Summary
Viene dimostrata una nuova tecnica per la ricostruzione del circuito sanguigno in un modello eterotopico di trapianto di cuore di topo addominale.
Abstract
La tecnica chirurgica del trapianto di cuore addominale eterotopico nei topi è un modello standard per la ricerca nell'immunologia dei trapianti. Qui viene presentata la tecnica stabilita per una ricostruzione modificata del circuito sanguigno in un modello di trapianto di cuore addominale eterotopico. Questo metodo utilizza la vena cava inferiore intratoracica (IIVC) invece dell'arteria polmonare del cuore donatore per l'anastomosi alla vena cava inferiore del ricevente. Sta facilitando e migliorando i tassi di successo per il trapianto di cuore addominale nei topi.
Introduction
La tecnica chirurgica del trapianto di cuore addominale eterotopico nei topi rappresenta un modello standard per la ricerca nell'immunologia deitrapianti 1,2,3. Tuttavia, è molto difficile da eseguire e ciò implica una restrizione all'uso diffuso di questo modello4,5.
Nel trapianto tradizionale di cuore di topo (THTx), l'aorta donatrice e l'aorta addominale ricevente vengono anastomosi mentre l'arteria polmonare è anastomosa alla vena cava inferiorericevente 6,7,8.
In questa tecnica modificata di trapianto di cuore di topo, l'aorta donatrice viene anastomosa all'aorta addominale ricevente e il donatore IIVC viene anastomoso alla vena cava inferiore ricevente(3,4,6) ( Figura2 e Figura 3).
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti seguendo gli orientamenti della direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici (comitato Etico approvato, #G1071/09).
NOTA: La preparazione preliminare, l'anestesia, la cura post-operatoria e il lavoro di monitoraggio sono gli stessi eseguiti nei metodichirurgici tradizionali 1,2,4. I topi BALB/c sono stati donatori di cuore e C57BL/6J come riceventi di trapianti. I topi avevano un'età compresa tra 8 e 12 settimane, pesavano ~ 30 g al trapianto e erano alloggiati in condizioni standard.
1. Fasi preparatorie
- Per l'anestesia, dare ai topi isoflurane inalatore (2%) fino ad addormentarsi, seguiti da iniezioni intraperitoneali di chetamina (100 mg/kg) + xiazina (10 mg/kg) + acepromazina (2 mg/kg). Per l'analgesia postoperatoria, applicare Metamizol (200 mg/kg) p.o. e Carprofen (5 mg/kg) s.c..
NOTA: L'applicazione di antibiotici è stata asteneta di proposito in quanto queste sostanze possono influenzare le risposte immunologiche. - Per la chirurgia, utilizzare una serie di strumenti microscopici tra cui una micro-forbice, micro-pinze, un portaaghi e micro morsetti emostatici. È necessaria anche una penna elettrochirurgica. Eseguire suture utilizzando tipi di nylon 7/0er, 10/0er e 4/0er.
- Posizionare il mouse in una scatola per l'inalazione di isoflurane (2%) per 40-60 secondi. Determinare la profondità dell'anestesia stringendo la zampa con una pinzetta. Se c'è una completa mancanza di risposta per questo stimolo, vai al passo successivo.
- Una volta che il mouse si è addormentato, pesare il mouse.
- Applicare un'iniezione intraperitoneale di chetamina (100 mg/kg) + xiazina (10 mg/kg) + acepromazina (2 mg/kg) al topo anestetizzato.
- Ritagliare la pelliccia addominale e posizionare il mouse sul tavolo dell'operazione. Eseguire la disinfezione utilizzando lo ioduro di povidone per 3 volte, quindi drappeggiare correttamente il mouse usando un asciugamano chirurgico fenestrato.
2. Procedura operativa del donatore
- Usa le forbici per tagliare la pelle dal collo all'addome inferiore e stacca l'intero strato della pelle alla linea mediana di entrambe le ascella.
- Utilizzare le forbici per tagliare i muscoli della parete addominale e spostare delicatamente i visceri a sinistra (dal punto di vista dell'operatore). Avvolgere i visceri con una garza soluzione salina imbibed per esporre in sicurezza la vena cava inferiore.
- Utilizzare una siringa da 1 ml per iniettare lentamente 0,4 ml della soluzione di eparina (contiene 500 U di eparina) nella vena cava inferiore e attendere 1 minuto prima di estrarre l'ago.
- Estrarre l'ago e utilizzare una micro-forbice per tagliare sia la vena cava inferiore che l'aorta addominale per accelerare la dissanguamento.
- Usa le forbici per aprire la cavità toracica eseguendo un taglio a forma di U; esporre completamente il cuore, i polmoni e tutti i vasi sanguigni toracico.
- Esporre l'aorta toracica, tagliare 1/2 del lume, quindi tagliare la vena polmonare per facilitare l'irrigazione e il drenaggio.
- Inserire un tubo di irrigazione nell'apertura dell'aorta toracica, iniettare almeno 2 ml di 4 °C di soluzione cardioplegia istidina-triptofano-chetoglutarato freddo(soluzione Custodiolo HTK) 9 fino a quando il deflusso della vena polmonare è completamente chiaro e il cuore smette completamente di battere.
- Estrarre il tubo di irrigazione e staccare lo sterno.
- Utilizzare micro forbici per rimuovere il timo e per rimuovere leggermente il grasso intorno all'arco aortico.
- Utilizzare forcep dritte e curve per esporre e ligarare il tronco dell'arteria pulmonalis (sul lato destro dell'arco aortico) con una sutura 10/0.
- Utilizzare micro forcep per separare il grasso e il tessuto connettivo attaccati all'IIVC, esporre e legare la vena cava superiore (sul lato sinistro dell'arco aortico) con una sutura 7/0 e utilizzare micro forbici per tagliarla dietro la legatura.
- Fai una sutura 7/0 intorno alla base del cuore sotto l'arco aortico, l'IIVC ed entrambi i padiglioni auricolari. Quindi ligare i rami dell'arteria polmonare e i vasi polmonari venosi.
- Utilizzare micro forbici per trasliare l'arco aortico il più distale possibile, i vasi polmonari sotto la legatura e l'IIVC vicino al diaframma. Togli il cuore dal petto.
- Mettere il cuore del donatore espiantato in soluzione cardioplegia HTK fredda a 4 °C e conservare temporaneamente.
3. Procedura operativa del destinatario
NOTA: I passaggi iniziali dell'operazione sono simili a quelli precedentemente mostrati per il topo donatore, tra cui anestesia e disinfezione.
- Eseguire il taglio della pelle addominale in modo trasversale, coprire gli organi addominali con una garza bagnata usando una soluzione salina.
- Utilizzare micro forcep per esporre la vena cava inferiore e l'aorta addominale e liberarli dal tessuto adiposo circostante.
- Utilizzare micro forcep per ligare o elettrocauterizzare i vasi laterali di diramazione (laterali o sotto la vena/aorta) sotto i vasi renali.
- Utilizzare pinze applicatori a clip per posizionare due micro morsetti emostatici nella parte addominale della vena/aorta provenienti da destra lasciando più di 1 cm di distanza sia per l'aorta che per la vena per garantire spazio alla costruzione dell'anastomosi tra di loro.
- Utilizzare micro forbici per fare un'incisione nell'aorta un po 'più vicino al morsetto inferiore rispetto al morsetto superiore. In alternativa, utilizzare un ago da 30 G per fare un piccolo foro e aprirlo con micro forbici.
- Posizionare il mouse ricevente in modo che l'aorta sia rivolta verso l'operatore con la vena cava sull'altro lato. Quindi posizionare il cuore nella cavità addominale e coprirlo con un piccolo cuscinetto di garza bagnato.
- Utilizzare una sutura 10/0 per adattare e cucire l'aorta donatrice all'aorta ricevente iniziando caudally, fare un nodo e procedere con una sutura di corsa verso la parte superiore dell'incisione (circa 4-5 punti). Successivamente, capovolgere il cuore verso destra (dal punto di vista del soggetto), coprirlo di nuovo e continuare la sutura sul lato sinistro fino a raggiungere l'estremità caudale e annodarla.
- Utilizzare un tubo di irrigazione per iniettare almeno 0,5 ml di soluzione cardioplegia HTK 4 °C per sciacquare l'IIVC del donatore.
- Utilizzare micro-forbici per tagliare un foro rotondo sulla vena cava inferiore addominale del ricevente, che dovrebbe avere le stesse dimensioni del lume IIVC donatori. L'incisione deve essere posizionata sopra l'apertura anastomotica aortica. Rendere l'incisione vena più grande dell'incisione aortica.
- Utilizzare una sutura 10/0 per cucire l'IIVC donatore alla vena cava ricevente a partire dal caudally. Legare un nodo ed eseguire una sutura di corsa fino a raggiungere la parte superiore dell'incisione. Utilizzare cinque punti e continuare la sutura a sinistra. Infine, legare un nodo nell'angolo della coda e stringere con cura (fare attenzione a non tirare troppo stretto).
- Posizionare le piccole parti della spugna emostatica intorno alla vena e agli anastomosi aortiche.
- Utilizzare pinze applicatori a clip per rimuovere prima i morsetti microemostatici inferiori e poi superiori e sciacquare la cavità addominale con cloruro di sodio temperato allo 0,9% a 38,0 °C.
- Utilizzare micro forcep per togliere la spugna emostatica.
- Osservare il battito cardiaco del cuore trapiantato.
- Usa le flessioni per rimettere l'intestino nella cavità addominale e nelle suture a due strati (muscoli addominali seguiti dalla pelle) per chiudere la ferita addominale con una sutura 4/0.
- Mettere i topi in una camera di lavoro per il controllo dell'ossigeno e della temperatura (ad esempio, INVIVO2-400) per fornire un ambiente caldo e ricco di ossigeno per il recupero dei topi trapiantati, attendere che i topi si sveglino.
- Per l'analgesia postoperatoria, sommiture direttamente metamizolo 200 mg/kg per os dopo l'operazione. Quattro e 16 ore dopo l'operazione dare metamizolo 200 mg/kg per os+ Carprofen (5 mg/kg) s.c. Nell'ulteriore follow-up, dare Carprofen (5 mg/kg) s.c ai topi trapiantati ogni 24 ore per tre giorni consecutivi dopo l'operazione.
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Representative Results
Qui viene presentata una tecnica modificata di trapianto di cuore addominale eterotopico nei topi che è stata precedentemente sviluppata nel nostro laboratorio e si è dimostrata utile negli ultimi 16 anni. In precedenza, è stato riferito che in generale 40 casi di vena cava a vena cava (gruppo V-V) rispetto a 40 casi della tradizionale arteria polmonare alla procedura di anastomosi vena cava (gruppo P-V)4 (Tabella 1) l'anastomosi del vaso ha preso 20,8±1,3 min nel gruppo V-V, che era significativamente più breve rispetto al gruppo P-V (27,5±1,3 min, p<0,01). Anche il tempo caldo di ischemia, il tempo totale di funzionamento del ricevente e il tempo di ripetizione del cuore postoperatorio, che erano rispettivamente 25,5±1,2 min, 42,0±1,5 minuti e 1,1±0,2 minuti, sono stati significativamente abbreviati rispetto a quelli osservati nel gruppo P-V tradizionale (tutti p<0,05)(Figura 1). Anche se non ci sono differenze per i tassi di sopravvivenza di lunga data in questomodello 10,11, la tecnica modificata ha facilitato il trapianto di cuore addominale nei topi con conseguente ischemia calda ridotta e tempo di ribeating cardiaco innestato.
Per quanto riguarda questi dati pubblicati in precedenza e la nostra esperienza con questo modello negli ultimi 16 anni, si consiglia che le fasi chiave dell'operazione prendano un periodo di tempo limitato per garantire un tasso di successo di >90%4. Pertanto, si ottengono risultati ottimali se la raccolta del cuore del donatore non richiede più di 60 minuti, il tempo di ischemia fredda dovrebbe essere limitato a 40 minuti al massimo e la costruzione dell'anastomosi IIVC non dovrebbe richiedere più di 15 minuti in quanto ciò è direttamente associato a un tempo di ischemia calda ridotto.
Figura 1. Confronto dei tempi di procedura tra le due tecniche operative (n =40 ciascuna, media + SE) Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
Figura 2. Preparazione del cuore del donatore utilizzando il tradizionale modello di trapianto di cuore del topo (a, in alto a sinistra) e modificato (b, in basso a sinistra). Le fotografie nei pannelli a e b raffigurano l'aorta (A), l'arteria polmonare (PA), l'atrio destro (RA), l'atrio sinistro (LA) e la vena cava inferiore intratoracica (IIVC) del cuore donatore. Si noti la differenza nella lunghezza della nave dell'AP rispetto all'IIVC. Il pannello c mostra il situs ricevente preparato per l'HTX addominale eterotopico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Anastomosi vascolare del modello modificato: aorta (A), vena cava inferiore intratoracica (IIVC), vena cava inferiore addominale (aivc), aorta addominale (aa). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Dimostrazione della lunghezza del vaso per l'arteria polmonare (PA) e la vena cava inferiore intratoracica (IIVC). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Forma fisiologica della tromba alla fine della vena cava inferiore intratoracica. Aorta (A), vena cava inferiore intratoracica (IIVC), atrio destro (RA), atrio sinistro (LA). La doppia freccia rossa sinistra a sinistra evidenzia il diametro e il cerchio rosso a destra la struttura della forma della tromba. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Da Vena cava a vena cava (nuovo metodo) | Da A polmonare a vena cava (metodo tradizionale) | |
| Approvvigionamento dei donatori (min) | 12.8 + 0.3 | 11.4 + 0.4 |
| Operazione destinatario (min) | 42.0 + 1.5 | 48,6 + 1,4** |
| Anastomosi del vaso (min) | 20.8 + 1.3 | 27,5 + 1,3** |
| Ischemia fredda (min) | 32.8 + 0.6 | 34.2 + 0.7 |
| Ischemia calda (min) | 25.5 + 1.2 | 32,6 + 1,3** |
| Rebeat postoperazione (min) | 1.1 + 0.2 | 2,1 + 0,4* |
| Tasso di successo | 92.50% | 90.00% |
| *P < 0,05 | ||
| **P < 0,01. |
La tabella 1. Confronto tra distribuzioni del tempo e risultati iniziali in due operazioni (n - 40, media + SE)
Ristampato da Wu, K., Zhang, J., Fu, J., Wu, S., Philipp, T., Uwe, H., Kribben, A. and Witzke, O. Nuova tecnica per la ricostruzione del circuito sanguigno nel modello di trapianto di cuore del topo. microchirurgia. 26, 594-598 (2006).
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Discussion
La tecnica chirurgica del trapianto di cuore addominale eterotopico nei topi è molto impegnativa e questo implica una restrizione all'uso diffuso di questo modello.
Uno degli svantaggi della tecnica convenzionale è la lunghezza limite dell'arteria polmonare del donatore (PA). Di solito è di circa 2 mm di lunghezza, mentre la lunghezza dell'IIVC del cuore donatore utilizzato nel nostro modello è generalmente di circa 1 cm(Figura 2). Ciò significa che nel modello modificato, l'anastomosi IIVC offre una visione più chiara dell'operazione situs che consente una migliore chirurgia delle anastomosi e impedisce lo sviluppo indesiderato di suture troppo rigide o addirittura lesioni dannose dei vasi (Figura 4). Sia la costruzione della PA che l'anastomosi IIVC sono impegnative anche per gli operatori esperti. La PA è molto delicata e dalle pareti sottili e l'IIVC è ancora più sottile e potenzialmente più fragile nei topi. Pertanto, gli operatori devono essere consapevoli di questa restrizione e devono prestare attenzione quando socrendono l'IIVC. Tuttavia, a questo punto è importante sottolineare che sebbene la parete del vaso IIVC sia molto sottile, ha il grande vantaggio che la lunghezza del vaso non è associata alla tensione alla connessione del vaso sanguigno, rendendo così l'applicazione di una sutura precisa più facile e meno soggetta a un danno. Poiché l'applicazione cauta e sicura delle suture della nave è molto critica per un esito operativo riuscito, si raccomanda un ingrandimento del situs da 10 a 20 volte.
Inoltre, la fine del segmento toracico dell'IIVC forma una tipica struttura a forma di tromba(Figura 5). Il suo diametro di apertura più grande rappresenta uno dei motivi importanti e vantaggiosamente per cui è possibile scegliere l'IIVC. Il suo utilizzo facilita l'applicazione di un'anastomosi sufficiente. Ciò riduce sia la difficoltà dell'operazione che il tempo di funzionamento.
Un possibile evento che può compromettere l'esito della procedura di trapianto rappresenta una trombosi dell'anastomosi del vaso, spesso favorita da una stenosi. Sebbene nel nostro modello la lunghezza della nave aumenti di proposito, questo non è stato associato alla formazione di trombi. L'anastomosi a forma di tromba dell'IIVC può anche esercitare un effetto positivo riducendo notevolmente il verificarsi di una stenosi anastomotica. Pertanto, per questa procedura non è necessaria un'eparinazione posttrapianto.
Una precedente analisi del metodo dell'anastomosi IVC-aivc ha rivelato diversi vantaggi e miglioramenti rispetto alla tecnica convenzionale10. Rispetto a questi risultati e dal punto di vista retrospettivo della nostra lunga esperienza4,10,12,13,questa tecnica si traduce sia in un'ischemia calda ridotta che in tempi di ribeating del cuore innestato. Anche se non ci sono differenze per i tassi di sopravvivenza di lunga data per questomodello 10, la tecnica modificata qui presentata sta facilitando la ricostruzione del vaso anostomotico riducendo così la difficoltà del trapianto di cuore addominale nei topi. L'addestramento e l'applicazione di questo modello possono quindi migliorare l'accessibilità e l'applicazione diffusa del trapianto di cuore addominale nei topi per scopi immunologici e di ricerca cardiaca.
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Disclosures
nessuno.
Acknowledgments
Ringraziamo la Dott.ssa Yun Xu per il suo aiuto come doppiatore, la Dott.ssa jianhua Peng per il suo aiuto nell'editing video e la dott.ssa Annika Kuckhahn per i suoi commenti e il suo supporto. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) per promuovere collaborazioni internazionali (da HO2581/4-1 ad AH) e dalla National Science Foundation of China (NSFC; #81760291 to FJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G-needles | Braun | 456300 | |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | |
| BALB/c AnNCrl mice | Charles River. Germany | no catalog number | |
| Bepanthen eye ointment | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | |
| Box for insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | |
| C57BL/6J mice | Charles River. Germany | no catalog number | |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | |
| Curved forceps | WPI | 14114-G | |
| custodiol/HTK | Dr. Franz Köhler Chemie | no catalog numer | |
| Cutasept skin disinfection | VWR | BODL980365 | |
| electrosurgical pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | |
| gauze pads, cotton swabs | Lohmann-Rauscher | 13353 | |
| Heating mat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | |
| Hemostatic sponge | CuraSpon | J1276A | |
| heparine-solution | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | |
| Ice box | PETZ | No Catalog Number available | |
| Inhalation anesthesia device | GROPPLER | BKGM 0616 | |
| insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | |
| ketamine | Zoetis | no catalog numer | |
| metamizole | WDT | no catalog numer | |
| Micro scissors | FST | 15000-00,15000-10 | |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm | FST | 18055-06 | |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | |
| Saline solution (NaCl 0.9%) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | |
| Scissors | Peha Instruments | 991083/4 | |
| small Petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| Straight forceps | WPI | 14113-G | |
| surgical tape | BSN | 4120 | |
| Suture Tying Forceps - 10 cm | FST | 18025-10 | |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | |
| Syringe (0.3 mL) | BD | 324826 | |
| Syringe (1 mL) | BD | 320801 | |
| xylazine | Bayer | Rompun |
References
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