensegmentet og bekræft genotypen med samme procedure som beskrevet i trin 2. Opnå G2 homozygote linjer og opretholde knock-out mutantlinjen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol indeholder detaljerede trin til opnåelse af genudstømningslinjer af H. armigera ved hjælp af CRISPR / Cas9-teknologi. De repræsentative resultater opnået ved denne protokol er opsummeret for gDNA-udvælgelse, embryoopsamling og injektion, insektopdræt og mutantdetektion.
I denne undersøgelse var målstedet for vores gen af interesse placeret i dets anden exon (figur 2A). Dette sted blev stærkt bevaret, og målbåndsfragmentet af syntetiseret sgRNA blev bekræftet ved anvendelse af agarosegelelektroforese (figur 2B, C, D).
Han- og hunmøllerne blev oprindeligt opdrættet i separate netbure for at forhindre parring forud for tidsplanen og for at sikre en tilstrækkelig mængde embryoner så meget som muligt. Generelt blev et samlet antal på 300 befrugtede æg indsamlet og blev straks injiceret med sgRNA / Cas9-proteinblandingen (300-500 ng / μL sgRNA, 200 ng / μL Cas9-protein) på encellestadiet. Injektionsvolumenet var omkring en tiendedel af embryonernes. Efter mikroinjektion blev embryonerne opdrættet som beskrevet i afsnit 4, og 40-60 % af de injicerede embryoner overlevede.
Den mutante påvisning af et enkelt sgRNA-mål blev udført ved sekventering af PCR-produkterne fra G1-forældrevoksne (figur 6B). Vi testede også effektiviteten af at bruge ikke-overlappende sgRNA-par på tværs af forskellige exons. Den store deletion af mutanterne (figur 6C,D) kan let skelnes fra vildtypebånd (figur 6A).
Mutationshastigheden beregnet i denne protokol var 87,50%, når 16 individer testes tilfældigt, hvilket indikerer, at denne protokol var yderst effektiv. Genknockout-resultater blev vist i flere genotyper, men størstedelen af de mutanter, der blev identificeret fra vores screening, var -2 bp type. Mutationer resulterede i for tidlig afslutning af proteintranslation i genomet, hvilket efterfølgende førte til tab af genfunktion.
Figur 1: Flowdiagrammet til fremstilling af sgRNA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Udvælgelse og syntese af mål sgRNA'er fra H. armigera. (A) Det gule domæne repræsenterer exonen, mens den sorte linje repræsenterer intronen. De røde sekvenser angiver målsekvensen, og de blå sekvenser angiver protospacer-tilstødende motiv (PAM). B) PCR-samling af sgRNA-DNA-skabelonen. (C) In vitro-transkriptionsproduktet. (D) Oprensning af sgRNA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Embryoopsamling. (A) Et netbur dækket af sort klud. De mandlige og kvindelige møller af H. armigera parrede sig. (B) Mikroskopet glider uden embryoner. (C) Mikroskopet dias indeholdende 50-100 embryoner på stykker af sort klud. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Nåleforberedelse. (A) Mikropipettetræk. (B) Spidsen af en mikroinjektionsnål efter at have trukket af en mikropipettetrækler. Den prikkede boks angiver den forstørrede nålespids. Skalabjælken repræsenterer 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Embryomikroinjektioner. (A) Hele sættet af et mikroinjektionssystem, der indeholder et mikroskop (midten) og en elektronisk mikroinjektor (venstre), der er forbundet med en mikromanipulator (højre). B) Embryoner og mikroinjektionsnål. (C) Embryonets injektionssted er mærket med den røde pil. Skalastang repræsenterer 200 μm. (D) En udklækket larve under mikroskopet. Skalabjælken repræsenterer 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Påvisning af mutanter ved PCR- og gelelektroforese. De sorte pile og røde linjer angiver sgRNA'ets målsteder. (A) Båndet i bane 1 repræsenterer forstærkningsfragmentet afledt af vildtype. (B) Båndene i bane 2 og 3 repræsenterer amplifikationsfragmentet afledt af mutant ved hjælp af et enkelt sgRNA-mål. (C) Påvisning af en heterozygot ved anvendelse af et par ikke-overlappende sgRNA. Båndene i bane 4 og 5 repræsenterer amplifikationsfragmentet afledt af mutationen af to sgRNA-mål. De nederste bånd angiver en stor fragmentsletning. (D) Resultaterne er afledt af en homozygot. Båndene i bane 6 og 7 angiver den store fragmentsletning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anvendelsen af CRISPR/Cas9-systemet har givet kraftig teknisk støtte til analyse af genfunktion og interaktion mellem forskellige gener. Den detaljerede protokol, vi præsenterer her, viser dannelsen af en homozygot mutant i H. armigera via CRISPR /Cas9 genomredigering. Denne pålidelige procedure giver en ligetil måde for rettet genmutagenese i H. armigera.
Valget af CRISPR-målsteder kan påvirke mutageneseeffektiviteten37. I denne protokol sammenlignede og analyserede vi flere resultater fra onlinewebstedet CRISPOR for at få et passende målsted. I silico giver gRNA-forudsigelser nogle fordele. For det første analyserer de hele genomet af H. armigera, når de designer sgRNA'er for at minimere off-target-effekterne. De ovennævnte onlineressourcer samt CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) fungerer med en række Lepidoptera-genomer, hvilket kan være gavnligt for genredigering i andre Lepidopteran-møl. For det andet sammenligner rangordningen af kandidat-sgRNA'erne direkte mulighederne, men kan omfatte nogle variationer baseret på de forskellige algoritmer. Kandidatrækkefølgen med høje bedømmelser på begge lister har tendens til at være mere pålidelig. En væsentlig begrænsning af denne protokol er imidlertid, at et stort antal insektgenomer er fraværende i hjemmesidernes databaser, så der er potentiale for off-target effekter. En anden begrænsning er, at PAM-sekvensen er nødvendig for sgRNA-designet, hvilket kan resultere i manglende evne til at finde et passende målsted.
Vævene, der anvendes til mutant screening, er også en afgørende faktor. Insekternes overlevelsesrate, livscyklus og fysiologiske funktioner bør ikke påvirkes. I vores proces med at udforske den optimale gDNA-ekstraktionsmetode blev mikrohæmolymfeekstraktionen fra larver forsøgt til mutantdetektion for at spare tid og undgå parring (upublicerede data). Denne metode medførte imidlertid flere udfordringer med hensyn til effektiviteten af PCR-forstærkning og overlevelsesraten for voksne (data ikke vist). Derudover rapporterede Zheng et al.38 en ikke-destruktiv metode til gDNA-ekstraktion ved hjælp af eksuviatet eller puparia. Baseret på disse resultater ændrede og udforskede vi en tilgang ved hjælp af bagben til gDNA-ekstraktion, som gør det muligt for voksne møl at overleve og parre sig naturligt, hvilket forbedrer detektionsnøjagtigheden af en given genotype betydeligt. Derfor udviklede vi en ny metode til at øge succesraten for gDNA-ekstraktion ved at fjerne et af bagbenene fra hver voksen kandidat. Vi bekræftede endvidere, at denne operation ikke påvirkede overlevelsesraten og parringsfrekvensen for voksne møl. Desuden konstaterede vi, at den store fragmentdeletning let kan observeres ved gelelektroforesen, når den injiceres sammen med et par gRNA'er på tværs af exon-regioner (figur 6), hvilket forenkler processen med mutantidentifikation ved screening.
Æggene fra H. armigera opsamles på en sort klud, hvilket gør det nemt at skelne æggene under mikroskopet i mikroinjektionsprocessen (figur 5B). På grund af den almindelige reproduktive adfærd hos Lepidopteran møller såsom parring, oviposition, ruge og eclosion39,40,41, kunne denne ægopsamlingsteknik også anvendes til andre Lepidopteran møller.
Afslutningsvis har CRISPR/Cas9-systemet vist sig at være et pålideligt værktøj til at lette funktionelle genomstudier i H. armigera. De trinvise beskrivelser giver brugerne mulighed for at gennemføre en integreret genredigeringsproces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (31725023, 31861133019 til GW og 31171912 til CY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
References
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR. Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).
- Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. CRISPR editing in biological and biomedical investigation. Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).
- Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model. DNA Repair. 46, 1-8 (2016).
- Wu, J., et al. Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).
- Jiao, R., Gao, C. The CRISPR/Cas9 genome editing revolution. Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).
- Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems. World Patent Information. 60, 101944 (2020).
- Es, I., et al. The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges. Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).
- Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes. Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).
- Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -G. CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications. Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).
- Pandey, P. K., et al. Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research. Seminars in Cell & Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
- Mojica, F. J., Montoliu, L. On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals. Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Koutroumpa, F., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).
- Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).
- Fitt, G. P. The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems. Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).
- Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (Hübner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management. Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).
- Ai, D., et al. Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera Hübner (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).
- Wan, F., et al. A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Cheng, T., et al. Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest. Nature Ecology & Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).
- Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore. Science Reports. 6, 23666 (2016).
- Gouin, A., et al. Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Wang, J., et al. Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).
- Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins. Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).
- Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm. PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).
- Jin, L., et al. Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).
- Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision. Tobacco Sciene & Technology. 53 (2), 21-26 (2019).
- Wu, K., Gong, P. A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm. Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).
- Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics. Environmental Entomology. (1), 30 (2012).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).
- Zheng, M. -Y., et al. A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia. Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).
- Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae). Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).
- Kamimura, M., Tatsuki, S. Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).
- Edwards, K. D. Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE). Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).
