Summary
En ny teknik til blod kredsløb genopbygning i en heterotopisk abdominal mus hjertetransplantation model er demonstreret.
Abstract
Den kirurgiske teknik heterotop abdominal hjertetransplantation hos mus er en standardmodel for forskning i transplantation immunologi. Her præsenteres den etablerede teknik til en modificeret blodkredsløbsrekonstruktion i en heterotopisk abdominal hjertetransplantationsmodel. Denne metode bruger intrathoracic ringere vena cava (IIVC) i stedet for lungearterien af donorhjertet for anastomose til modtagerens ringere vena cava. Det letter og forbedrer succesraten for mavehjertetransplantation hos mus.
Introduction
Den kirurgiske teknik heterotop abdominal hjertetransplantation hos mus repræsenterer en standardmodel for forskning i transplantation immunologi1,2,3. Det er dog meget udfordrende at udføre, og dette implicerer en begrænsning af den udbredte brug af denne model4,5.
I traditionel musehjertetransplantation (THTx) anastomosed donor aorta og modtageren abdominal aorta, mens lungepulsåren er anastomosed til modtageren ringere vena cava6,7,8.
I denne modificerede musehjertetransplantationsteknik anastomosed donor aorta til modtageren abdominal aorta, og donorEN IIVC er anastomosed til modtageren ringere vena cava(3,4,6) ( Figur2 og figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i retningslinjerne i Europa-Parlamentets direktiv 2010/63/EU om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål (Ethic-komitéen godkendte, #G1071/09).
BEMÆRK: Indledende forberedelse, anæstesi, postoperativ pleje og overvågningsarbejde er de samme som udført i traditionelle kirurgiske metoder1,2,4. BALB/c mus fungerede som hjertedonorer og C57BL/6J som transplantationsmodtagere. Mus var i alderen 8-12 uger, vejede ~ 30 g ved transplantation og blev opstaldet under standardforhold.
1. Forberedende foranstaltninger
- For anæstesi, give mus inhalativ isoflurane (2%) indtil de falder i søvn, efterfulgt af intraperitoneale injektioner af ketamin (100 mg/kg) + xylazin (10 mg/kg) + acepromazin (2 mg/kg). For postoperativ analgesi anvendes Metamizol (200 mg/kg) p.o. og Carprofen (5 mg/kg) s.c..
BEMÆRK: Anvendelsen af antibiotika blev afholdt med vilje, da disse stoffer kan påvirke immunologiske reaktioner. - Til kirurgi skal du bruge et sæt mikroskopiske instrumenter, herunder en mikro-saks, mikro-pincet, en nålholder og mikro hemostatic klemmer. En elektrokirurgisk pen er også nødvendig. Udfør suturer ved hjælp af 7/0er, 10/0er og 4/0er nylon typer.
- Placer musen i en kasse til isofluraninhalation (2%) i 40-60 sekunder. Bestem anæstesiens dybde ved at klemme poten med pincet. Hvis der er en fuldstændig mangel på respons på denne stimulus, skal du gå til næste trin.
- Når musen er faldet i søvn, skal du veje musen.
- Påfør en intraperitoneal injektion af ketamin (100 mg/kg) + xylazin (10 mg/kg) + acepromazin (2 mg/kg) på den bedøvede mus.
- Klip abdominal pelsen og læg musen på operationsbordet. Udfør desinfektion ved hjælp af povidone-jod i 3 gange, og draper derefter musen korrekt ved hjælp af et fenestrated kirurgisk håndklæde.
2. Procedure for donordrift
- Brug en saks til at skære huden fra halsen til underlivet, og skræl hele lag af huden til midterlinjen af begge axillae.
- Brug en saks til at skære musklerne i bugvæggen og forsigtigt flytte indvolde til venstre (fra operatørens opfattelse). Wrap væk indvolde med en saltvand imbibed gaze til sikkert at udsætte ringere vena cava.
- Brug en 1 ml sprøjte til at injicere 0,4 ml af heparinopløsningen (indeholder 500 U heparin) langsomt ind i den nederste vena cava og vent i 1 minut, før du trækker nålen ud.
- Træk nålen ud og brug en mikro-saks til at skære både ringere vena cava og abdominal aorta at fremskynde exsanguination.
- Brug en saks til at åbne brysthulen ved at udføre et u-formet snit; fuldstændigt udsætte hjertet, lungerne og alle brystblodkar.
- Udsæt bryst aorta, skær 1/2 af lumen, og skær derefter lungeåren for at lette kunstvanding og dræning.
- Et vandingsrør indsættes i åbningen af thoracic aorta, der injiceres mindst 2 ml 4 °C kold histidin-tryptophan-ketoglutarat cardioplegiopløsning (Custodiol HTK-opløsning)9, indtil lungeårens udstrømning er helt klar, og hjertet helt holder op med at slå.
- Træk vandingsrøret ud og tag brystbenet af.
- Brug mikro saks til at fjerne thymus og til lidt fratage fedt omkring aorta bue.
- Brug lige og buede pincet til at eksponere og ligate stammen af arterien pulmonalis (på højre side af aortabuen) med en 10/0 sutur.
- Brug mikro pincet til at adskille fedt og bindevæv knyttet til IIVC, eksponere og ligate den overlegne vena cava (på venstre side af aorta bue) med en 7 / 0 sutur og bruge mikro saks til at skære det bag ligationen.
- Lav en 7/0 sutur omkring bunden af hjertet under aortabuen, IIVC og begge aurikler. Derefter ligate lungepulsåren grene og venøse lungekar.
- Brug mikrosaks til at transektere aortabuen så distalt som muligt, lungekarrene under ligaturen og IIVC nær mellemgulvet. Fjern hjertet ud af brystet.
- Den udplantede donors hjerte anbringes i en 4 °C kold HTK-kardioplegiopløsning, og bevar den midlertidigt.
3. Procedure for operation af modtagere
BEMÆRK: De indledende operationstrin svarer til dem, der tidligere er vist for donormusen, herunder anæstesi og desinfektion.
- Udfør abdominal hud skåret på en tværgående måde, dække abdominal organer med en våd gaze ved hjælp af saltvand løsning.
- Brug mikro pincet til at udsætte ringere vena cava og abdominal aorta og befri dem fra omkringliggende fedtvæv.
- Brug mikrokraft til at ligate eller elektrokauterisere sidegrensbeholdere (laterale eller under venen/aorta) under nyrebeholderne.
- Brug klipapplikator-pincet til at placere to mikro hemostatic klemmer i abdominal del af venen / aorta, der kommer fra højre forlader mere end 1 cm afstand for både aorta / vene for at sikre plads til opførelsen af anastomose i mellem dem.
- Brug mikro saks til at gøre et snit i aorta lidt tættere på den nederste klemme end til den øverste klemme. Alternativt kan du bruge en 30 G nål til at lave et lille hul og åbne det op med mikro saks.
- Placer modtagermusen, så aorta vender mod operatøren med vena cava på den anden side. Placer derefter hjertet i bughulen og dæk det med en lille våd gazepude.
- Brug en 10/0 sutur til at tilpasse og sy donor aorta til modtageren aorta starter caudally, lave en knude og fortsætte med en løbende sutur til toppen af snittet (ca. 4-5 sting). Vend derefter hjertet over til højre (fra motivets visning), dæk det igen og fortsæt suturen på venstre side, indtil du når den kaudale ende og knuder den.
- Brug et vandingsrør til at injicere mindst 0,5 ml 4 °C HTK-kardioplegiopløsning for at skylle donorens IIVC.
- Brug mikro-saks til at skære et rundt hul på abdominal ringere vena cava af modtageren, som skal have samme størrelse af donorerne IIVC lumen. Snittet skal være placeret over den aorta anastomotiske åbning. Gør veneindsnittet større end det aorta-snit.
- Brug en 10/0 sutur til at sy donorEN IIVC til modtageren vena cava starter caudally. Bind en knude og udfør en løbende sutur, indtil toppen af snittet er nået. Brug fem sting og fortsæt suturen til venstre. Endelig binde en knude i halen hjørne, og omhyggeligt stramme (pas på ikke at trække for stramt).
- Placer de små dele af den hemostatic svamp omkring venen og aorta anastomoses.
- Brug klipapplikatorcapplikatorer til først at fjerne de nedre og derefter de øvre mikro-hemostatic klemmer og skyl bukhulen med 38,0 °C hærdet 0,9% natriumchlorid.
- Brug mikro pincet til at fjerne den hemostatic svamp.
- Overhold hjerteslag af transplanterede hjerte.
- Brug pincet til at sætte tarmene tilbage i bughulen og to-lags suturer (mavemuskler efterfulgt af hud) for at lukke mavesåret med en 4 / 0 sutur.
- Sæt musene i et ilt- og temperaturkontrolarbejdsstationskammer (f.eks. INVIVO2-400) for at give et varmt og iltrigt miljø, hvor de transplanterede mus kan komme sig, vent på, at musene vågner op.
- For postoperativ analgesi, direkte give Metamizol 200 mg/kg pr os efter operation. Fire og 16 timer efter operationen giver Metamizol 200 mg/kg pr. os+ Carprofen (5 mg/kg) s.c. I den videre opfølgning skal du give Carprofen (5 mg/kg) s.c til de transplanterede mus hver 24. time i tre på hinanden følgende dage efter operationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her præsenteres en modificeret teknik med heterotop abdominal hjertetransplantation hos mus, der tidligere er udviklet i vores laboratorium og har vist sig nyttig i de sidste 16 år. Tidligere blev det rapporteret, at i alt 40 tilfælde af vena cava til vena cava (V-V-gruppen) sammenlignet med 40 tilfælde af den traditionelle lungearterie til vena cava (P-V-gruppe) anastomose procedure4 (Tabel 1) tog fartøjet anastomose 20,8±1,3 min i V-V-gruppen, som var betydeligt kortere end i P-V-gruppen (27,5 ±1,3 min, p<0,01). Den varme iskæmitid, den samlede driftstid for modtageren og den postoperative hjertes gentagelsestid, som var henholdsvis 25,5±1,2 min± 42,0±1,5 minutter og 1,1±0,2 min. blev også væsentligt afkortet end observeret i den traditionelle P-V-gruppe (alle p<0,05) (figur 1). Selv om der ikke er nogen forskelle for mangeårige overlevelsesrater i denne model10,11, den modificerede teknik lettet abdominal hjertetransplantation i mus resulterer både i en reduceret varm iskæmi og podet hjerte rebeating tid.
Med hensyn til disse tidligere offentliggjorte data og vores erfaring med denne model inden for de sidste 16 år anbefaler vi, at de vigtigste operation skridt bør tage en begrænset mængde tid til at sikre en succesrate på >90%4. Derfor opnås optimale resultater, hvis høsten af donorhjertet ikke tager længere end 60 minutter, den kolde iskæmitid bør begrænses til maksimalt 40 minutter, og opførelsen af IIVC-anastomose bør ikke tage længere end 15 minutter, da dette er direkte forbundet med en reduceret varm iskæmitid.
Figur 1. Sammenligning af proceduretider mellem de to betjeningsteknikker (n =40 hver, middelværdi + SE) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Donor hjerte forberedelse ved hjælp af den traditionelle (a, øverst til venstre) og den modificerede (b, nederst til venstre) mus hjertetransplantation model. Fotografierne i paneler a og b skildrer aorta (A), lungepulsåren (PA), højre atrium (RA), den venstre atrium (LA) og intrathoracic ringere vena cava (IIVC) af donorhjertet. Bemærk forskellen i fartøjslængden for pa i forhold til IIVC. Panel c viser modtageren situs forberedt til heterotop abdominal HTX. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Vaskulær anastomose af den modificerede model: aorta (A), intrathoracic ringere vena cava (IIVC), abdominal ringere vena cava (aivc), abdominal aorta (aa). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Påvisning af fartøjets længde for lungepulsåren (PA) og intrathoracic ringere vena cava (IIVC). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Fysiologisk trompet form i slutningen af intrathoracic ringere vena cava. Aorta (A), intrathoracic ringere vena cava (IIVC), højre atrium (RA), venstre atrium (LA). Den venstre røde dobbeltpil til venstre fremhæver diameteren og den røde cirkel til højre strukturen af trompetform. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Vena cava til vena cava (ny metode) | Lunge A til vena cava (traditionel metode) | |
| Donorindkøb (min.) | 12.8 + 0.3 | 11.4 + 0.4 |
| Modtagerhandling (min.) | 42.0 + 1.5 | 48,6 + 1,4** |
| Kar anastomose (min. ) | 20.8 + 1.3 | 27,5 + 1,3** |
| Kold iskæmi (min. ) | 32.8 + 0.6 | 34.2 + 0.7 |
| Varm iskæmi (min. ) | 25.5 + 1.2 | 32,6 + 1,3** |
| Rebeat postoperation (min) | 1.1 + 0.2 | 2.1 + 0,4* |
| Succesrate | 92.50% | 90.00% |
| *P < 0,05 | ||
| **P < 0,01. |
Tabel 1. Sammenligning af tidsfordelinger og indledende resultater i to operationer (n - 40, middelværdi + SE)
Genoptrykt fra Wu, K., Zhang, J., Fu, J., Wu, S., Philipp, T., Uwe, H., Kribben, A. og Witzke, O. Novel teknik til blodkredsløb genopbygning i musen hjertetransplantation model. Mikrokirurgi. 26, 594-598 (2006).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den kirurgiske teknik heterotop abdominal hjertetransplantation hos mus er meget udfordrende, og dette implicerer en begrænsning af den udbredte brug af denne model.
En af ulemperne ved den konventionelle teknik er den begrænsende længde af donorens lungepulsåre (PA). Det er normalt på ca. 2 mm længde, mens længden af IIVC af donorhjertet, der anvendes i vores model, generelt er ca. 1 cm (figur 2). Det betyder, at i den ændrede model giver IIVC-anastomose et klarere syn på operations situs, der muliggør forbedret kirurgi af anastomoser og forhindrer uønsket udvikling af for strenge suturer eller endda skadelige læsioner af fartøjerne (Figur 4). Både konstruktionen af PA samt IIVC-anastomose er udfordrende selv for erfarne operatører. PA er meget delikat og tyndvægget, og IIVC er endnu tyndere og potentielt mere skrøbelig hos mus. Operatørerne skal derfor være opmærksomme på denne begrænsning og bør udvise forsigtighed, når de syr IIVC. På dette tidspunkt er det dog vigtigt at understrege, at selv om IIVC-karvæggen er meget tynd, har den den store fordel, at karlængden ikke er forbundet med spænding til blodkarforbindelsen, hvilket gør anvendelsen af en præcis sutur lettere og mindre tilbøjelig til en skade. Da den forsigtige og sikre anvendelse af fartøjets suturer er meget kritisk for et vellykket driftsresultat, anbefales en forstørrelse af situs på 10 til 20 gange.
Desuden danner afslutningen af brystsegmentet i IIVC en typisk trompetformet struktur (figur 5). Dens større åbningsdiameter repræsenterer en af de vigtige og gavnlige grunde til, at IIVC kan vælges. Dens anvendelse letter anvendelsen af en tilstrækkelig anastomose. Dette reducerer både operationens sværhedsgrad og driftstiden.
En mulig begivenhed, der kan kompromittere resultatet af transplantationsproceduren, repræsenterer en trombose af fartøjets anastomose, ofte fremmet af en stenose. Selvom fartøjets længde i vores model stiger med vilje, var dette ikke forbundet med dannelsen af thrombi. Den trompetformede anastomose af IIVC kan også udøve en positiv effekt og samtidig i høj grad reducere forekomsten af en anastomotisk stenose. Derfor er en posttransplant heparinisering ikke nødvendig for denne procedure.
En tidligere analyse af IVC-aivc-anastomosemetoden afslørede flere fordele og forbedringer sammenlignet med den konventionelle teknik10. Med hensyn til disse resultater og fra det retrospektive synspunkt af vores mangeårige erfaring4,10,12,13, resulterer denne teknik både i en reduceret varm iskæmi og rebeating tid af podet hjerte. Selvom der ikke er nogen forskelle for overlevelsesrater i lang tid for denne model10, letter den modificerede teknik, der præsenteres her, den anostomotiske fartøjsrekonstruktion og reducerer dermed vanskeligheden ved abdominal hjertetransplantation hos mus. Træning og anvendelse af denne model kan derfor forbedre tilgængeligheden og den udbredte anvendelse af mavehjertetransplantation hos mus til immunologiske såvel som hjerteforskningsformål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ingen.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Yun Xu for hendes hjælp som stemme skuespiller, Dr. med. Jianhua Peng for hendes hjælp i videoredigering og Dr. Annika Kuckhahn for hendes kommentarer og støtte. Dette arbejde blev delvist støttet af den tyske forskningsfond (DFG) for at fremme internationalt samarbejde (HO2581/4-1 til AH) og National Science Foundation of China (NSFC; #81760291 til FJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G-needles | Braun | 456300 | |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | |
| BALB/c AnNCrl mice | Charles River. Germany | no catalog number | |
| Bepanthen eye ointment | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | |
| Box for insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | |
| C57BL/6J mice | Charles River. Germany | no catalog number | |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | |
| Curved forceps | WPI | 14114-G | |
| custodiol/HTK | Dr. Franz Köhler Chemie | no catalog numer | |
| Cutasept skin disinfection | VWR | BODL980365 | |
| electrosurgical pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | |
| gauze pads, cotton swabs | Lohmann-Rauscher | 13353 | |
| Heating mat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | |
| Hemostatic sponge | CuraSpon | J1276A | |
| heparine-solution | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | |
| Ice box | PETZ | No Catalog Number available | |
| Inhalation anesthesia device | GROPPLER | BKGM 0616 | |
| insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | |
| ketamine | Zoetis | no catalog numer | |
| metamizole | WDT | no catalog numer | |
| Micro scissors | FST | 15000-00,15000-10 | |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm | FST | 18055-06 | |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | |
| Saline solution (NaCl 0.9%) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | |
| Scissors | Peha Instruments | 991083/4 | |
| small Petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| Straight forceps | WPI | 14113-G | |
| surgical tape | BSN | 4120 | |
| Suture Tying Forceps - 10 cm | FST | 18025-10 | |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | |
| Syringe (0.3 mL) | BD | 324826 | |
| Syringe (1 mL) | BD | 320801 | |
| xylazine | Bayer | Rompun |
References
- Corry, R., Winn, H., Russell, P. Primarily vascularized allografts of heart in mice. Transplantation. 16, 343-350 (1973).
- Habertheuer, A., et al. Donor tissue-specific exosome profiling enables noninvasive monitoring of acute rejection in mouse allogeneic heart transplantation. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (6), 2479-2489 (2018).
- Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. Journal of Investigative Surgery. 26, 223-228 (2013).
- Wu, K., et al. Novel technique for blood circuit reconstruction in mouse heart transplantation model. Microsurgery. 26, 594-598 (2006).
- Alamran, F. G., Shahkolahi, M. M. Total arterial anastomosis heterotopic heart transplantation model. Transplantation Proceedings. 45, 625-629 (2013).
- Melanie, L., et al. Potential of Heterotopic Cardiac Transplantation in Mice as a Model for Elucidating Mechanisms of Graft Rejection. Cardiac Transplantation. Moffatt-Bruce, S. D., et al. , IntechOpen (2012).
- Westhofen, S., et al. The heterotopic heart transplantation in mice as a small animal model to study mechanical unloading - Establishment of the procedure, perioperative management and postoperative scoring. PLoS One. 14 (4), 0214513 (2019).
- Wang, C., Wang, Z., Allen, R., Bishop, G. A., Sharland, A. F. A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion. Journal of Visualized Experiments. (88), e51423 (2014).
- Mokbel, M., et al. Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate Solution for Donor Heart Preservation Is Safe for Transplantation. Annals of Thoracic Surgery. 109 (3), 763-770 (2020).
- Song, S., et al. Modified Suture Technique in a Mouse Heart Transplant Model. Asian Journal of Surgery. 34 (2), 86-91 (2011).
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28 (7), 565-570 (2008).
- Wu, K., et al. cold storage using a new histidine-tryptophan-ketoglutarate-based preservation solution in isogeneic cardiac mouse grafts. European Heart Journal. 32 (4), 509-516 (2011).
- Türk, T. R., et al. Reduction of chronic graft injury with a new HTK-based preservation solution in a murine heart transplantation model. Cryobiology. 64 (3), 273-278 (2012).
