Summary
En ny teknik för blod krets återuppbyggnad i en heterotopic buken mus hjärta transplantation modell visas.
Abstract
Den kirurgiska tekniken för heterotopisk bukhjärtatransplantation hos möss är en standardmodell för forskning inom transplantationsimmunologi. Här presenteras den etablerade tekniken för en modifierad blod krets återuppbyggnad i en heterotopic buken hjärtat transplantation modell. Denna metod använder intrathoracic sämre vena cava (IIVC) i stället för pulmonell gatan i donator hjärtat för anastomos till sämre vena cava av mottagaren. Det underlättar och förbättrar framgångsgraden för bukhjärtatransplantation hos möss.
Introduction
Den kirurgiska tekniken för heterotopisk bukhjärtatransplantation hos möss representerar en standardmodell för forskning inom transplantationsimmunologi1,2,3. Det är dock mycket utmanande att utföra och detta innebär en begränsning till den utbredda användningen av denna modell4,5.
Vid traditionell mushjärtatransplantation (THTx) är donatoraortan och mottagaren bukaorta anastomosed medan lungartären är anastomosed till mottagaren sämre vena cava6,7,8.
I denna modifierade mushjärta transplantation teknik, donator storastomosed till mottagaren buken stora och givaren IIVC är anastomosed till mottagaren sämre vena cava(3,4,6) ( Figur2 och Figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med riktlinjerna i Europaparlamentets direktiv 2010/63/EU om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål (etikkommittén godkände #G1071/09).
OBS: Preliminär förberedelse, anestesi, postoperativ vård och övervakningsarbete är desamma som utförs i traditionella kirurgiska metoder1,2,4. BALB/c möss fungerade som hjärtdonatorer och C57BL/6J som transplantationsmottagare. Möss var i åldern 8-12 veckor, vägde ~ 30 g vid transplantation och var inhyst under standardförhållanden.
1. Förberedande steg
- För anestesi, ge möss inhalativ isofluran (2%) tills de somnar, följt av intraperitoneal injektioner av ketamin (100 mg/kg) + xylazin (10 mg/kg) + acepromazin (2 mg/kg). För postoperativ analgesi, applicera Metamizol (200 mg/kg) p.o. och Carprofen (5 mg/kg) s.c..
OBS: Appliceringen av antibiotika avstod från att användas med flit eftersom dessa ämnen kan påverka immunologiska reaktioner. - För operation, använd en uppsättning mikroskopiska instrument inklusive en mikrosax, mikrotång, en nålhållare och mikro hemostatiska klämmor. En elektrokirurgisk penna är också nödvändig. Utför suturer med 7/0er, 10/0er och 4/0er nylontyper.
- Placera musen i en låda för isofluraninandning (2%) i 40-60 sekunder. Bestäm anestesidjupet genom att klämma tassen med pincett. Om det finns en fullständig brist på svar för denna stimulans, gå till nästa steg.
- När musen har somnat, väg musen.
- Applicera en intraperitoneal injektion av ketamin (100 mg/kg) + xylazin (10 mg/kg) + acepromazin (2 mg/kg) på den bedövade musen.
- Klipp bukpälsen och placera musen på operationsbordet. Utför desinfektion med povidone iodide i 3 gånger och drapera sedan musen ordentligt med en fenestrated kirurgisk handduk.
2. Förfarande för givaroperation
- Använd sax för att skära huden från nacken till underlivet och skala av hela hudskiktet till mitten av båda axillerna.
- Använd sax för att skära musklerna i bukväggen och försiktigt flytta inälvorna till vänster (från operatörens synvinkel). Linda in inälvorna med en saltlösning imbibed gasväv för att säkert exponera den sämre vena cava.
- Använd en 1 ml spruta för att injicera 0,4 ml heparinlösning (innehåller 500 U heparin) långsamt i den nedre vena cava och vänta i 1 minut innan du drar ut nålen.
- Dra ut nålen och använd en mikrosax för att skära både den sämre vena cava och buken aorta för att påskynda exsanguination.
- Använd sax för att öppna brösthålan genom att utföra ett u-format snitt; helt exponera hjärtat, lungorna och alla bröstblodkärl.
- Exponera bröstaortan, skär 1/2 av lumen och skär sedan lungvenen för att underlätta bevattning och dränering.
- Sätt in ett bevattningsrör i öppningen av bröstaorta, injicera minst 2 ml 4 °C kall histidin-tryptofan-ketoglutarate kardipelgilösning (Custodiol HTK-lösning)9 tills lungvenutflödet är helt klart och hjärtat slutar helt slå.
- Dra ut bevattningsröret och lossa bröstbenet.
- Använd mikrosax för att ta bort tymusen och för att ta bort fettet något runt aortabågen.
- Använd raka och böjda tång för att exponera och ligate stammen av arteria pulmonalis (på höger sida av aortabågen) med en 10/0 sutur.
- Använd mikrotångor för att separera fettet och bindväven som är fäst vid IIVC, exponera och ligate den överlägsna vena cava (på vänster sida av aortabågen) med en 7/0 sutur och använd mikrosax för att skära den bakom ligaturen.
- Gör en 7/0 sutur runt basen av hjärtat under aortabågen, IIVC och båda öronen. Ligate sedan lungartärgrenarna och venösa lungkärlen.
- Använd mikrosax för att transsekera aortabågen så distal som möjligt, lungkärlen under ligaturen och IIVC nära membranet. Ta ut hjärtat ur bröstet.
- Placera den explanterade donatorns hjärta i 4 °C kall HTK kardipelgilösning och bevara tillfälligt.
3. Förfarande för mottagarens drift
OBS: De första operationstegen liknar de som tidigare visats för donatormusen, inklusive anestesi och desinfektion.
- Utför bukhuden skuren på ett tvärgående sätt, täck bukorganen med en våt gasväv med saltlösning.
- Använd mikrotångor för att exponera sämre vena cava och bukaorta och befria dem från omgivande fettvävnad.
- Använd mikrotångor för att ligate eller elektrocauterize sidogrenkärl (laterala eller under venen/aortan) under njurkärlen.
- Använd klämapplikatortångar för att placera två mikro hemostatiska klämmor vid bukdelen av ven/aorta som kommer från höger och lämnar mer än 1 cm avstånd för både aorta/ven för att säkerställa utrymme för konstruktion av anastomosen mellan dem.
- Använd mikrosax för att göra ett snitt i aortan lite närmare den nedre klämman än till den övre klämman. Alternativt kan du använda en 30 G nål för att göra ett litet hål och öppna det med mikrosax.
- Placera mottagarmusen så att aortan är vänd mot operatören med vena cava på andra sidan. Placera sedan hjärtat i bukhålan och täck det med en liten våt gasväv.
- Använd en sutur dygnet runt för att anpassa och sy donatoraortan till mottagarens aorta som börjar kaudally, gör en knut och fortsätt med en löpande sutur till toppen av snittet (ca 4-5 stygn). Vänd sedan hjärtat till höger (från motivets synvinkel), täck det igen och fortsätt suturen på vänster sida tills du når kaudala änden och knut den.
- Använd ett bevattningsrör för att injicera minst 0,5 ml 4 °C HTK kardipelgilösning för att spola donatorns IIVC.
- Använd mikrosax för att skära ett runt hål på mottagarens underlägsna vena cava i buken, som bör ha samma storlek som donatorerna IIVC lumen. Snittet ska placeras ovanför den aorta anastomotiska öppningen. Gör vensnittet större än det aortasnittet.
- Använd en 10/0 sutur för att sy donatorn IIVC till mottagaren vena cava börjar kaudally. Knyt en knut och utför en löpsutur tills snittets överst har nåtts. Använd fem stygn och fortsätt suturen till vänster. Slutligen knyta en knut i svanshörnet och dra försiktigt åt (var försiktig så att du inte drar för hårt).
- Placera de små delarna av den hemostatiska svampen runt venen och aorta anastomoserna.
- Använd klämapplikatortångar för att först ta bort de nedre och sedan de övre mikrohemostatiska klämmorna och skölj bukhålan med 38,0 °C härdat 0,9% natriumklorid.
- Använd mikrotångor för att ta bort den hemostatiska svampen.
- Observera hjärtslagen i det transplanterade hjärtat.
- Använd tång för att sätta tarmarna tillbaka i bukhålan och tvåskikts suturer (bukmuskler följt av hud) för att stänga buksåret med en 4/0 sutur.
- Sätt mössen i en arbetsstationskammare för syre- och temperaturkontroll (t.ex. INVIVO2-400) för att ge en varm och syrerik miljö för de transplanterade mössen att återhämta sig, vänta på att mössen vaknar.
- För postoperativa smärtstillande medel, ge direkt Metamizol 200 mg/kg per os efter drift. Fyra och 16 timmar efter drift ge Metamizol 200 mg/kg per os+ Carprofen (5mg/kg) s.c. I den fortsatta uppföljningen, ge Carprofen (5 mg/kg) s.c till de transplanterade mössen var 24: e timme i tre på varandra följande dagar efter operationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här presenteras en modifierad teknik för heterotopisk bukhjärtatransplantation hos möss som tidigare har utvecklats i vårt laboratorium och har visat sig användbar under de senaste 16 åren. Tidigare rapporterades det att totalt 40 fall av vena cava till vena cava (V-V grupp) jämfört med 40 fall av den traditionella pulmonell gatan till vena cava (P-V grupp) anastomosförfarande 4 (tabell 1) fartyget anastomos tog 20,8±1,3 min i V-V gruppen, som var betydligt kortare än i P-V-gruppen (27,5±1,3 min, p<0,01). Den varma ischemitiden, den totala mottagartiden och den postoperativa hjärtrepetitionstiden, som var 25±1,2 min, 42,0±1,5 min respektive 1,1±0,2 min, förkortades också betydligt än vad som observerades i den traditionella P-V-gruppen (alla p<0,05) (figur 1). Även om det inte finns några skillnader för långvarig överlevnad i denna modell10,11, underlättade den modifierade tekniken bukhjärtatransplantation hos möss vilket resulterade både i en minskad varm ischemi och ympad hjärtrebeatingtid.
När det gäller dessa tidigare publicerade data och vår erfarenhet av denna modell under de senaste 16 åren rekommenderar vi att de viktigaste driftsstegen tar en begränsad tid för att säkerställa en framgångsgrad på >90%4. Därför uppnås optimala resultat om skörden av donatorhjärtat inte tar längre tid än 60 minuter, den kalla ischemitiden bör begränsas till högst 40 minuter, och byggandet av IIVC-anastomos bör inte ta längre tid än 15 minuter eftersom detta är direkt förknippat med en minskad varm ischemitid.
Figur 1. Jämförelse av procedurtider mellan de två driftsteknikerna (n =40 vardera, medelvärde + SE) Klicka här för att se en större version av den här siffran.
Figur 2. Donatorhjärta förberedelse med den traditionella (a, övre vänstra) och den modifierade (b, nedre vänstra) mus hjärtat transplantation modell. Fotografierna i panelerna a och b visar aortan (A), lungartären (PA), det högra atriumet (RA), det vänstra atriumet (LA) och donatorhjärtats intrathoracic inferior vena cava (IIVC). Lägg märke till skillnaden i fartygslängd för det uttriska organet jämfört med IIVC. Panel c visar mottagaren situs beredd för den heterotopiska buken HTX. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3. Vaskulär anastomos av den modifierade modellen: aorta (A), intrathoracic inferior vena cava (IIVC), buken sämre vena cava (aivc), buken stora kroppspulsådern (aa). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4. Demonstration av kärllängd för lungartären (PA) och intrathoracic inferior vena cava (IIVC). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5. Fysiologisk trumpet form i slutet av intrathoracic sämre vena cava. Aorta (A), intrathoracic inferior vena cava (IIVC), höger atrium (RA), vänster atrium (LA). Den vänstra röda dubbelpilen till vänster belyser diametern och den röda cirkeln till höger basunformens struktur. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Vena cava till vena cava (ny metod) | Lunga A till vena cava(traditionell metod) | |
| Upphandling av givare (min) | 12.8 + 0.3 | 11.4 + 0.4 |
| Mottagaråtgärd (min) | 42.0 + 1.5 | 48.6 + 1.4** |
| Kärl anastomos (min) | 20.8 + 1.3 | 27,5 + 1,3** |
| Kall ischemi (min) | 32.8 + 0.6 | 34.2 + 0.7 |
| Varm ischemi (min) | 25.5 + 1.2 | 32.6 + 1.3** |
| Rebeat postoperation (min) | 1.1 + 0.2 | 2.1 + 0.4* |
| Framgångsgrad | 92.50% | 90.00% |
| *P < 0,05 | ||
| **P < 0,01. |
Tabell 1. Jämförelse av tidsfördelningar och initiala resultat i två operationer (n - 40, medelvärde + SE)
Omtryckt från Wu, K., Zhang, J., Fu, J., Wu, S., Philipp, T., Uwe, H., Kribben, A. och Witzke, O. Ny teknik för blodcirkulation i mushjärtatransplantation modell. Mikrokirurgi. 26, 594-598 (2006).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den kirurgiska tekniken för heterotopic buken hjärtat transplantation hos möss är mycket utmanande och detta innebär en begränsning till den utbredda användningen av denna modell.
En av nackdelarna med den konventionella tekniken är den begränsande längden på givarens lungartär (PA). Den är vanligtvis ca 2 mm lång, medan längden på IIVC för donatorhjärtat som används i vår modell i allmänhet är ca 1 cm (Figur 2). Det innebär att IIVC-anastomosen i den modifierade modellen ger en klarare bild av operationen situs som möjliggör förbättrad kirurgi av anastomoser och förhindrar oönskad utveckling av för strikta suturer eller till och med skadliga skador på kärlen (figur 4). Både byggandet av PA och IIVC-anastomosen är utmanande även för erfarna operatörer. PA är mycket känslig och tunnväggig och IIVC är ännu tunnare och potentiellt bräckligare hos möss. Operatörerna måste därför vara medvetna om denna begränsning och bör vara försiktiga när de sutulerar IIVC. Vid denna tidpunkt är det dock viktigt att betona att även om IIVC-kärlväggen är mycket tunn, har den den stora fördelen att kärlets längd inte är förknippad med spänning i blodkärlsanslutningen, vilket gör tillämpningen av en exakt sutur lättare och mindre benägen för en skada. Eftersom försiktig och säker applicering av fartyget suturer är mycket kritiska för ett framgångsrikt driftresultat, rekommenderas en förstoring av situs av 10 till 20-faldigt.
Dessutom bildar slutet på bröstsegmentet i IIVC en typisk trumpetformad struktur (figur 5). Dess större öppningsdiameter representerar en av de viktiga och fördelaktiga orsakerna till att IIVC kan väljas. Dess användning underlättar tillämpningen av en tillräcklig anastomos. Detta minskar både svårigheten med åtgärden och driftstiden.
En möjlig händelse som kan äventyra resultatet av transplantation förfarandet representerar en blodpropp av fartyget anastomos, ofta främjas av en stenos. Även om fartygets längd i vår modell ökar med flit, var detta inte förknippat med bildandet av trombin. Trumpet formad anastomos av IIVC kan också utöva en positiv effekt samtidigt kraftigt minska förekomsten av en anastomotic pylorusstenos. Därför är för detta förfarande en posttransplant heparinization inte nödvändig.
En tidigare analys av IVC-aivc anastomos metod visade flera fördelar och förbättringar jämfört med den konventionella tekniken10. Med avseende på dessa resultat och ur retrospektiv synvinkel av vår långvarigaerfarenhet 4,10,12,13, resulterar denna teknik både i en minskad varm ischemi och rebeating tid för det ympade hjärtat. Även om det inte finns några skillnader för långvarig överlevnad för denna modell10, underlättar den modifierade tekniken som presenteras här den anostomotiska fartygsrekonstruktionen och minskar därmed svårigheten med bukhjärtatransplantation hos möss. Utbildning och tillämpning av denna modell kan därför förbättra tillgängligheten och utbredd tillämpning av bukhjärtatransplantation hos möss för immunologiska såväl som hjärtforskningsändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ingen.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Yun Xu för hennes hjälp som röstskådespelare, Dr. med. Jianhua Peng för hennes hjälp med videoredigering och Dr. Annika Kuckhahn för hennes kommentarer och stöd. Detta arbete stöddes delvis av den tyska forskningsstiftelsen (DFG) för att främja internationella samarbeten (HO2581/4-1 till AH) och National Science Foundation of China (NSFC; #81760291 till FJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G-needles | Braun | 456300 | |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | |
| BALB/c AnNCrl mice | Charles River. Germany | no catalog number | |
| Bepanthen eye ointment | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | |
| Box for insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | |
| C57BL/6J mice | Charles River. Germany | no catalog number | |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | |
| Curved forceps | WPI | 14114-G | |
| custodiol/HTK | Dr. Franz Köhler Chemie | no catalog numer | |
| Cutasept skin disinfection | VWR | BODL980365 | |
| electrosurgical pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | |
| gauze pads, cotton swabs | Lohmann-Rauscher | 13353 | |
| Heating mat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | |
| Hemostatic sponge | CuraSpon | J1276A | |
| heparine-solution | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | |
| Ice box | PETZ | No Catalog Number available | |
| Inhalation anesthesia device | GROPPLER | BKGM 0616 | |
| insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | |
| ketamine | Zoetis | no catalog numer | |
| metamizole | WDT | no catalog numer | |
| Micro scissors | FST | 15000-00,15000-10 | |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm | FST | 18055-06 | |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | |
| Saline solution (NaCl 0.9%) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | |
| Scissors | Peha Instruments | 991083/4 | |
| small Petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| Straight forceps | WPI | 14113-G | |
| surgical tape | BSN | 4120 | |
| Suture Tying Forceps - 10 cm | FST | 18025-10 | |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | |
| Syringe (0.3 mL) | BD | 324826 | |
| Syringe (1 mL) | BD | 320801 | |
| xylazine | Bayer | Rompun |
References
- Corry, R., Winn, H., Russell, P. Primarily vascularized allografts of heart in mice. Transplantation. 16, 343-350 (1973).
- Habertheuer, A., et al. Donor tissue-specific exosome profiling enables noninvasive monitoring of acute rejection in mouse allogeneic heart transplantation. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (6), 2479-2489 (2018).
- Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. Journal of Investigative Surgery. 26, 223-228 (2013).
- Wu, K., et al. Novel technique for blood circuit reconstruction in mouse heart transplantation model. Microsurgery. 26, 594-598 (2006).
- Alamran, F. G., Shahkolahi, M. M. Total arterial anastomosis heterotopic heart transplantation model. Transplantation Proceedings. 45, 625-629 (2013).
- Melanie, L., et al. Potential of Heterotopic Cardiac Transplantation in Mice as a Model for Elucidating Mechanisms of Graft Rejection. Cardiac Transplantation. Moffatt-Bruce, S. D., et al. , IntechOpen (2012).
- Westhofen, S., et al. The heterotopic heart transplantation in mice as a small animal model to study mechanical unloading - Establishment of the procedure, perioperative management and postoperative scoring. PLoS One. 14 (4), 0214513 (2019).
- Wang, C., Wang, Z., Allen, R., Bishop, G. A., Sharland, A. F. A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion. Journal of Visualized Experiments. (88), e51423 (2014).
- Mokbel, M., et al. Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate Solution for Donor Heart Preservation Is Safe for Transplantation. Annals of Thoracic Surgery. 109 (3), 763-770 (2020).
- Song, S., et al. Modified Suture Technique in a Mouse Heart Transplant Model. Asian Journal of Surgery. 34 (2), 86-91 (2011).
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28 (7), 565-570 (2008).
- Wu, K., et al. cold storage using a new histidine-tryptophan-ketoglutarate-based preservation solution in isogeneic cardiac mouse grafts. European Heart Journal. 32 (4), 509-516 (2011).
- Türk, T. R., et al. Reduction of chronic graft injury with a new HTK-based preservation solution in a murine heart transplantation model. Cryobiology. 64 (3), 273-278 (2012).
