Presentert her er en protokoll av Helicoverpa armigera (Hübner) embryo mikroinjeksjon og knockout mutant identifikasjon opprettet av CRISPR / Cas9 genom redigering. Mutante insekter muliggjør videre forskning på genfunksjon og interaksjon mellom ulike gener in vivo.
Bomullsbollworm, Helicoverpa armigera, er en av de mest destruktive i verden. En kombinasjon av molekylær genetikk, fysiologi, funksjonell genomikk og atferdsstudier har gjort H. armigera til en modellart i Lepidoptera Noctuidae. For å studere in vivo-funksjonene til og interaksjoner mellom forskjellige gener, er gruppert regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR)/ assosiert protein 9 (Cas9) genomredigeringsteknologi en praktisk og effektiv metode som brukes til å utføre funksjonelle genomiske studier. I denne studien tilbyr vi en trinnvis systematisk metode for å fullføre gen knockout i H. armigera ved hjelp av CRISPR / Cas9-systemet. Design og syntese av guide RNA (gRNA) er beskrevet i detalj. Deretter oppsummeres de påfølgende trinnene som består av genspesifikk primerdesign for RNA (gRNA) opprettelse, embryosamling, mikroinjeksjon, insektoppdrett og mutantdeteksjon. Til slutt gis feilsøkingsråd og notater for å forbedre effektiviteten av genredigering. Vår metode vil fungere som en referanse for anvendelsen av CRISPR / Cas9 genomredigering i H. armigera samt andre Lepidopteran møll.
Anvendelsen av genomredigeringsteknologi gir et effektivt verktøy for å oppnå målgenmutanter i forskjellige arter. Fremveksten av det klyngede regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) / assosiert protein 9 (Cas9) systemet gir en ny metode for å manipulere genomer1. CRISPR/Cas9-systemet består av en guide RNA (gRNA) og Cas9 endonuclease2,3, mens gRNA kan videre deles inn i to deler, et mål komplementær CRISPR RNA (crRNA) og en transaktiverende crRNA (tracrRNA). GRNA integreres med Cas9 endonuclease og danner et ribonukleoprotein (RNP). Med gRNA kan Cas9 endonuclease rettes til et bestemt sted for genomet via base komplementering. RuvC- og HNH-domenene til Cas9 cleave målstedet til genomet tre baser før protospacer-tilstøtende motiv (PAM) sekvens og skape en dobbel-strand pause (DSB). DNA-spaltingen kan deretter repareres gjennom to mekanismer, ikke-homolog ende sammenføyning (NHEJ) eller homologi-rettet reparasjon (HDR)4. Reparasjon av DSB introduserer innsettinger eller slettinger som en måte å inaktivere det målrettede genet på, noe som potensielt kan føre til et fullstendig tap av genfunksjon. Derfor gjør den arvelige og spesifisiteten til CRISPR/Cas9-systemet det til en robust metode for å karakterisere genfunksjoner in vivo og analysere geninteraksjoner5.
Med mange fordeler har CRISPR/Cas9-systemet blitt brukt på ulike felt, inkludert biomedisin6,7, genterapi8,9 og landbruk10,11,12, og har blitt brukt til ulike biologiske systemer, inkludert mikroorganismer13, planter14,15, nematoder16 og pattedyr17 . I hvirvelløse dyr har mange insektarter blitt utsatt for CRISPR / Cas9 genomredigering, for eksempel fruktfluen Drosophila melanogaster og utover 18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera er en av de mest destruktive over hele verden23, og skader mange avlinger, inkludert bomull, soyabønner og sorghum24,25. Med utviklingen av sekvenseringsteknologi har genomet til H. armigera, så vel som for en rekke Lepidoptera insektarter, blitt sekvensert helt26,27,28,29. Et stort antall resistens- og olfaktoriske reseptorgener har blitt identifisert og karakterisert fra disse insektene de siste årene19,27,28,29. Noen resistensrelaterte gener er identifisert i H. armigera, for eksempel genkoding for kadherin30, en ATP-bindende kassetttransportør31,32, samt HaTSPAN133. Knockout av disse genene ved hjelp av CRISPR/ Cas9-teknologi resulterer i et høyt nivå av motstand mot Bacillus thuringiensis (BT) toksin i mottakelige stammer. Chang et al. (2017) slo også ut en feromonreseptor, som validerte sin betydelige funksjon i parringstidsregulering19. Disse rapportene tyder på at CRISPR/Cas9 kan fungere som et effektivt verktøy for å studere genfunksjon in vivo i insektsystemer. Imidlertid forblir en detaljert prosedyre for CRISPR / Cas9-modifikasjon i insektsystemer ufullstendig, noe som begrenser bruksområdet i insektfunksjonell genomikk.
Her presenterer vi en protokoll for å slå ut et funksjonelt gen i H. armigera ved hjelp av CRISPR / Cas9-systemet. En detaljert trinnvis protokoll er gitt, inkludert design og forberedelse av genspesifikke primere for gRNA-produksjon, embryosamling, mikroinjeksjon, insektoppdrett og mutantidentifikasjon. Denne protokollen fungerer som en verdifull referanse for å manipulere eventuelle funksjonelle gener i H. armigera og kan utvides til andre Lepidoptera-arter.
Anvendelsen av CRISPR/Cas9-systemet har gitt kraftig teknisk støtte til analyse av genfunksjon og interaksjon mellom ulike gener. Den detaljerte protokollen vi presenterer her demonstrerer genereringen av en homozygot mutant i H. armigera via CRISPR / Cas9 genomredigering. Denne pålitelige prosedyren gir en enkel måte for rettet genmutagenese i H. armigera.
Valget av CRISPR-målsider kan påvirke mutageneseeffektiviteten37. I denne protokollen samme…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (31725023, 31861133019 til GW, og 31171912 til CY).
2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |