Summary
Здесь представлен протокол микроинъекции эмбриона Helicoverpa armigera (Hübner) и нокаутирующей мутантной идентификации, созданный путем редактирования генома CRISPR/Cas9. Мутантные насекомые позволяют проводить дальнейшие исследования функции генов и взаимодействия между различными генами in vivo.
Abstract
Хлопковый червь, Helicoverpa armigera, является одним из самых разрушительных вредителей в мире. Сочетание молекулярной генетики, физиологии, функциональной геномики и поведенческих исследований сделало H. armigera модельным видом у Lepidoptera Noctuidae. Для изучения функций in vivo и взаимодействий между различными генами технология редактирования генома кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR) / ассоциированного белка 9 (Cas9) является удобным и эффективным методом, используемым для выполнения функциональных геномных исследований. В этом исследовании мы предоставляем пошаговый систематический метод для завершения нокаута гена у H. armigera с использованием системы CRISPR / Cas9. Подробно описаны конструкция и синтез направляющей РНК (гРНК). Затем суммируются последующие этапы, состоящие из генно-специфического дизайна праймера для создания направляющей РНК (гРНК), сбора эмбрионов, микроинъекции, выращивания насекомых и обнаружения мутантов. Наконец, предоставляются рекомендации и заметки по устранению неполадок для повышения эффективности редактирования генов. Наш метод будет служить справочным материалом для применения редактирования генома CRISPR/Cas9 у H. armigera , а также у других чешуекрылых мотыльков.
Introduction
Применение технологии редактирования генома обеспечивает эффективный инструмент для достижения мутантов генов-мишеней у различных видов. Появление системы кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR)/ассоциированного белка 9 (Cas9) обеспечивает новый метод манипулирования геномами1. Система CRISPR/Cas9 состоит из направляющей РНК (гРНК) и эндонуклеазы Cas92,3, в то время как гРНК может быть дополнительно разделена на две части: целевую комплементарную CRISPR РНК (crRNA) и трансактивирующую crRNA (tracrRNA). ГРНК интегрируется с эндонуклеазой Cas9 и образует рибонуклеопротеин (RNP). С гРНК эндонуклеаза Cas9 может быть направлена на определенный участок генома посредством комплементации основания. Домены RuvC и HNH Cas9 расщепляют целевой участок генома на три основания перед последовательностью протоспейсер-смежных мотивов (PAM) и создают двухцепочечный разрыв (DSB). Затем расщепление ДНК может быть восстановлено с помощью двух механизмов: негомологичного конечного соединения (NHEJ) или гомологического репарации (HDR)4. Восстановление DSB вводит вставки или делеции как способ инактивации целевого гена, потенциально вызывая полную потерю функции гена. Следовательно, углеродистость и специфичность системы CRISPR/Cas9 делают ее надежным методом для характеристики функций генов in vivo и анализа взаимодействий генов5.
С многочисленными достоинствами система CRISPR/Cas9 применяется в различных областях, включая биомедицину6,7, генную терапию8,9 и сельское хозяйство10,11,12, и используется для различных биологических систем, включая микроорганизмы13, растения14,15, нематоды16 и млекопитающих17 . У беспозвоночных многие виды насекомых были подвергнуты редактированию генома CRISPR/Cas9, такие как плодовая муха Drosophila melanogaster и более 18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera является одним из самых разрушительных вредителей во всем мире23 и повреждает многочисленные культуры, включая хлопок, сою и сорго24,25. С развитием технологии секвенирования геном H. armigera, а также ряд видов насекомых Lepidoptera были полностью секвенированы 26,27,28,29. Большое количество генов резистентности и обонятельных рецепторов было идентифицировано и охарактеризовано от этих насекомых в последние годы19,27,28,29. Некоторые гены, связанные с резистентностью, были идентифицированы у H. armigera, такие как гены, кодирующие cadherin30, АТФ-связывающий кассетный транспортер31,32, а также HaTSPAN133. Нокаут этих генов с использованием технологии CRISPR/Cas9 приводит к высокому уровню устойчивости к токсину Bacillus thuringiensis (BT) у восприимчивых штаммов. Кроме того, Chang et al. (2017) выбили феромонный рецептор, который подтвердил его важную функцию в регулировании времени спаривания19. Эти отчеты свидетельствуют о том, что CRISPR/ Cas9 может выступать в качестве эффективного инструмента для изучения функции генов in vivo в системах насекомых. Однако подробная процедура модификации CRISPR/Cas9 в системах насекомых остается неполной, что ограничивает диапазон ее применения в функциональной геномике насекомых.
Здесь мы представляем протокол для выбивания функционального гена у H. armigera с использованием системы CRISPR/Cas9. Предоставляется подробный пошаговый протокол, включая разработку и подготовку генно-специфических праймеров для производства гРНК, сбора эмбрионов, микроинъекции, выращивания насекомых и идентификации мутантов. Этот протокол служит ценным справочным материалом для манипулирования любыми функциональными генами у H. armigera и может быть распространен на другие виды чешуекрылых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Проектирование геноспецифических праймеров и получение sgRNA
- Проверка сохраненной геномной области в интересующем гене с помощью анализа амплификации и секвенирования ПЦР. Амплифицируйте ген-мишень из геномной ДНК H. armigera и различайте экзоны и интроны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Специфичность последовательности направляющего сайта необходима, чтобы избежать нецелевого редактирования генов. Поиск возможных направляющих сайтов в экзонах близок к 5' UTR гена. Затем важно убедиться, что ген полностью нефункционален. Краткое изложение пути потока для получения sgRNA проиллюстрировано на рисунке 1. - Выберите мишени sgRNA. Используйте онлайн-сайт CRISPR CRISPOR (версия 4.97) (http://crispor.tefor.net/crispor.py) для поиска возможных направляющих сайтов в экзонах, близких к 5'UTR гена. Введите последовательность экзонов в текстовое поле и выберите целевой геном helicoverpa armigera (Harm_1.0). Выберите опцию протоспейсера смежный мотив (PAM) "20 bp-NGG" и оставьте остальные настройки на параметрах по умолчанию в соответствии с руководствами пользователя веб-сайтов.
- Сравните прогнозируемые последовательности направляющих из программного обеспечения и выберите последовательность направляющих с максимальной прогнозируемой эффективностью и наименьшим количеством несоответствий, чтобы повысить эффективность редактирования и уменьшить нецелевое редактирование. Рекомендуется направляющая последовательность 20 bp, содержащая один или два G на 5'UTR, поскольку это может повысить эффективность резки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пара гРНК в экзонных областях также рекомендуется для получения удаления большого сегмента, что упрощает обнаружение мутантов на более поздних этапах. Убедитесь, что расстояние между двумя выбранными направляющими последовательностями составляет не менее 100 бит/с. В этом протоколе мы выбираем широко используемый белок SpCas9, который распознает мотив NGG. Согласно инструкции производителя, направляющая последовательность, в которой отсутствует G, также приемлема при выборе промотора T7, потому что промоутер добавляет G к 5''UTR последовательности. - Конструкция прямых и обратных олигонуклеотидов. Установите порядок последовательностей на 5'-20 bp направляющей последовательности-NGG-3' и обратно дополните направляющую последовательность. Добавьте промоторную последовательность Т7 к направляющей последовательности прямой и обратной цепи соответственно в соответствии с руководством пользователя комплекта синтеза гРНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность PAM NGG должна быть исключена из олигонуклеотидной последовательности. - Генерируйте sgRNA с помощью набора синтеза гРНК. Этот процесс включает в себя три этапа: сборка шаблона ДНК, транскрипция in vitro и очистка sgRNA (рисунок 2). Выполняйте каждый шаг в соответствии с инструкциями пользователя.
2. Подготовка и сбор эмбрионов
- Разделите самцов и самок куколок, как описано в Hongtao et al.34 , и разделите их на две разные сетчатые клетки. После эклозии закормите их ~30 мл 10% (мас./об.) раствора белого сахара в абсорбирующей хлопчатобумажной в чашке Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: 3 г белого сахара растворяли в 30 мл стерильной воды для приготовления 10% (мас./об.) раствора белого сахара. - Отберите 50 здоровых особей из 3-дневных самцов и 2-дневных самок соответственно и смешайте их в чистой сетчатой клетке. Поместите в клетку кусочек хлопка, содержащий 10% (мас./об.) раствор сахара, и держите хлопок влажным. Накройте клетки сетки марлей и закрепите марлю резинкой. Распылите воду на марлю, чтобы она оставалась влажной.
- Позвольте отобранным самцам и самкам мотыльков на этапе 2 полностью спариваться и наблюдать за количеством яйцекладки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пик яйцекладки H. armigera появляется после 9:00 p.m. Поэтому время спаривания следует учитывать, чтобы обеспечить достаточное количество яиц на последующих этапах. На пике яйцекладки замените марлю черной тканью и включите свободную яйцекладку в течение 30 мин. Заменяйте черную ткань каждые 30 мин для сбора свежих яиц (рисунок 3А). - Разрежьте черную ткань на участки неправильной формы размером примерно 3 мм. Убедитесь, что на каждом участке будет больше яиц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте выбора морщинистых яиц, так как они обычно не оплодотворяются. - Наклейте двустороннюю ленту на предметное стекло микроскопа (25 мм x 75 мм) (рисунок 3B). С помощью щипцов наклейте пластыри с яйцами в ряд на поверхность двусторонней ленты. Нажмите на край каждого пластыря, чтобы убедиться, что они прочно прилипают к ленте. Соберите 50-100 яиц на предметное стекло микроскопа (рисунок 3C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Пятна должны покрывать всю поверхность двусторонней ленты, иначе вылупившаяся личинка будет испытывать трудности с выползанием. - Перед микроинъекцией держите микроскоп на льду, чтобы задержать развитие эмбрионов.
3. Микроинъекция эмбрионов
- Подготовьте иглу, потянув за капиллярное стекло с помощью съемника микропипетки (рисунок 4А). Установите значение «Нагрев» на 540, «Потяните» на 80, «Вел» на 75, «Время» на 170 и «Давление» на 450. Измельчите наконечник иглы с помощью микрошлифовальной машины. Идеальная игла показывает острый наконечник (рисунок 4B).
- Приготовление инъекционных растворов. Добавьте 2 мкл коммерциализированного белка Cas9 (1 мг/мл) и сгРНК (конечная концентрация 300-500 нг/мкл) в воду без РНКазы в ПЦР-трубке для получения объемной смеси 10 мкл. Объем сгРНК зависит от ее концентрации. Хорошо перемешать путем пипетки и положить на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все наконечники пипеток и трубки ПЦР, используемые на этом этапе, не содержат РНКазы. - Задайте параметры электронного микроинжектора. Установите давление впрыска (pi) на уровне 1 500 гПа, время впрыска (ti) на 0,1 с и давление компенсации (pc) на 30 гПа.
- Загрузите 2 мкл смеси в иглу с помощью наконечника пипетки микрозагрузчика. Остаточный воздух в кончике иглы должен быть максимально отработан.
- Подключите инъекционную иглу к микроманипулятору и обеспечьте плотное соединение между двумя частями.
- Поместите слайды в чашку Петри (100 мм) и поставьте их на сцену микроскопа (рисунок 5А).
- Отрегулируйте положение наконечника иглы под световым микроскопом до тех пор, пока под микроскопом не будут видны как кончик иглы, так и эмбрионы (рисунок 5B).
- Отрегулируйте объем капли. Нажмите на педаль и наблюдайте, как жидкость падает на кончике иглы. Отрегулируйте давление инъекции микроинъектора до тех пор, пока объем капли жидкости не составит около одной десятой объема эмбрионов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Качество инъекционной иглы имеет жизненно важное значение для выживаемости эмбрионов. - Осторожно вставьте кончик иглы в верхнюю полусферу эмбриона под углом 45 градусов (рисунок 5С). Нажмите на педаль, чтобы доставить смесь в эмбрион. Инъекция приводит к небольшому расширению эмбриона. Немедленно втяните иглу из эмбриона и переместите чашку Петри одной рукой, пока следующий эмбрион не окажется рядом с иглой, и введите следующему эмбриону ту же процедуру.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цитоплазматический отток в точечном отверстии является приемлемым. Если цитоплазматическая утечка слишком велика, отрегулируйте угол иглы на более строгий угол, пока отток жидкости не будет контролироваться. - Введите не менее 300 эмбрионов, чтобы обеспечить достаточное количество вылупления. Накройте крышку чашки Петри после инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время от яйцекладки до инъекции 50-100 эмбрионов ограничено 2 ч. Большинство эмбрионов все еще находятся на одноклеточной стадии в течение этого периода времени. В общем, полезно повторить процедуру яйцекладки во время инъекции эмбриона, чтобы повысить эффективность.
4. Выращивание насекомых после инъекций
- Размножение эмбрионов G0.
- Инкубируйте эмбрионы при относительной влажности 60% и 28°C в искусственном климатическом боксе с 14 ч света/10 ч темноты.
- Проверяйте развитие эмбрионов ежедневно после инъекции. Когда цвет поверхности эмбрионов потемнеет, поместите искусственную диету в чашку Петри вокруг предметного стекла микроскопа и проверяйте развитие эмбрионов каждые 12 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Искусственная диета готовится в соответствии с описанием Wu et al.35 и Jha et al.36. - Подготовьте 24-луночные культуральные пластины и заполните каждую лунку до одной трети своей объемной емкости искусственной диетой.
- Выделите вылупившихся личинок (рисунок 5D) с помощью небольшой кисти и перенесите их на 24-луночную культуральную пластину. Вставьте по одной личинке в колодец, чтобы убедиться, что у каждой личинки достаточно пищи, чтобы выжить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки H. armigera выращивались индивидуально в каждом колодце, так как они обычно каннибализировали друг друга.
- Выращивание личинок G0
- Выращивайте личинок в тех же условиях, что и эмбрионы.
- Проверяйте вылупившихся личинок каждый день. Когда личинки вырастут до третьей стадии звезды, переведите каждую личинку в новые стеклянные дактилетры, заполнив пятую часть объема искусственным рационом.
- Примерно через 12 д после инкубации зрелые личинки должны начать окукливаться.
- Зрелые куколки G0 различают по признаку пола и помещают в отдельные клетки перед эклозией. Также заготавливаются одновозрастные куколки дикого типа.
- Выращивание взрослых G0
- Ежедневно проверяйте эклозию как диких, так и мутантных куколок.
- Переместите недавно эклозированных самцов G0 и взрослых самок дикого типа в свежую сетчатую клетку и сделайте соотношение между G0 и диким типом примерно 1:1. Снабдите их 10% (мас./об.) раствором сахара, опущенным в ватные шарики.
- Выращивайте насекомых обычным методом выше до окукливания первого поколения (G1).
- Используя дактилетры, переложите недавно закрытую одну пару взрослых особей G1 в пластиковую банку (13 см х 12 см х 12 см), снабженную 10% (мас./об.) раствором сахара. Накройте каждую банку марлей. Возьмите в общей сложности около 50 пар взрослых особей G1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эклозия самок моли предшествует таковой у самцов моли. В целом, 3-дневный самец и 2-дневная самка сексуально зрелы и готовы к спариванию. Новоиспеченные взрослые особи не будут спариваться в свой первый светлый период без кормления. - Соберите взрослых особей G1 в пластиковую банку после того, как они отложили яйца. Поместите каждую взрослую моль в центрифужную трубку объемом 1,5 мл.
5. Обнаружение нокаутирующих мутантов
- Разработайте пару грунтовок, охватывающих прогнозируемый усеченный участок. Грунтовки должны быть установлены на расстоянии не менее 50 bp по обе стороны (вверх и вниз по течению) от целевого участка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Праймеры для идентификации целевой последовательности часто охватывают большие пролеты для эффективного усиления. - Выполните реакцию ПЦР с помощью генотипирующих праймеров с геномной ДНК, извлеченной в разделе 1. Выполнять циклическую ПЦР при 95 °C в течение 20 с; 35 циклов 95 °C в течение 20 с, 55 °C в течение 20 с, 72 °C в течение 1 мин; 72 °C в течение 5 мин и 4 °C на удержании. Проверьте реакционный продукт с помощью 1% (мас./об.) агарозного геля. Выбранная пара детектирующих праймеров была подтверждена качеством продукта ПЦР. Если полосы очевидны и специфичны, праймеры могут быть использованы для дальнейшего обнаружения мутантов на основе размера ампликона.
- Экран для потенциальных отредактированных лиц. Осторожно удалите заднюю ногу с помощью щипцов и поместите каждую ногу в лизирующую матричную трубку соответственно. Маркировка лизирующей матричной трубки в соответствии с числом на стеклянном дактилетре.
- Гомогенизировать заднюю ногу с помощью тканевого гомогенизатора. Установите скорость 6,0 м/с, а время 60 с. Извлеките геномную ДНК гомогенизированного образца с помощью коммерческого набора для экстракции гДНК в соответствии с инструкциями производителя.
- Амплифицируйте сегмент гена с помощью генотипирующих праймеров с теми же условиями реакции ПЦР, которые описаны на этапе 2. Подтвердите генотип с помощью службы секвенирования генов. Как только мутантные генотипы G1 (нацеленные на тот же сайт), содержащиеся в той же банке, были обнаружены, сохраните потомство G1 и переименуйте его во второе поколение (G2).
- Поместите особей G1 того же генотипа в одну сетчатую клетку. Самостоятельно скрещивайте потомство G1 и продолжайте экранировать, используя те же методы.
- Амплифицируйте сегмент гена и подтвердите генотип с помощью той же процедуры, что описано на шаге 2. Получайте гомозиготные линии G2 и поддерживайте нокаут-мутантную линию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол предоставляет подробные шаги для получения линий нокаута генов H. armigera с использованием технологии CRISPR/Cas9. Репрезентативные результаты, полученные по этому протоколу, обобщены для отбора гДНК, сбора и инъекции эмбрионов, выращивания насекомых и обнаружения мутантов.
В этом исследовании целевой сайт нашего гена, представляющего интерес, был расположен во втором экзоне (рисунок 2А). Этот участок был высоко сохранен, и фрагмент целевой полосы синтезированной сгРНК был подтвержден с помощью электрофореза агарозного геля (рисунок 2B, C, D).
Самцы и самки моли первоначально выращивались в отдельных сетчатых клетках, чтобы предотвратить спаривание досрочно и обеспечить достаточное количество эмбрионов как можно больше. В целом, было собрано общее количество оплодотворенных яйцеклеток и немедленно введена белковая смесь sgRNA/Cas9 (300-500 нг/мкл сгРНК, 200 нг/мкл белка Cas9) на одноклеточной стадии. Объем инъекций составлял около одной десятой от объема эмбрионов. После микроинъекции эмбрионы выращивали, как описано в разделе 4, и 40%-60% введенных эмбрионов выживали.
Мутантное обнаружение одной мишени sgRNA выполняли путем секвенирования продуктов ПЦР у взрослых родителей G1 (рисунок 6B). Мы также проверили эффективность использования неперекрывающихся пар sgRNA в разных экзонах. Большое удаление мутантов (рисунок 6C,D) можно легко отличить от полос дикого типа (рисунок 6A).
Частота мутаций, рассчитанная в этом протоколе, составила 87,50%, когда 16 человек были случайным образом протестированы, что указывает на то, что этот протокол был высокоэффективным. Результаты нокаута генов были показаны в нескольких генотипах, но большинство мутантов, идентифицированных в результате нашего скрининга, были типа -2 bp. Мутации привели к преждевременному прекращению трансляции белка в геноме, что впоследствии привело к потере функции гена.
Рисунок 1: Блок-схема для приготовления sgRNA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Выбор и синтез целевых sgRNAs из H. armigera. (A) Желтый домен представляет экзон, а черная линия представляет интрон. Красные последовательности обозначают целевую последовательность, а синие последовательности указывают на соседний мотив протоспейсера (PAM). (B) ПЦР-сборка шаблона ДНК сгРНК. (C) Продукт транскрипции in vitro. (D) Очистка сгРНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Коллекция эмбрионов. (А) Сетчатая клетка, покрытая черной тканью. Самцы и самки мотыльков H. armigera спаривались. (B) Предметное стекло микроскопа без эмбрионов. (C) Слайд микроскопа, содержащий 50-100 эмбрионов на кусках черной ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Подготовка иглы. (A) Съемник микропипетки. (B) Наконечник микроинъекционной иглы после вытягивания съемником микропипетки. Пунктирная рамка указывает на увеличенный наконечник иглы. Шкала представляет 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Микроинъекции эмбриона. (A) Весь набор микроинъекционной системы, содержащей микроскоп (посередине) и электронный микроинжектор (слева), подключенный к микроманипулятору (справа). (B) Эмбрионы и микроинъекционная игла. (C) Место инъекции эмбриона помечено красной стрелкой. Шкала представляет собой 200 мкм. (D) Вылупившаяся личинка под микроскопом. Шкала представляет 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Обнаружение мутантов методом ПЦР и гелевого электрофореза. Черные стрелки и красные линии указывают целевые участки sgRNA. (A) Полоса в полосе 1 представляет собой фрагмент усиления, полученный из дикого типа. (B) Полосы в полосах 2 и 3 представляют собой фрагмент амплификации, полученный от мутанта с использованием одной мишени sgRNA. (C) Обнаружение гетерозиготы с использованием пары неперекрывающихся сгРНК. Полосы в полосах 4 и 5 представляют собой фрагмент амплификации, полученный в результате мутации двух мишеней sgRNA. Нижние полосы указывают на удаление большого фрагмента. (D) Результаты получены из гомозиготы. Полосы в полосах 6 и 7 указывают на удаление крупных фрагментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Применение системы CRISPR/Cas9 обеспечило мощную техническую поддержку для анализа функции генов и взаимодействия между различными генами. Подробный протокол, который мы представляем здесь, демонстрирует генерацию гомозиготного мутанта в H. armigera посредством редактирования генома CRISPR / Cas9. Эта надежная процедура обеспечивает простой способ направленного генного мутагенеза у H. armigera.
Выбор целевых сайтов CRISPR может повлиять на эффективность мутагенеза37. В этом протоколе мы сравнили и проанализировали несколько результатов с онлайн-сайта CRISPOR, чтобы получить подходящий целевой сайт. In silico предсказания гРНК представляют некоторые преимущества. Во-первых, они анализируют весь геном H. armigera при разработке sgRNAs, чтобы свести к минимуму нецелевые эффекты. Упомянутые выше онлайн-ресурсы, а также CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) функционируют с рядом геномов чешуекрылых, которые могут быть полезны для редактирования генов у других чешуекрылых мотыльков. Во-вторых, ранжирование кандидатов sgRNAs напрямую сравнивает возможности, но может включать некоторые вариации, основанные на различных алгоритмах. Последовательность кандидатов с высокими рейтингами в обоих списках, как правило, более надежна. Однако основным ограничением этого протокола является то, что в базах данных веб-сайтов отсутствует большое количество геномов насекомых, поэтому существует вероятность нецелевых эффектов. Другим ограничением является то, что последовательность PAM необходима для проектирования sgRNA, что может привести к невозможности найти подходящий целевой сайт.
Ткани, используемые для мутантного скрининга, также являются решающим фактором. На выживаемость, жизненный цикл и физиологические функции насекомых не следует влиять. В нашем процессе изучения оптимального метода экстракции гДНК была предпринята попытка извлечения микрогемолимфы из личинок для обнаружения мутантов, чтобы сэкономить время и избежать спаривания (неопубликованные данные). Однако этот метод принес больше проблем в отношении эффективности амплификации ПЦР и выживаемости взрослых (данные не показаны). Кроме того, Zheng et al.38 сообщили о неразрушающем методе экстракции гДНК с использованием эксувиата или пупарии. Основываясь на этих результатах, мы модифицировали и исследовали подход с использованием задних ног для экстракции гДНК, который позволяет взрослым мотылькам выживать и спариваться естественным образом, значительно повышая точность обнаружения данного генотипа. Поэтому мы разработали новый метод для увеличения успешности экстракции гДНК путем удаления одной из задних ног у каждого взрослого кандидата. Мы также подтвердили, что эта операция не повлияла на выживаемость и частоту спаривания взрослых мотыльков. Кроме того, мы обнаружили, что удаление большого фрагмента можно легко наблюдать с помощью гелевого электрофореза при совместном введении пары гРНК через экзонные области (рисунок 6), что упрощает процесс идентификации мутантов при скрининге.
Яйца H. armigera собраны на черной ткани, что позволяет легко различить яйца под микроскопом в процессе микроинъекции (рисунок 5В). Из-за общего репродуктивного поведения чешуекрылой моли, такого как спаривание, яйцекладка, вылупление и эклозия39,40,41, этот метод сбора яиц также может быть применен к другим чешуекрылым мотылькам.
В заключение, система CRISPR/Cas9 оказалась надежным инструментом для облегчения исследований функциональной геномики у H. armigera. Пошаговые описания позволяют пользователям завершить интегральный процесс редактирования генов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет никаких конфликтов интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (31725023, 31861133019 в GW и 31171912 в CY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
References
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR. Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).
- Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. CRISPR editing in biological and biomedical investigation. Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).
- Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model. DNA Repair. 46, 1-8 (2016).
- Wu, J., et al. Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).
- Jiao, R., Gao, C. The CRISPR/Cas9 genome editing revolution. Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).
- Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems. World Patent Information. 60, 101944 (2020).
- Es, I., et al. The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges. Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).
- Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes. Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).
- Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -G. CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications. Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).
- Pandey, P. K., et al. Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research. Seminars in Cell & Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
- Mojica, F. J., Montoliu, L. On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals. Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Koutroumpa, F., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).
- Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).
- Fitt, G. P. The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems. Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).
- Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (Hübner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management. Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).
- Ai, D., et al. Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera Hübner (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).
- Wan, F., et al. A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Cheng, T., et al. Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest. Nature Ecology & Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).
- Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore. Science Reports. 6, 23666 (2016).
- Gouin, A., et al. Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Wang, J., et al. Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).
- Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins. Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).
- Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm. PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).
- Jin, L., et al. Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).
- Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision. Tobacco Sciene & Technology. 53 (2), 21-26 (2019).
- Wu, K., Gong, P. A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm. Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).
- Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics. Environmental Entomology. (1), 30 (2012).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).
- Zheng, M. -Y., et al. A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia. Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).
- Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae). Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).
- Kamimura, M., Tatsuki, S. Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).
- Edwards, K. D. Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE). Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).
