Summary
Presentert her er en protokoll av Helicoverpa armigera (Hübner) embryo mikroinjeksjon og knockout mutant identifikasjon opprettet av CRISPR / Cas9 genom redigering. Mutante insekter muliggjør videre forskning på genfunksjon og interaksjon mellom ulike gener in vivo.
Abstract
Bomullsbollworm, Helicoverpa armigera, er en av de mest destruktive i verden. En kombinasjon av molekylær genetikk, fysiologi, funksjonell genomikk og atferdsstudier har gjort H. armigera til en modellart i Lepidoptera Noctuidae. For å studere in vivo-funksjonene til og interaksjoner mellom forskjellige gener, er gruppert regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR)/ assosiert protein 9 (Cas9) genomredigeringsteknologi en praktisk og effektiv metode som brukes til å utføre funksjonelle genomiske studier. I denne studien tilbyr vi en trinnvis systematisk metode for å fullføre gen knockout i H. armigera ved hjelp av CRISPR / Cas9-systemet. Design og syntese av guide RNA (gRNA) er beskrevet i detalj. Deretter oppsummeres de påfølgende trinnene som består av genspesifikk primerdesign for RNA (gRNA) opprettelse, embryosamling, mikroinjeksjon, insektoppdrett og mutantdeteksjon. Til slutt gis feilsøkingsråd og notater for å forbedre effektiviteten av genredigering. Vår metode vil fungere som en referanse for anvendelsen av CRISPR / Cas9 genomredigering i H. armigera samt andre Lepidopteran møll.
Introduction
Anvendelsen av genomredigeringsteknologi gir et effektivt verktøy for å oppnå målgenmutanter i forskjellige arter. Fremveksten av det klyngede regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) / assosiert protein 9 (Cas9) systemet gir en ny metode for å manipulere genomer1. CRISPR/Cas9-systemet består av en guide RNA (gRNA) og Cas9 endonuclease2,3, mens gRNA kan videre deles inn i to deler, et mål komplementær CRISPR RNA (crRNA) og en transaktiverende crRNA (tracrRNA). GRNA integreres med Cas9 endonuclease og danner et ribonukleoprotein (RNP). Med gRNA kan Cas9 endonuclease rettes til et bestemt sted for genomet via base komplementering. RuvC- og HNH-domenene til Cas9 cleave målstedet til genomet tre baser før protospacer-tilstøtende motiv (PAM) sekvens og skape en dobbel-strand pause (DSB). DNA-spaltingen kan deretter repareres gjennom to mekanismer, ikke-homolog ende sammenføyning (NHEJ) eller homologi-rettet reparasjon (HDR)4. Reparasjon av DSB introduserer innsettinger eller slettinger som en måte å inaktivere det målrettede genet på, noe som potensielt kan føre til et fullstendig tap av genfunksjon. Derfor gjør den arvelige og spesifisiteten til CRISPR/Cas9-systemet det til en robust metode for å karakterisere genfunksjoner in vivo og analysere geninteraksjoner5.
Med mange fordeler har CRISPR/Cas9-systemet blitt brukt på ulike felt, inkludert biomedisin6,7, genterapi8,9 og landbruk10,11,12, og har blitt brukt til ulike biologiske systemer, inkludert mikroorganismer13, planter14,15, nematoder16 og pattedyr17 . I hvirvelløse dyr har mange insektarter blitt utsatt for CRISPR / Cas9 genomredigering, for eksempel fruktfluen Drosophila melanogaster og utover 18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera er en av de mest destruktive over hele verden23, og skader mange avlinger, inkludert bomull, soyabønner og sorghum24,25. Med utviklingen av sekvenseringsteknologi har genomet til H. armigera, så vel som for en rekke Lepidoptera insektarter, blitt sekvensert helt26,27,28,29. Et stort antall resistens- og olfaktoriske reseptorgener har blitt identifisert og karakterisert fra disse insektene de siste årene19,27,28,29. Noen resistensrelaterte gener er identifisert i H. armigera, for eksempel genkoding for kadherin30, en ATP-bindende kassetttransportør31,32, samt HaTSPAN133. Knockout av disse genene ved hjelp av CRISPR/ Cas9-teknologi resulterer i et høyt nivå av motstand mot Bacillus thuringiensis (BT) toksin i mottakelige stammer. Chang et al. (2017) slo også ut en feromonreseptor, som validerte sin betydelige funksjon i parringstidsregulering19. Disse rapportene tyder på at CRISPR/Cas9 kan fungere som et effektivt verktøy for å studere genfunksjon in vivo i insektsystemer. Imidlertid forblir en detaljert prosedyre for CRISPR / Cas9-modifikasjon i insektsystemer ufullstendig, noe som begrenser bruksområdet i insektfunksjonell genomikk.
Her presenterer vi en protokoll for å slå ut et funksjonelt gen i H. armigera ved hjelp av CRISPR / Cas9-systemet. En detaljert trinnvis protokoll er gitt, inkludert design og forberedelse av genspesifikke primere for gRNA-produksjon, embryosamling, mikroinjeksjon, insektoppdrett og mutantidentifikasjon. Denne protokollen fungerer som en verdifull referanse for å manipulere eventuelle funksjonelle gener i H. armigera og kan utvides til andre Lepidoptera-arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Design av genspesifikke primere og fremstilling av sgRNA
- Verifiser en bevart genomisk region i genet av interesse gjennom PCR-forsterknings- og sekvenseringsanalyser. Forsterk målgenet fra genom-DNA-et til H. armigera og skille eksoner og introner.
MERK: Sekvensspesifikkiteten til guidesiden er nødvendig for å unngå ekstern genredigering. Søk mulige guidesider i exons er nær 5 ' UTR av genet. Deretter er det viktig å sørge for at genet er helt ikke-fungerende. Et sammendrag av strømningsbanen for fremstilling av sgRNA er illustrert i figur 1. - Velg sgRNA-målene. Bruk CRISPRs nettsted CRISPOR (versjon 4.97) (http://crispor.tefor.net/crispor.py) for å søke etter mulige guidesider i eksonene nær 5' UTR av genet. Skriv inn eksonsekvensen i tekstboksen og velg målgenomet til Helicoverpa armigera (Harm_1.0). Velg protospacer tilstøtende motiv (PAM) alternativet "20 bp-NGG" og la de andre innstillingene være på standardparametrene i henhold til brukerhåndbøkene til nettstedene.
- Sammenlign de predikerte guidesekvensene fra programvaren og velg guidesekvensen med den høyeste predikerte effektiviteten og færrest uoverensstemmelser for å forbedre redigeringseffektiviteten og redusere off-target redigering. En 20 bp føringssekvens som inneholder en eller to G på 5' UTR anbefales, da det kan øke skjæreeffektiviteten.
MERK: Et par gRNAer på tvers av exon-regioner anbefales også for å få en stor sletting av segmentet, noe som forenkler mutantdeteksjon i senere trinn. Kontroller at avstanden mellom de to valgte støttelinjesekvensene er minst 100 bp. I denne protokollen velger vi det ofte brukte SpCas9-proteinet, som gjenkjenner NGG-motivet. I henhold til produsentens instruksjon er guidesekvensen som mangler G også akseptabel når du velger T7-promotoren fordi promotoren legger til en G til 5' UTR av sekvensen. - Design fremover og omvendt oligonukleotider. Sett sekvensrekkefølgen til 5'-20 bp guide sequence-NGG-3' og omvendt utfylle guidesekvensen. Legg T7-promotorsekvensen til den fremre og omvendte trådføringssekvensen, henholdsvis i henhold til brukerhåndboken til gRNA-syntesesettet.
MERK: PAM-sekvensen NGG bør utelukkes fra oligonukleotidsekvensen. - Generer sgRNA ved hjelp av gRNA-syntesesettet. Denne prosessen inkluderer tre trinn: DNA-malmontering, in vitro-transkripsjon og rensing av sgRNA (figur 2). Utfør hvert trinn i samsvar med bruksanvisningen.
2. Embryoforberedelse og innsamling
- Skill mannlige og kvinnelige pupper som beskrevet av Hongtao et al.34 og segreger dem i to forskjellige nettobur. Etter eklosjon, mate dem ~ 30 ml av 10% (w / v) hvitt sukkeroppløsning i absorberende bomull i en Petri-tallerken.
MERK: 3 g hvitt sukker ble oppløst i 30 ml sterilt vann for å forberede den 10% (m / v) hvite sukkeroppløsningen. - Velg 50 friske individer fra henholdsvis 3-dagers gamle menn og 2-dagers kvinner, og bland dem i et rent nettbur. Legg et stykke bomull som inneholder 10% (w / v) sukkeroppløsning i buret og hold bomullen fuktig. Dekk nettburene med gasbind og fest gasbindet med et gummibånd. Spray vann på gasbindet for å holde fuktighet.
- La utvalgte mannlige og kvinnelige møll i trinn 2 mate helt og observere eggleggingsmengden.
MERK: Toppen av oviposisjon av H. armigera vises etter 9:00 p.m. Derfor bør parringstidspunktet vurderes for å sikre et tilstrekkelig antall egg i de påfølgende trinnene. På toppen av oviposisjon, erstatt gasbindet med en svart klut og aktiver fri oviposisjon i 30 minutter. Skift ut den svarte kluten hver 30. - Skjær den svarte kluten i uregelmessig formede flekker med en størrelse på 3 mm ca. Sørg for flere egg på hver patch.
MERK: Unngå å velge rynkete egg, da de vanligvis er unfertilized. - Lim inn dobbeltsidig tape på et mikroskop (25 mm x 75 mm) (figur 3B). Bruk tang, lim med egg på rad på overflaten av det dobbeltsidige båndet. Trykk på margen på hver patch for å sikre at de fester seg godt til båndet. Samle 50-100 egg per mikroskopsklie (figur 3C).
MERK: Flekkene må dekke hele overflaten av det dobbeltsidige båndet, ellers vil klekkelarvalen ha problemer med å krype ut. - Før mikroinjeksjon, hold mikroskopet glidende på is for å forsinke utviklingen av embryoer.
3. Mikroinjeksjon av embryoer
- Forbered nålen ved å trekke i et kapillærglass ved hjelp av en mikropipettetrekker (figur 4A). Sett Varme til 540, Trekk til 80, Vel til 75, Tid til 170 og Trykk til 450. Jord nålespissen med en mikrokvern. Den ideelle nålen viser en spiss med skarpe kanter (figur 4B).
- Tilberedning av injeksjonsløsninger. Tilsett 2 μL kommersialisert Cas9-protein (1 mg/ml) og sgRNA (300-500 ng/μL sluttkonsentrasjon) til RNasefritt vann i et PCR-rør for å oppnå en 10 μL volumblanding. Volumet av sgRNA avhenger av konsentrasjonen. Bland godt ved pipettering og legg det på is.
MERK: Alle pipettespissene og PCR-rørene som brukes i dette trinnet er RNase-frie. - Angi parametrene til den elektroniske mikroinjektoren. Sett injeksjonstrykket (pi) på 1500 hPa, injeksjonstiden (ti) til 0,1 s, og kompensasjonstrykket (pc) til 30 hPa.
- Legg 2 μL av blandingen i en nål ved hjelp av en mikrolasterpipettespiss. Restluften i spissen av nålen skal være utmattet så mye som mulig.
- Koble injeksjonsnålen til en mikromanipulator og sørg for en tett forbindelse mellom de to delene.
- Legg en sklie i en Petri-tallerken (100 mm) og legg dem på scenen på mikroskopet (figur 5A).
- Juster nålespissens posisjon under et lysmikroskop til både nålespissen og embryoene er synlige under mikroskopet (figur 5B).
- Juster volumet på dråpen. Trykk på pedalen og følg væskedråpen på nålespissen. Juster injeksjonstrykket til mikroinjektoren til volumet av et væskefall er omtrent en tiendedel av volumet av embryoene.
MERK: Kvaliteten på injeksjonsnålen er avgjørende for overlevelsesraten for embryoer. - Sett nålespissen forsiktig inn i den øverste halvkule av et embryo i en 45-graders vinkel (figur 5C). Trykk på pedalen for å levere blandingen inn i embryoet. Injeksjonen fører til en liten utvidelse av embryoet. Trekk nålen umiddelbart tilbake fra embryoet og flytt Petri-parabolen med den ene hånden til neste embryo er i nærheten av nålen og injiser neste embryo med samme prosedyre.
MERK: Den cytoplasmatiske utstrømningen ved hullhullet er akseptabelt. Hvis den cytoplasmatiske lekkasjen er for mye, juster nålens vinkel til en mer alvorlig vinkel til væskeutløpet styres. - Injiser minst 300 embryoer for å sikre tilstrekkelig klekkemengde. Dekk lokket på Petri-retten(e) etter injeksjon.
MERK: Tiden fra oviposisjon til injeksjon av 50-100 embryoer er begrenset til 2 timer. De fleste embryoene er fortsatt på encellet stadium innen denne tidsrammen. Generelt er det nyttig å gjenta oviposisjonsprosedyren under embryoinjeksjon for å fremme effektivitet.
4. Insektoppdrett etter injeksjon
- Forplantning av G0 embryoer.
- Inkuber embryoene ved 60 % relativ fuktighet og 28 °C i en kunstig klimaboks med 14 timers lys/10 timer mørk.
- Kontroller utviklingen av embryoer daglig etter injeksjon. Når overflatefargen på embryoer har mørknet, legg kunstig diett i Petri-parabolen rundt mikroskopet, og kontroller utviklingen av embryoer hver 12.
MERK: Det kunstige kostholdet fremstilles som beskrevet av Wu et al.35 og Jha et al.36. - Forbered 24-brønns kulturplater og fyll hver brønn til en tredjedel av sin volumetriske kapasitet med kunstig kosthold.
- Plukk ut klekkelarver (figur 5D) ved hjelp av en liten pensel og overfør dem til 24-brønns kulturplaten. Sett inn en larve per brønn for å sikre at hver larve har nok mat til å overleve.
MERK: Larvene til H. armigera ble oppdrettet individuelt i hver brønn siden de vanligvis kannibaliserte hverandre.
- G0 larver oppdrett
- Bak larver under samme forhold som embryoene.
- Sjekk de klekkede larver hver dag. Når larver vokser til den tredje instar-fasen, overfør hver larve til en ny glassdette, og fyll en femtedel av volumet med kunstig kosthold.
- Omtrent 12 d etter inkubasjon skal de modne larver begynne å pupere.
- G0 modne pupper utmerker seg basert på sex og plasseres i separate bur før eklosjon. Den samme alderen pupper av vill type er også tilberedt.
- G0 voksne oppdrett
- Sjekk eklosjonen av både vill type og mutant pupper daglig.
- Overfør de nylig eclosed G0 mannlige voksne og vill type kvinnelige voksne til et friskt nettobur og gjør forholdet mellom G0 og vill type på ca 1:1. Gi dem 10% (w / v) sukkeroppløsning falt i bomullskuler.
- Bakinsekter ved hjelp av rutinemetoden ovenfor til pupering av generasjon en (G1).
- Bruk en dactylethrae, overfør det nylig lukkede enkeltparet G1 voksne til en plastburk (13 cm x 12 cm x 12 cm) som leveres med 10% (w / v) sukkeroppløsning. Dekk hver krukke med gasbind. Ta ca 50 par G1 voksne totalt.
MERK: Eclosjon av kvinnelige møll predate at av mannlige møll. Generelt er en 3-dagers mann og en 2-dagers kvinne seksuelt moden og klar til å mate. De nylig lukkede voksne vil ikke parre seg i sin første lysperiode uten fôring. - Samle G1 voksne i en plastburk etter at de har lagt egg. Sett hver voksen møll i et 1,5 ml sentrifugerør.
5. Knock-out mutant deteksjon
- Design et par primere som spenner over det anslåtte avkortede nettstedet. Primerne bør settes minst 50 bp avstand på hver side (oppstrøms og nedstrøms) fra målområdet.
MERK: Primerne for identifisering av målsekvensen dekker ofte store spenn for å forsterke effektivt. - Utfør PCR-reaksjonen ved hjelp av genotypingprimerne med genom-DNA ekstrahert i avsnitt 1. Utfør PCR-sykling ved 95 °C i 20 s; 35 sykluser på 95 °C i 20 s, 55 °C i 20 s, 72 °C i 1 min; 72 °C i 5 minutter og 4 °C på vent. Kontroller reaksjonsproduktet via 1 % (w/v) agarosegel. Det valgte paret av deteksjonsprimere ble bekreftet av kvaliteten på PCR-produktet. Hvis båndene er tydelige og spesifikke, kan primerne brukes til ytterligere mutantdeteksjon basert på amlikonstørrelse.
- Skjerm for potensielle redigerte personer. Fjern et bakben forsiktig ved hjelp av tang og legg hvert ben i henholdsvis et lysingsmatriserør. Merk lysingsmatriserøret i samsvar med nummeret på glassdrylethraen.
- Homogeniser bakbenet ved hjelp av en vev homogenisator. Still inn hastigheten til 6,0 m/s og tiden til 60 s. Trekk ut det genomiske DNA-et til den homogeniserte prøven ved hjelp av et kommersielt gDNA-ekstraksjonssett i henhold til produsentens instruksjoner.
- Forsterk gensegmentet ved hjelp av genotypingprimere med de samme PCR-reaksjonsforholdene som beskrevet i trinn 2. Bekreft genotypen ved hjelp av en gensekvenseringstjeneste. Når G1 mutant genotyper (mål samme sted) inneholdt i samme krukke ble oppdaget, hold G1 avkom og gi den nytt navn som generasjon to (G2).
- Sett G1 individer av samme genotype i ett nettobur. Kryss G1-avkomene selv og fortsett å screene ved hjelp av de samme metodene.
- Forsterk gensegmentet og bekreft genotypen med samme prosedyre som beskrevet i trinn 2. Få G2 homozygote linjer og opprettholde knock-out mutant linje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen gir detaljerte trinn for å skaffe genutslagslinjer av H. armigera ved hjelp av CRISPR / Cas9-teknologi. De representative resultatene oppnådd av denne protokollen er oppsummert for gDNA-utvalg, embryosamling og injeksjon, insektoppdrett og mutantdeteksjon.
I denne studien var målstedet for vårt gen av interesse lokalisert i sin andre exon (figur 2A). Dette nettstedet var svært konservert, og målbåndfragmentet av syntetisert sgRNA ble bekreftet ved hjelp av agarose gelelektroforese (figur 2B, C, D).
De mannlige og kvinnelige møllene ble i utgangspunktet oppdrettet i separate notmerder for å forhindre parring før tidsplanen og for å sikre tilstrekkelig mengde embryoer så mye som mulig. Generelt ble et totalt antall 300 befruktede egg samlet inn og ble umiddelbart injisert med sgRNA / Cas9 proteinblanding (300-500 ng / μL sgRNA, 200 ng / μL cas9 protein) i encellet stadium. Injeksjonsvolumet var omtrent en tiendedel av embryoene. Etter mikroinjeksjon ble embryoene oppdrettet som beskrevet i avsnitt 4, og 40% -60% av injiserte embryoer overlevde.
Mutantdeteksjonen av et enkelt sgRNA-mål ble utført ved å sekvensere PCR-produktene fra G1 foreldre voksne (figur 6B). Vi testet også effektiviteten ved å bruke ikke-overlappende sgRNA-par på tvers av forskjellige exons. Den store slettingen av mutantene (figur 6C, D) kan lett skilles fra ville typebånd (figur 6A).
Mutasjonsraten beregnet i denne protokollen var 87,50% når 16 personer ble tilfeldig testet, noe som indikerer at denne protokollen var svært effektiv. Gen knockout resultater ble vist i flere genotyper, men flertallet av mutanter identifisert fra vår screening var -2 bp type. Mutasjoner resulterte i for tidlig avslutning av proteinoversettelse i genomet, noe som senere førte til tap av genfunksjon.
Figur 1: Flytskjemaet for utarbeidelse av sgRNA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Utvelgelse og syntese av mål-sgRNAer fra H. armigera. (A) Det gule domenet representerer eksonen, mens den svarte linjen representerer intronet. De røde sekvensene angir målsekvensen, og de blå sekvensene angir protospacer tilstøtende motiv (PAM). (B) PCR-montering av sgRNA DNA-malen. (C) In vitro transkripsjonsproduktet. (D) Rensing av sgRNA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Embryooppsamling. (A) Et notbur dekket med svart klut. De mannlige og kvinnelige møllene i H. armigera parret seg. (B) Mikroskopet glir uten embryoer. (C) Mikroskopet som inneholder 50-100 embryoer på biter av svart klut. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Nåleforberedelse. (A) Mikropipettetrekker. (B) Spissen av en mikroinjeksjonsnål etter at du har trukket i en mikropipettetrekker. Den stiplede boksen angir den forstørrede nålespissen. Skalalinjen representerer 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Embryomikroinjeksjoner. (A) Hele settet med et mikroinjeksjonssystem som inneholder et mikroskop (i midten) og en elektronisk mikroinjektor (venstre) koblet til en mikromanipulator (høyre). (B) Embryoer og mikroinjeksjonsnål. (C) Embryoets injeksjonssted er merket med den røde pilen. Skala bar representerer 200 μm. (D) En klekket larve under mikroskopet. Skalalinjen representerer 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Påvisning av mutanter ved PCR og gelelektroforese. De svarte pilene og de røde linjene angir målområdene for sgRNA. (A) Båndet i bane 1 representerer forsterkningsfragmentet avledet fra vill type. (B) Båndene i bane 2 og 3 representerer forsterkningsfragmentet avledet fra mutant ved hjelp av et enkelt sgRNA-mål. (C) Påvisning av en heterozygot ved hjelp av et par ikke-overlappende sgRNA. Båndene i bane 4 og 5 representerer forsterkningsfragmentet avledet fra mutasjonen av to sgRNA-mål. De nedre båndene angir en stor fragmentsletting. (D) Resultatene er avledet fra en homozygot. Båndene i bane 6 og 7 indikerer den store fragmentslettingen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anvendelsen av CRISPR/Cas9-systemet har gitt kraftig teknisk støtte til analyse av genfunksjon og interaksjon mellom ulike gener. Den detaljerte protokollen vi presenterer her demonstrerer genereringen av en homozygot mutant i H. armigera via CRISPR / Cas9 genomredigering. Denne pålitelige prosedyren gir en enkel måte for rettet genmutagenese i H. armigera.
Valget av CRISPR-målsider kan påvirke mutageneseeffektiviteten37. I denne protokollen sammenlignet og analyserte vi flere resultater fra nettstedet CRISPOR for å få et passende målnettsted. I silico gir gRNA spådommer noen fordeler. For det første analyserer de hele genomet til H. armigera når de designer sgRNAer for å minimere off-target effektene. De elektroniske ressursene nevnt ovenfor, samt CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/), fungerer med en rekke Lepidoptera-genomer, noe som kan være gunstig for genredigering i andre Lepidopteran møll. For det andre sammenligner rangeringen av kandidatens sgRNAer direkte muligheter, men kan inkludere noen variasjoner basert på de forskjellige algoritmene. Kandidatsekvensen med høye karakterer i begge listene har en tendens til å være mer pålitelig. En stor begrensning av denne protokollen er imidlertid at et stort antall insektgenomer er fraværende i databasene til nettstedene, så det er potensial for off-target effekter. En annen begrensning er at PAM-sekvensen er nødvendig for sgRNA-designen, noe som kan føre til manglende evne til å finne et passende målsted.
Vevet som brukes til mutantscreening er også en avgjørende faktor. Overlevelsesraten, livssyklusen og fysiologiske funksjoner av insekter bør ikke påvirkes. I vår prosess med å utforske den optimale gDNA-ekstraksjonsmetoden ble mikro-hemolymfutvinning fra larver forsøkt for mutantdeteksjon for å spare tid og unngå parring (upubliserte data). Denne metoden ga imidlertid flere utfordringer med hensyn til effektiviteten av PCR-forsterkning og overlevelsesraten for voksne (data ikke vist). I tillegg rapporterte Zheng et al.38 en ikke-destruktiv metode for gDNA-ekstraksjon ved hjelp av eksuviate eller puparia. Basert på disse funnene modifiserte og utforsket vi en tilnærming ved hjelp av bakben for gDNA-ekstraksjon, noe som gjør at voksne møll kan overleve og mate naturlig, noe som forbedrer deteksjonsnøyaktigheten til en gitt genotype betydelig. Derfor utviklet vi en ny metode for å øke suksessraten for gDNA-ekstraksjon ved å fjerne et av bakbenene fra hver voksen kandidat. Vi bekreftet videre at denne operasjonen ikke påvirket overlevelsesraten og parringsfrekvensen til voksne møll. Videre fant vi ut at den store fragmentslettingen lett kan observeres av gelelektroforesen når den injiseres sammen med et par gRNAer på tvers av eksonregioner (figur 6), noe som forenkler prosessen med mutantidentifikasjon ved screening.
Eggene i H. armigera samles på en svart klut, noe som gjør det enkelt å skille eggene under mikroskopet i ferd med mikroinjeksjon (figur 5B). På grunn av den vanlige reproduktive oppførselen til Lepidopteran møll som parring, oviposisjon, klekking og eclosjon39,40,41, kan denne eggoppsamlingsteknikken også brukes til andre Lepidopteran møll.
Til slutt har CRISPR/Cas9-systemet vist seg å være et pålitelig verktøy for å legge til rette for funksjonelle genomikkstudier i H. armigera. De trinnvise beskrivelsene gjør det mulig for brukere å fullføre en integrert genredigeringsprosess.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (31725023, 31861133019 til GW, og 31171912 til CY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
References
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR. Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).
- Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. CRISPR editing in biological and biomedical investigation. Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).
- Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model. DNA Repair. 46, 1-8 (2016).
- Wu, J., et al. Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).
- Jiao, R., Gao, C. The CRISPR/Cas9 genome editing revolution. Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).
- Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems. World Patent Information. 60, 101944 (2020).
- Es, I., et al. The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges. Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).
- Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes. Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).
- Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -G. CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications. Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).
- Pandey, P. K., et al. Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research. Seminars in Cell & Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
- Mojica, F. J., Montoliu, L. On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals. Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Koutroumpa, F., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).
- Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).
- Fitt, G. P. The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems. Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).
- Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (Hübner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management. Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).
- Ai, D., et al. Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera Hübner (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).
- Wan, F., et al. A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Cheng, T., et al. Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest. Nature Ecology & Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).
- Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore. Science Reports. 6, 23666 (2016).
- Gouin, A., et al. Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Wang, J., et al. Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).
- Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins. Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).
- Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm. PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).
- Jin, L., et al. Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).
- Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision. Tobacco Sciene & Technology. 53 (2), 21-26 (2019).
- Wu, K., Gong, P. A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm. Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).
- Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics. Environmental Entomology. (1), 30 (2012).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).
- Zheng, M. -Y., et al. A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia. Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).
- Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae). Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).
- Kamimura, M., Tatsuki, S. Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).
- Edwards, K. D. Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE). Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).
