Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल एक माइक्रोफ्लुइडिक प्रणाली के डिजाइन, निर्माण और लक्षण वर्णन का वर्णन करता है जो न्यूनतम उपयोगकर्ता हस्तक्षेप के साथ सैकड़ों ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर भ्रूणों को संरेखित करने, गतिहीन करने और ठीक से संपीड़ित करने में सक्षम है। यह प्रणाली पोस्ट-उत्तेजना विश्लेषण के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग और नमूनों की वसूली को सक्षम करती है और इसे अन्य बहुकोशिकीय जैविक प्रणालियों को समायोजित करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।
Abstract
भ्रूणजनन के दौरान, समन्वित कोशिका आंदोलन यांत्रिक बल उत्पन्न करता है जो जीन अभिव्यक्ति और गतिविधि को नियंत्रित करता है। इस प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए, पूरे भ्रूण को यांत्रिक रूप से उत्तेजित करने के लिए आकांक्षा या कवरस्लिप संपीड़न जैसे उपकरणों का उपयोग किया गया है। ये दृष्टिकोण प्रयोगात्मक डिजाइन को सीमित करते हैं क्योंकि वे गलत हैं, मैनुअल हैंडलिंग की आवश्यकता होती है, और एक साथ केवल कुछ भ्रूणों को संसाधित कर सकते हैं। माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम में थ्रूपुट और परिशुद्धता को बढ़ाते हुए ऐसे प्रयोगात्मक कार्यों को स्वचालित करने की बहुत क्षमता है। यह लेख पूरे ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (फ्रूट फ्लाई) भ्रूण को ठीक से संपीड़ित करने के लिए विकसित एक माइक्रोफ्लुइडिक प्रणाली का वर्णन करता है। इस प्रणाली में वायवीय रूप से सक्रिय विकृत साइडवॉल के साथ माइक्रोचैनल हैं और भ्रूण संरेखण, स्थिरीकरण, संपीड़न और पोस्ट-उत्तेजना संग्रह को सक्षम बनाता है। इन माइक्रोचैनलों को सात लेन में समानांतर करके, स्थिर या गतिशील संपीड़न पैटर्न को एक साथ सैकड़ों ड्रोसोफिला भ्रूणों पर लागू किया जा सकता है। ग्लास कवरस्लिप पर इस प्रणाली को बनाने से उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप के साथ नमूनों की एक साथ यांत्रिक उत्तेजना और इमेजिंग की सुविधा मिलती है। इसके अलावा, पीडीएमएस जैसी जैव संगत सामग्री का उपयोग, और सिस्टम के माध्यम से तरल पदार्थ प्रवाह करने की क्षमता इस उपकरण को मीडिया-निर्भर नमूनों के साथ दीर्घकालिक प्रयोगों में सक्षम बनाती है। यह दृष्टिकोण मैनुअल माउंटिंग की आवश्यकता को भी समाप्त करता है जो यांत्रिक रूप से नमूने पर जोर देता है। इसके अलावा, माइक्रोचैनल्स से नमूने जल्दी से एकत्र करने की क्षमता पोस्ट-उत्तेजना विश्लेषण को सक्षम करती है, जिसमें -ओमिक्स परख शामिल हैं, जिन्हें पारंपरिक यांत्रिक उत्तेजना दृष्टिकोण का उपयोग करके बड़ी नमूना संख्या की आवश्यकता होती है। इस प्रणाली की ज्यामिति विभिन्न जैविक प्रणालियों के लिए आसानी से स्केलेबल है, जिससे उच्च नमूना थ्रूपुट, यांत्रिक उत्तेजना या स्थिरीकरण और स्वचालित संरेखण सहित यहां वर्णित कार्यात्मक विशेषताओं से लाभ उठाने के लिए कई क्षेत्रों को सक्षम किया जा सकता है।
Introduction
जीवित प्रणालियां लगातार अपने जीवनकाल में विभिन्न यांत्रिक इनपुट का अनुभव औरप्रतिक्रिया करती हैं। मेकानोट्रांसडक्शन को कई बीमारियों से जोड़ा गया है, जिसमें विकास संबंधी विकार, मांसपेशियों और हड्डियों के नुकसान, औरयांत्रिक वातावरण से प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से प्रभावित सिग्नलिंग मार्गों के माध्यम से न्यूरोपैथोलॉजी शामिल हैं। हालांकि, मेकेनोसेंसिटिव सिग्नलिंग मार्ग4 में यांत्रिक उत्तेजना3 द्वारा विनियमित जीन और प्रोटीन काफी हद तक अज्ञात रहते हैं, यांत्रिक विनियमन तंत्र के स्पष्टीकरण को रोकते हैं और पैथोलॉजिकल मेकेनोट्रांसडक्शन 6,7 से जुड़े रोगों के लिए आणविक लक्ष्यों की पहचान करते हैं। . संबंधित शारीरिक प्रक्रियाओं पर मेकेनोबायोलॉजी अध्ययनों को प्रोजेक्ट करने में एक सीमित कारक बरकरार बहुकोशिकीय जीवों के बजाय पारंपरिक संस्कृति व्यंजनों के साथ व्यक्तिगत कोशिकाओं का उपयोग कर रहा है। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (फ्रूट फ्लाई) जैसे मॉडल जीवों ने पशु विकास में शामिल जीन, सिग्नलिंग मार्ग और प्रोटीनको समझने में बहुत योगदान दिया है। फिर भी, मेकेनोबायोलॉजी अनुसंधान में ड्रोसोफिला और अन्य बहुकोशिकीय मॉडल जीवों का उपयोग प्रयोगात्मक उपकरणों के साथ चुनौतियों से बाधित हुआ है। तैयार करने, छंटाई, इमेजिंग, या विभिन्न उत्तेजनाओं को लागू करने के लिए पारंपरिक तकनीकों को ज्यादातर मैनुअल हेरफेर की आवश्यकता होती है; ये दृष्टिकोण समय लेने वाले हैं, विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है, परिवर्तनशीलता पेश करते हैं, और प्रयोगात्मक डिजाइन और नमूना आकारको सीमित करते हैं। हाल ही में सूक्ष्म तकनीकी प्रगति बहुत उच्च थ्रूपुट और अत्यधिक नियंत्रित प्रयोगात्मक मापदंडों12,13,14 के साथ नवीन जैविक परख को सक्षम करने के लिए एक महान संसाधन है।
यह लेख पूरे ड्रोसोफिला भ्रूण15 (चित्रा 1) के सैकड़ों में एकअक्षीय संपीड़न के रूप में यांत्रिक उत्तेजना को संरेखित, गतिहीन और सटीक रूप से लागू करने के लिए एक उन्नत माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के विकास का वर्णन करता है। ग्लास कवरस्लिप के साथ माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम के एकीकरण ने उत्तेजना के दौरान नमूनों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल इमेजिंग की अनुमति दी। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस ने -ओमिक्स परख (चित्रा 2) चलाने के लिए उत्तेजना के बाद भ्रूण के तेजी से संग्रह को भी सक्षम किया। इस उपकरण के डिजाइन विचारों के स्पष्टीकरण, साथ ही नरम लिथोग्राफी और प्रयोगात्मक लक्षण वर्णन का उपयोग करके निर्माण, यहां वर्णित हैं। चूंकि इस तरह के उपकरण के सिलिकॉन वेफर मोल्ड को बनाने के लिए उच्च पहलू अनुपात (एआर) खाइयों (एआर >5) वाले बड़े क्षेत्रों पर मोटी फोटोरेसिस्ट (मोटाई >200 μm) की एक समान कोटिंग की आवश्यकता होती है, इसलिए इस विधि ने पारंपरिक फोटोलिथोग्राफिक मोल्ड फैब्रिकेशन प्रोटोकॉल को काफी संशोधित किया। इस तरह, इस विधि ने फोटोरेसिस्ट के हैंडलिंग, आसंजन, कोटिंग, पैटर्निंग और विकास की सुविधा प्रदान की। इसके अतिरिक्त, संभावित नुकसान और उनके समाधानों पर चर्चा की जाती है। अंत में, इस डिजाइन और निर्माण रणनीति की बहुमुखी प्रतिभा को ड्रोसोफिला अंडा कक्षों और मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स16 जैसे अन्य बहुकोशिकीय प्रणालियों का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया था।
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Protocol
1. सिलिकॉन वेफर मोल्ड की तैयारी
- सिलिकॉन वेफर को साफ करें ( सामग्री की तालिका देखें) पहले एसीटोन के साथ और फिर आइसोप्रोपिल अल्कोहल (आईपीए) के साथ।
- निर्जलीकरण बेक के लिए सिलिकॉन वेफर को 30 मिनट के लिए 250 डिग्री सेल्सियस गर्म प्लेट पर रखें (चित्रा 3 ए)।
- सिलिकॉन वेफर को एक वाष्प प्राइम ओवन में हेक्सामेथिलडिसिलाज़ेन (एचडीएमएस) के साथ कोट करें ( सामग्री की तालिका देखें) (प्रक्रिया तापमान: 150 डिग्री सेल्सियस, प्रक्रिया दबाव: 2 टॉर, प्रक्रिया समय: 5 मिनट, एचडीएमएस वॉल्यूम: 5 μL) (चित्रा 3 बी)।
- इसकी चिपचिपाहट को कम करने के लिए 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में एसयू -8 2100 फोटोरेसिस्ट ( सामग्री की तालिका देखें) की एक बोतल रखें।
नोट: ओवन में गर्म करने पर, फोटोरेसिस्ट की चिपचिपाहट कम हो जाती है। कम चिपचिपाहट वाले फोटोरेसिस्ट को अधिक आसानी से संभाला जा सकता है और वेफर के शीर्ष पर अधिक सटीक रूप से डाला जा सकता है। - सिलिकॉन वेफर को 60 डिग्री सेल्सियस गर्म प्लेट पर रखें और वेफर के प्रत्येक इंच के लिए 1 एमएल गर्म फोटोरेसिस्ट डालें जब तक कि फोटोरेसिस्ट अधिकांश सतह को कवर न करे (चित्रा 3 सी)।
- फोटोरेसिस्ट-लेपित सिलिकॉन वेफर को स्पिन कोटर में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- पहले 30 सेकंड के लिए 250 आरपीएम पर प्री-स्पिन लागू करें और फिर 30 सेकंड के लिए 350 आरपीएम पर, दोनों 100 आरपीएम / एस त्वरण के साथ (चित्रा 3 डी)।
- क्लीनरूम स्वैब का उपयोग करके सिलिकॉन वेफर के किनारों से अतिरिक्त फोटोरेसिस्ट को हटा दें।
- पहले 100 आरपीएम/सेकंड त्वरण के साथ 15 सेकंड के लिए 500 आरपीएम पर स्पिन लागू करें और फिर 300 आरपीएम/सेकंड त्वरण के साथ 30 सेकंड के लिए 1450 आरपीएम पर स्पिन करें (चित्रा 3ई)।
- क्लीनरूम स्वैब के साथ किनारे के मोती को हटा दें।
- सिलिकॉन वेफर को 50 डिग्री सेल्सियस गर्म प्लेट पर रखें और खामियों को दूर करने और समान कोटिंग को बढ़ावा देने के लिए वेफर पर एसीटोन स्प्रे करें (चित्रा 3 एफ)।
- धीरे-धीरे गर्म प्लेट के तापमान को 2 डिग्री सेल्सियस / मिनट की दर से 95 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाएं।
- सिलिकॉन वेफर को 50 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नरम बेक करें (चित्रा 3 जी)।
- धीरे-धीरे गर्म प्लेट को कमरे के तापमान पर 2 डिग्री सेल्सियस / मिनट की दर से ठंडा करें।
- सिलिकॉन वेफर को मास्क संरेखक पर रखें ( सामग्री की तालिका देखें) और इसके शीर्ष पर फोटोमास्क रखें (कृपया फोटोमास्क ज्यामिति के लिए पूरक चित्र 1 देखें)।
- संपर्क मास्क संरेखक (चित्रा 3 एच) का उपयोग करके फोटोमास्क के माध्यम से सिलिकॉन वेफर को 350 एमजे / सेमी 2 यूवी प्रकाश (10 सेकंड के लिए 35 मेगावाट / सेमी2) तक उजागर करें।
- वेफर को गर्म प्लेट पर 5 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, अतिरिक्त 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर और अंत में 20 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर रखकर सिलिकॉन वेफर पर लगातार पोस्ट-एक्सपोज़र बेक लागू करें (चित्रा 3 आई)।
- धीरे-धीरे सिलिकॉन वेफर को कमरे के तापमान पर 2 डिग्री सेल्सियस / मिनट की दर से ठंडा करें।
- बीकर में सिलिकॉन वेफर की तुलना में थोड़ा छोटा व्यास वाला चुंबकीय स्टिरर रखें। सिलिकॉन वेफर को उल्टा करें और इसे बीकर के ऊपर रखें।
- बीकर को एक और बड़े बीकर के अंदर रखें और बड़े बीकर को एक ताजा डेवलपर समाधान से भरें ( सामग्री की तालिका देखें)। स्टिरर चालू करने के साथ सिलिकॉन वेफर को डेवलपर में 30 मिनट के लिए डूबा हुआ छोड़ दें (चित्रा 3 जे)।
- सिलिकॉन वेफर को 40 kHz (चित्रा 3K) पर 1 घंटे के लिए ताजा डेवलपर से भरे अल्ट्रासोनिक बाथ सोनिकेटर में स्थानांतरित करें।
- अंतिम सिलिकॉन वेफर मोल्ड (चित्रा 3 एल) प्राप्त करने के लिए आईपीए समाधान के साथ सिलिकॉन वेफर को अच्छी तरह से धो लें।
2. माइक्रोफ्लुइडिक चिप का निर्माण
- सिलिकॉन वेफर मोल्ड को पास में एक छोटी वजन नाव में ट्राइक्लोरो (1एच, 1एच, 2एच, 2एच-परफ्लोरोक्टिल) सिलेन (पीएफओसीटीएस, सामग्री की तालिका देखें) की 10 बूंदों (~ 500 μL) के साथ एक डेसिकेटर में रखें।
- डेसिकेटर को 30 मिनट के लिए लगभग 200 टॉर पर वैक्यूम पंप से कनेक्ट करें।
- डेसिकेटर वाल्व को बंद करें और पीएफओसीटीएस कोटिंग के लिए रात भर वैक्यूम पंप को डिस्कनेक्ट करें।
- पीडीएमएस बेस को 10: 1 अनुपात में इलाज एजेंट ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ मिलाकर पूर्व-ठीक पॉलीडिमेथिलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) समाधान तैयार करें।
- मिश्रण को सेंट्रीफ्यूज (कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 x g ) में रखकर डेगैस करें।
नोट: यह सेंट्रीफ्यूजेशन बुलबुले को शीर्ष सतह पर स्थानांतरित करने की अनुमति देता है और परिणामस्वरूप थोड़े समय में हटा दिया जाता है। - सिलिकॉन वेफर मोल्ड पर डिगैस्ड पीडीएमएस समाधान डालें।
- मोल्ड की सतह पर फंसे हवा के बुलबुले को हटाने के लिए इसे फिर से तैयार करें।
- पीडीएमएस को 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में 1 घंटे और 50 मिनट के लिए ठीक करें (चित्रा 3 एम)।
- माइक्रोफ्लुइडिक चिप ज्यामिति (चित्रा 3 एन) के अनुरूप ठीक किए गए पीडीएमएस क्षेत्र की सीमाओं को काटने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें।
- पीडीएमएस भाग को छीलें और इसे कटिंग मैट पर उल्टा रखें।
- पीडीएमएस भाग को उसके अंतिम आकार में काटने के लिए रेजर का उपयोग करें (चित्रा 3 ओ)।
- बायोप्सी पंच ( सामग्री की तालिका देखें) या एक कुंद टिप (चित्रा 3 पी) के साथ सुई का उपयोग करके पीडीएमएस पर इनलेट और आउटलेट छेद को पंच करें।
- भ्रूण इनलेट छेद के लिए, 4 मिमी व्यास पंच का उपयोग करें।
- भ्रूण आउटलेट छेद के लिए, 1.3 मिमी व्यास पंच का उपयोग करें।
- गैस इनलेट छेद के लिए, 2 मिमी पंच का उपयोग करें।
- पीडीएमएस की पैटर्न वाली सतह पर रहने वाले किसी भी कण को हटाने के लिए स्कॉच टेप के एक टुकड़े का उपयोग करें।
- पहले एसीटोन के साथ और फिर आईपीए के साथ 24 मिमी x 60 मिमी आयताकार ग्लास स्लाइड साफ करें।
- फ़िल्टर किए गए वायु स्रोत से जुड़े एयर गन के साथ कांच की सतह को सुखाएं।
- 2 घंटे के लिए 250 डिग्री सेल्सियस गर्म प्लेट पर रखकर ग्लास स्लाइड पर निर्जलीकरण बेक करें (चित्रा 3 क्यू)।
- सतह संदूषण को रोकने के लिए ग्लास स्लाइड को बीकर से कवर करें।
- पीडीएमएस को इसके पैटर्न वाले साइड के साथ रखें, और निर्जलित ग्लास एक प्लाज्मा क्लीनर में स्लाइड करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- पीडीएमएस और ग्लास स्लाइड को 30 सेकंड के लिए 18 डब्ल्यू पर ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ इलाज करें।
- सहसंयोजक बंधन के माध्यम से माइक्रोचैनलों को सील करने के लिए ग्लास स्लाइड की ओर अपनी पैटर्न वाली सतह के साथ पीडीएमएस को ग्लास स्लाइड पर रखें (चित्रा 3 आर)।
- पूर्ण संवहन संपर्क सुनिश्चित करने के लिए ग्लास स्लाइड के खिलाफ पीडीएमएस भाग को धीरे से धक्का देने के लिए चिमटी का उपयोग करें।
- बॉन्डिंग को अपनी अंतिम ताकत तक पहुंचने की अनुमति देने के लिए रात भर कमरे के तापमान पर पूर्ण माइक्रोफ्लुइडिक चिप स्टोर करें।
3. फल मक्खी भ्रूण की तैयारी
- ओरेगन-आर वयस्क मक्खियों को सेब के रस आगर प्लेटों (1.5% आगर, 25% सेब का रस, 2.5% सुक्रोज) पर अंडे देने की अनुमति दें और दिए गए प्रयोग के लिए अंडे देने के बाद वांछित विकास समय पर प्लेटों को इकट्ठा करें।
नोट: वर्तमान प्रयोगों के लिए, सेलुलराइजेशन चरण17 में भ्रूण के लिए तैयार करने और सॉर्ट करने के लिए प्लेटों को 140 मिनट पर एकत्र किया गया था। - भ्रूण अंडा धोने (0.12 एम एनएसीएल, 0.04% ट्राइटन-एक्स 100) के साथ आगर को भरें और उन्हें आगर से हटाने के लिए पेंटब्रश के साथ धीरे से भ्रूण को उत्तेजित करें।
- भ्रूण को 90 सेकंड के लिए 50% ब्लीच समाधान में स्थानांतरित करें, कभी-कभी हिलाते हुए। ऊतक छलनी के माध्यम से भ्रूण को छान लें और पानी के साथ ब्लीच समाधान को अच्छी तरह से धो लें।
- भ्रूण को पूरी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त भ्रूण अंडा धोने के साथ 90 मिमी ग्लास पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप पर ट्रांसिल्युमिनेशन के साथ भ्रूण की जांच करें और माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में लोड करने के लिए वांछित विकास चरण के भ्रूण का चयन करें।
नोट: इस आवेदन में, सेलुलराइजेशन चरण में भ्रूण का चयन किया गया था। उचित विकास चरण चयन सुनिश्चित करने के तरीके का विस्तृत विवरण ड्रोसोफिला17 के लिए प्रयोगशाला पुस्तिका में पाया जा सकता है।
4. माइक्रोफ्लुइडिक चिप का उपयोग करके फल मक्खी भ्रूण के लिए यांत्रिक उत्तेजना लागू करना
- मुख्य भ्रूण इनलेट पोर्ट के माध्यम से 0.4 μm फ़िल्टर किए गए आईपीए के साथ भरकर सभी सात भ्रूण माइक्रोचैनलों को प्राइम करें।
- आईपीए को 0.4 μm फ़िल्टर किए गए विआयनीकृत (DI) पानी से बदलें।
- डीआई पानी को भ्रूण अंडे धोने के घोल से बदलें।
- ग्लास पिपेट का उपयोग करके ग्लास पेट्री डिश से लगभग 100 पूर्वचयनित भ्रूण एकत्र करें।
- भ्रूण को भ्रूण इनलेट पोर्ट (चित्रा 4 ए) में पाइपेट करें।
- भ्रूण माइक्रोचैनल खोलने के लिए पोर्टेबल वैक्यूम पंप का उपयोग करके गैस इनलेट पर लगभग 3 पीएसआई नकारात्मक दबाव (यानी, वैक्यूम) लागू करें।
- भ्रूण के लिए माइक्रोफ्लुइडिक चिप को नीचे की ओर झुकाएं ताकि भ्रूण माइक्रोचैनलों में स्वचालित रूप से संरेखित और बस सकें (चित्रा 4 बी)।
- यदि भ्रूण माइक्रोचैनल इनलेट एक साथ प्रवेश करने वाले कई भ्रूणों से बंद हो जाते हैं, तो माइक्रोफ्लुइडिक चिप को ऊपर की ओर झुकाएं और फिर क्लॉगिंग को साफ करने के लिए फिर से नीचे की ओर झुकाएं।
- आवश्यक थ्रूपुट के आधार पर, भ्रूण माइक्रोचैनलों में 300 भ्रूण पेश करें।
- एक बार भ्रूण लोडिंग पूरी हो जाने के बाद, भ्रूण को गतिहीन करने के लिए वैक्यूम को हटा दें।
- माइक्रोफ्लुइडिक चिप को क्षैतिज स्थिति में वापस झुकाएं (चित्रा 4 सी)।
- 3 पीएसआई संपीड़न (चित्रा 4 डी) को लागू करने के लिए गैस इनलेट पर दबाव गेज के साथ एक पोर्टेबल सकारात्मक दबाव स्रोत (सामग्री की तालिका देखें) कनेक्ट करें।
- लगातार संपीड़न स्तर लागू करने के लिए दबाव गेज की लगातार जांच करें।
- यदि यांत्रिक रूप से उत्तेजित भ्रूण पर लाइव इमेजिंग प्रयोग आयोजित किए जाएंगे, तो माइक्रोफ्लुइडिक चिप को दबाव स्रोत से जुड़े गैस इनलेट के साथ एक मानक माइक्रोस्कोप स्टेज ग्लास स्लाइड होल्डर पर रखें।
- एक बार संपीड़न प्रयोग पूरा हो जाने के बाद, भ्रूण को डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एकत्र किया जा सकता है। ऐसा करने के लिए, सबसे पहले, भ्रूण को मुक्त करने के लिए गैस इनलेट पर वैक्यूम लागू करें।
- फिर, भ्रूण परिचय पोर्ट (चित्रा 4 ई) की ओर बढ़ने के लिए भ्रूण के लिए माइक्रोफ्लुइडिक चिप को ऊपर की ओर झुकाएं।
- ग्लास पिपेट का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक चिप से भ्रूण एकत्र करें।
नोट: संग्रह पर, भ्रूण के विकास और व्यवहार्यता पर संपीड़न के प्रभावों की जांच वयस्कता में फल मक्खियों को बढ़ाकर की जा सकती है। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस की उच्च-थ्रूपुट प्रसंस्करण क्षमता भ्रूण को डाउनस्ट्रीम ओमिक्स-आधारित परख में उपयोग करने में सक्षम बनाती है जिसके लिए बड़ी संख्या में नमूनों की आवश्यकता होती है (चित्रा 2)।
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Representative Results
माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम को दो उप-डिब्बों में विभाजित किया गया है जो विकृत पीडीएमएस साइडवॉल द्वारा अलग किए गए हैं। पहला कम्पार्टमेंट तरल प्रणाली है जहां ड्रोसोफिला भ्रूण पेश किए जाते हैं, स्वचालित रूप से संरेखित होते हैं, पंक्तिबद्ध होते हैं, और संपीड़ित होते हैं। दूसरा कम्पार्टमेंट एक गैस प्रणाली है जहां संपीड़न चैनलों के दोनों ओर गैस के दबाव को संपीड़न चैनलों की प्रभावी चौड़ाई को ठीक से नियंत्रित करने के लिए डेड-एंड माइक्रोचैनलों के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को नीचे एक ग्लास स्लाइड के साथ सील किया जाता है, जो माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के प्रासंगिक आयामों के लिए नमूनों (पूरक चित्रा 2) के उच्च-रिज़ॉल्यूशन लाइव इमेजिंग को सक्षम बनाता है।
ड्रोसोफिला भ्रूण जैसे बहुकोशिकीय जीवों को वांछित भ्रूण विकास चरण में चुना जाता है। ड्रोसोफिला भ्रूण के मामले में, सभी विकास चरण इस दृष्टिकोण के साथ समान रूप से संगत हैं क्योंकि भ्रूण का आकार तब तक नहीं बदलता है जब तक कि वे हैच नहीं करते। चयनित नमूने ग्लास माइक्रोपिपेट का उपयोग करके बड़े इनलेट (यानी, 4 मिमी व्यास) के माध्यम से माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में पेश किए जाते हैं। डिवाइस को तब नीचे की ओर झुकाया जाता है ताकि भ्रूण को समानांतर फैशन में व्यवस्थित सात संपीड़न चैनलों में प्रवाहित किया जा सके। संकुचित आलिंद जो भ्रूण के इनलेट को संपीड़न चैनल से जोड़ता है, संपीड़न चैनलों के प्रवेश द्वार तक पहुंचने से पहले भ्रूण के स्वचालित संरेखण को सुनिश्चित करता है। गैस इनलेट पर लागू वैक्यूम विकृत साइडवॉल को बाहर की ओर विक्षेपित करता है, प्रभावी माइक्रोचैनल चौड़ाई को बढ़ाता है और भ्रूण को क्रमिक रूप से संपीड़न चैनलों में प्रवेश करने की अनुमति देता है। सात संपीड़न चैनल 22 मिमी लंबे हैं और समानांतर में, एक ही रन में 300 ड्रोसोफिला भ्रूण को समायोजित कर सकते हैं। संपीड़न चैनल एक अड़चन में समाप्त होते हैं जहां माइक्रोचैनल की चौड़ाई नमूनों की तुलना में बहुत छोटे स्तर तक कम हो जाती है, जो भ्रूण को बनाए रखते हुए तरल पदार्थ को प्रवाहित करने की अनुमति देती है। इस दृष्टिकोण के माध्यम से, भ्रूण संपीड़न चैनलों के भीतर केंद्रित होते हैं। भ्रूण की शुरूआत के बाद, गैस इनलेट में वैक्यूम को हटा दिया जाता है, और माइक्रोचैनल साइडवॉल अपनी मूल स्थिति में लौट आते हैं और दोनों तरफ से पंक्तिबद्ध भ्रूण को गतिहीन करते हैं। संपीड़न गैस इनलेट पर सकारात्मक दबाव लागू करके प्राप्त किया जा सकता है, जो विकृत साइडवॉल को अंदर की ओर विक्षेपित करता है और प्रभावी माइक्रोचैनल चौड़ाई को कम करता है। भ्रूण पर लागू संपीड़न की मात्रा को माइक्रोचैनल आयामों, विकृत साइडवॉल की मोटाई, पीडीएमएस के यंग मापांक और लागू दबाव को अनुकूलित करके ठीक से विनियमित किया जा सकता है। संपीड़न प्रयोग के बाद, भ्रूण को गैस इनलेट पर वैक्यूम लागू करके और माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को दूसरी दिशा में झुकाकर डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एकत्र किया जा सकता है।
इस माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को सॉफ्ट लिथोग्राफी18 का उपयोग करके बनाया गया था। हालांकि, अल्ट्राथिक फोटोरेसिस्ट का उपयोग करके उच्च पहलू अनुपात सुविधाओं के साथ मोटी संरचनाओं को बनाने के लिए मानक निर्माण के लिए परिभाषित प्रोटोकॉल से प्रमुख विचलन की आवश्यकता होती है (चित्रा 3)। हेक्सामेथिलडिसिलाज़ेन (एचडीएमएस) कोटिंग के साथ, कार्बनिक अवशेषों को हटाने के लिए स्पिन कोटिंग से पहले सिलिकॉन वेफर्स को साफ किया गया और सतह की नमी को हटाने के लिए बेक किया गया। इन अतिरिक्त चरणों ने सिलिकॉन वेफर के लिए मोटी फोटोरेसिस्ट परत के बंधन को बढ़ाया। चिपचिपाहट को कम करने के लिए डालने से पहले फोटोरेसिस्ट को भी गर्म किया गया था, जो पूरे वेफर सतह को कवर करने के लिए महत्वपूर्ण था। लक्ष्य फोटोरेसिस्ट कोटिंग मोटाई को तीन स्पिनिंग चरणों के माध्यम से प्राप्त किया गया था, जहां प्रत्येक स्पिनिंग चरण ने धीरे-धीरे वेफर सतह को दूषित किए बिना अतिरिक्त फोटोरेसिस्ट को हटा दिया। पहले प्रकाशित तरीकों19 से प्रेरित होकर, एसीटोन का छिड़काव किया गया था, जो फोटोरेसिस्ट के सॉल्वैंट्स में से एक है, सिलिकॉन वेफर पर फोटोरेसिस्ट खामियों को खत्म करने और कोटिंग की एकरूपता बढ़ाने के लिए। लगातार बेकिंग चरणों के दौरान, थर्मल तनाव को कम करने के लिए तापमान को धीरे-धीरे बदल दिया गया था, जिससे सिलिकॉन वेफर से फोटोरेसिस्ट का डिलेमिनेशन हो सकता है। इसी तरह की चिंताओं के कारण, बेकिंग तापमान इसकी अवधि बढ़ाते हुए कम हो गया था। उच्च पहलू अनुपात खाइयों के फोटोलिथोग्राफिक निर्माण में सबसे चुनौतीपूर्ण चरणों में से एक यूवी एक्सपोजर के बाद अनक्योर किए गए फोटोरेसिस्ट को हटाना था। खाइयों में डेवलपर समाधान के प्रवेश को अधिकतम करने के लिए, सिलिकॉन वेफर को उल्टा कर दिया गया और लगातार डेवलपर समाधान के साथ एक हलचल के साथ मिलाया गया। इस तरह, ताजा डेवलपर समाधान अनक्योर किए गए फोटोरेसिस्ट के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है और हटा सकता है। इस कदम के बाद एक अल्ट्रासोनिक स्नान किया गया जहां शेष फोटोरेसिस्ट को हटा दिया गया था। एक बार सिलिकॉन वेफर मोल्ड सफलतापूर्वक उत्पन्न होने के बाद, मानक प्रतिकृति मोल्डिंग प्रक्रिया में अंतिम माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस20 के निर्माण के लिए एजेंट मिश्रण, डिगैसिंग, डालना, इलाज, छीलना, पंचिंग और प्लाज्मा बॉन्डिंग शामिल थी।
माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस की कार्यक्षमता प्रयोगात्मक रूप से ड्रोसोफिला भ्रूण को संपीड़न चैनलों में लोड करके और गैस चैनलों पर सकारात्मक दबाव लागू करके निर्धारित की गई थी। माइक्रोस्कोप (चित्रा 5 ए) के तहत भ्रूण की घटती चौड़ाई के माप से पता चलता है कि लक्ष्य संपीड़न स्तर (चित्रा 5 बी) प्राप्त करने के लिए गैस दबाव का उपयोग कैसे किया जा सकता है। संपीड़न से गुजरने वाले संरेखित भ्रूण की टाइम-लैप्स छवियां भी कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ इस प्रणाली की संगतता को प्रदर्शित करती हैं।
चित्रा 1: माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का डिजाइन और कार्य। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में सात समानांतर संपीड़न माइक्रोचैनल होते हैं जो एक साथ 300 पूरे ड्रोसोफिला भ्रूण का परीक्षण कर सकते हैं। (ए) भ्रूण को मुख्य भ्रूण इनलेट के माध्यम से डिवाइस में पेश किया गया था, और वे माइक्रोचैनलों में प्रवेश करते ही स्वचालित रूप से पीछे-पूर्ववर्ती अक्ष के साथ संरेखित होते हैं। (बी) भ्रूण स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ रहे थे जब गैस इनलेट के माध्यम से नकारात्मक दबाव लागू किया गया था क्योंकि इससे विकृत माइक्रोचैनल साइडवॉल बाहर की ओर विक्षेपित हो गए थे। इसने उनके लोडिंग के साथ-साथ एकल लेन के रूप में अनलोडिंग की अनुमति दी। जब नकारात्मक दबाव हटा दिया गया था, तो भ्रूण को माइक्रोचैनलों में स्थिर किया गया था। जब सकारात्मक दबाव लागू किया गया था, तो माइक्रोचैनल साइडवॉल ने अंदर की ओर विक्षेपित करके भ्रूण को संकुचित किया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: मेकेनोबायोलॉजी अध्ययन के लिए माइक्रोफ्लुइडिक संपीड़न प्रयोगों का प्रक्रिया प्रवाह। (ए) उच्च-थ्रूपुट माइक्रोफ्लुइडिक मेकेनोस्टिम्यूलेशन डिवाइस पीडीएमएस से बना है और सैकड़ों बहुकोशिकीय जैविक नमूनों को संसाधित करने के लिए एक ग्लास स्लाइड है। (बी) डिवाइस को विभिन्न बहुकोशिकीय प्रणालियों जैसे ड्रोसोफिला अंडा कक्षों, ड्रोसोफिला भ्रूण, या मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स के साथ काम करने के लिए तैयार किया गया है। यह डिवाइस बायोसिस्टम पर स्थिर या गतिशील संपीड़न पैटर्न लागू कर सकता है। (सी) सिस्टम को समय के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ चित्रित किया जा सकता है क्योंकि उन्हें संपीड़ित किया जा रहा है। संपीड़न के जवाब में फ्लोरोसेंटली लेबल प्रोटीन के अभिव्यक्ति स्तर और स्थानीयकरण का विश्लेषण किया जा सकता है। संग्रह पर, सिस्टम का विश्लेषण पोस्ट-उत्तेजना परीक्षण और इमेजिंग के लिए किया जा सकता है। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस की उच्च-थ्रूपुट प्रसंस्करण क्षमता भी सिस्टम को ओमिक्स-आधारित जैविक परख में लाइस और उपयोग करने की अनुमति देती है, जिसके लिए बड़ी संख्या में नमूनों की आवश्यकता होती है, जैसा कि 2-आयामी अंतर जेल वैद्युतकणसंचलन छवि उदाहरण के साथ आंकड़े में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: मोटी फोटोरेसिस्ट और उच्च पहलू अनुपात खाइयों के साथ सिलिकॉन वेफर मोल्ड की निर्माण प्रक्रिया। (A, B) फोटोरेसिस्ट कोटिंग के लिए सिलिकॉन वेफर तैयार करने के साथ समग्र निर्माण प्रक्रिया शुरू हुई। (सी-जी) सिलिकॉन वेफर पर समान रूप से एक मोटी फोटोरेसिस्ट कोटिंग लागू की गई थी। (एच, आई) फोटोरेसिस्ट को फोटोमास्क के माध्यम से यूवी एक्सपोजर के साथ पैटर्न किया गया था। (J-L) सिलिकॉन वेफर से अनक्योर ्ड फोटोरेसिस्ट को हटा दिया गया था। (एम-पी) पीडीएमएस भाग नरम लिथोग्राफी के माध्यम से बनाया गया था। (Q, R) डिवाइस को ग्लास स्लाइड पर सील कर दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का संचालन। (A) सबसे पहले, भ्रूण को मुख्य भ्रूण इनलेट में पाइप किया गया था। (बी) दूसरा, गैस इनलेट पर नकारात्मक दबाव लागू किया गया था, और माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को नीचे की ओर झुकाया गया था ताकि भ्रूण को संरेखित किया जा सके और माइक्रोचैनलों में लोड किया जा सके। (सी) तीसरा, भ्रूण को गतिहीन करने के लिए नकारात्मक दबाव को हटा दिया गया था। (डी) चौथा, भ्रूण को संपीड़ित करने के लिए गैस चैनलों पर सकारात्मक दबाव लागू किया गया था। (ई) अंत में, भ्रूण को माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस से नकारात्मक दबाव में वापस स्विच करके और माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को ऊपर की ओर झुकाकर एकत्र किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 5: भ्रूण संपीड़न स्तर का प्रायोगिक माप। (ए) विभिन्न गैस दबाव स्तरों के तहत माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के अंदर प्रतिनिधि भ्रूण। जबकि भ्रूण वैक्यूम के तहत या तंत्रिका दबाव राज्यों में महत्वपूर्ण संपीड़न का अनुभव नहीं करते हैं, सकारात्मक दबाव लागू होने पर वे संकुचित होते हैं। (बी) विभिन्न गैस दबाव स्तरों पर भ्रूण पर लागू एकअक्षीय संपीड़ित तनाव की मात्रा (त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 6: एक ही रणनीति का पालन करते हुए डिजाइन और निर्मित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स का संपीड़न। (A) गैस के दबाव में वृद्धि के रूप में बढ़ते स्तर पर मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स का संपीड़न। (बी) विभिन्न दबाव स्तरों पर माइक्रोचैनलों के अंदर मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स की चौड़ाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक चित्र 1: सिलिकॉन वेफर मोल्ड के फोटोलिथोग्राफिक निर्माण में उपयोग किए जाने वाले फोटोमास्क का शीर्ष दृश्य। व्यास क्षेत्र में 4 के भीतर स्थित पांच समान माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस ज्यामिति हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्र 2: प्रासंगिक आयामों के साथ इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का शीर्ष दृश्य। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
लेख एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के विकास का वर्णन करता है जो स्वचालित रूप से संरेखित, गतिहीन और सैकड़ों पूरे ड्रोसोफिला भ्रूण के लिए यांत्रिक उत्तेजना को ठीक से लागू करता है। एक पतले ग्लास कवरस्लिप के साथ माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम के एकीकरण ने उत्तेजना के दौरान उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ भ्रूण की इमेजिंग के लिए अनुमति दी। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस ने डाउनस्ट्रीम जैविक परख चलाने के लिए उत्तेजना के ठीक बाद भ्रूण के संग्रह को भी सक्षम किया। इस डिवाइस के डिजाइन विचार, निर्माण विधि और लक्षण वर्णन विस्तार से वर्णित किया गया था। सिलिकॉन वेफर मोल्ड फैब्रिकेशन प्रोटोकॉल ने उच्च पहलू अनुपात खाइयों के साथ फोटोरेसिस्ट की एक समान मोटी कोटिंग के लिए अनुमति दी।
इस निर्माण दृष्टिकोण को सफल होने के लिए, बेकिंग चरणों के तापमान को कम करना और फोटोरेसिस्ट के साथ लेपित होने के बाद सिलिकॉन वेफर की हीटिंग और शीतलन दरों को कम करना महत्वपूर्ण है। यदि यह ठीक से नहीं किया जाता है, तो फोटोरेसिस्ट कोटिंग आसानी से मोल्ड ज्यामिति को कम और बदल सकती है। एक बार सिलिकॉन वेफर मोल्ड सफलतापूर्वक निर्मित हो जाने के बाद, इसे लगातार पीडीएमएस प्रतिकृति मोल्डिंग चरणों के दौरान मूल मोल्ड को नुकसान पहुंचाने से रोकने के लिए अधिक टिकाऊ सामग्रियों में कॉपी किया जा सकता है, जिसमें हीटिंग और कूलिंगचक्र भी होते हैं। प्रतिकृति मोल्डिंग के माध्यम से पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का निर्माण मोल्ड से उच्च पहलू अनुपात साइडवॉल संरचनाओं के सफल छीलने पर निर्भर करता है। इस निर्माण चरण को विश्वसनीय होने के लिए, छीलने की सुविधा के लिए सिलिकॉन वेफर की सतह को सिलनाइजिंग एजेंट के साथ ठीक से कोट करना महत्वपूर्ण है। प्रत्येक छीलने के चरण के दौरान सिलेन परत के आंशिक निष्कासन की भरपाई के लिए लगभग 20 पीडीएमएस उपकरणों को बनाने के बाद कोटिंग को नवीनीकृत किया जाना चाहिए। अन्यथा, साइडवॉल फोटोरेसिस्ट पैटर्न के अंदर फंस सकते हैं, जिससे मोल्ड अनुपयोगी हो जाता है। चूंकि नमूनों पर लागू संपीड़न का स्तर साइडवॉल के यांत्रिक गुणों का एक कार्य है, इसलिए पीडीएमएस प्रतिकृति मोल्डिंग प्रक्रिया मापदंडों को सुसंगत रखना महत्वपूर्ण है। निर्माण के दौरान इलाज एजेंट अनुपात, तापमान और अवधि की बारीकी से निगरानी की जानी चाहिए। इसके अलावा, चूंकि यह डिवाइस रणनीति बड़ी संख्या में बहुकोशिकीय जीवों के लिए एक साथ यांत्रिक उत्तेजना लागू करने के लिए है, इसलिए माइक्रोचैनलों के अंदर उनके एकत्रीकरण से क्लॉगिंग हो सकती है। यद्यपि यहां उपयोग किए जाने वाले जीवों के साथ इस समस्या का अनुभव नहीं किया गया था, यदि ऐसा होता है, तो इस समस्या को दूर करने के लिए साहित्य से संभावित समाधान हैं, जैसे कि नमूने22 की शुरूआत के दौरान वाहक समाधान का उपयोग करना।
यद्यपि ड्रोसोफिला भ्रूण को इस काम में एक पूरे बहुकोशिकीय जीव के रूप में उपयोग किया गया था, यहां प्रस्तुत डिजाइन और निर्माण रणनीति को तदनुसार डिवाइस के आयामों को बदलकर अन्य बहुकोशिकीय प्रणालियों की यांत्रिक उत्तेजना पर लागू किया जा सकता है (चित्रा 2)। यह बहुकोशिकीय प्रणालियों से मेल खाने के लिए केंद्रीय माइक्रोचैनल चौड़ाई और ऊंचाई का विस्तार करके पूरा किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण के माध्यम से, नमूने माइक्रोचैनलों में प्रवेश कर सकते हैं और सकारात्मक वायवीय दबाव के साथ विकृत साइडवॉल को विक्षेपित करके समान रूप से संपीड़ित किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण को प्रदर्शित करने के लिए, ड्रोसोफिला अंडे कक्षों के साथ-साथ मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स के लिए इसी तरह के उपकरण बनाए गए थे। इन प्रणालियों ने ड्रोसोफिला भ्रूण प्रयोगों (चित्रा 6) के समान इन जैविक प्रणालियों के सटीक यांत्रिक संपीड़न को सक्षम किया। इसके अलावा, चूंकि यह दृष्टिकोण स्थिर नमूनों के आसपास मीडिया की पुनःपूर्ति को सक्षम बनाता है, इसलिए यह रासायनिक उत्तेजना प्रयोगों के लिए बहुत उपयोगी हो सकता है जिनके लिए नमूनों को परेशान किए बिना त्वरित मीडिया विनिमय की आवश्यकता होती है। कुल मिलाकर, यह बहुमुखी दृष्टिकोण माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम की सटीक और उच्च-थ्रूपुट स्वचालन क्षमताओं को जोड़ता है, जबकि विभिन्न बहुकोशिकीय प्रणालियों जैसे छोटे ऊतक नमूने, ऑर्गेनोइड्स, भ्रूण और अंडाणुओं पर नवीन मेकेनोबायोलॉजी अध्ययन को सक्षम करता है।
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Disclosures
लेखकों के पास इस पांडुलिपि में वर्णित उत्पादों में कोई वित्तीय हित नहीं हैं और खुलासा करने के लिए कुछ और नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (सीएमएमआई-1946456), वायु सेना के वैज्ञानिक अनुसंधान कार्यालय (एफए 9550-18-1-0262), और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (आर01एजी06100501 ए 1) द्वारा समर्थित किया गया था; R21AR08105201A1)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
References
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