Summary
Mevcut protokol, yüzlerce Drosophila melanogaster embriyosunu minimum kullanıcı müdahalesiyle hizalayabilen, hareketsiz hale getirebilen ve hassas bir şekilde sıkıştırabilen mikroakışkan bir sistemin tasarımını, üretimini ve karakterizasyonunu açıklamaktadır. Bu sistem, stimülasyon sonrası analiz için numunelerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini ve geri kazanılmasını sağlar ve diğer çok hücreli biyolojik sistemlere uyum sağlayacak şekilde ölçeklendirilebilir.
Abstract
Embriyogenez sırasında, koordineli hücre hareketi, gen ekspresyonunu ve aktivitesini düzenleyen mekanik kuvvetler üretir. Bu süreci incelemek için, tüm embriyoları mekanik olarak uyarmak için aspirasyon veya örtü slip sıkıştırma gibi araçlar kullanılmıştır. Bu yaklaşımlar, kesin olmadıkları, manuel kullanım gerektirdikleri ve aynı anda sadece birkaç embriyoyu işleyebildikleri için deneysel tasarımı sınırlar. Mikroakışkan sistemler, verimi ve hassasiyeti artırırken bu tür deneysel görevleri otomatikleştirmek için büyük potansiyele sahiptir. Bu makalede, tüm Drosophila melanogaster (meyve sineği) embriyolarını hassas bir şekilde sıkıştırmak için geliştirilen mikroakışkan bir sistem açıklanmaktadır. Bu sistem, pnömatik olarak çalıştırılan deforme edilebilir yan duvarlara sahip mikro kanallara sahiptir ve embriyo hizalaması, immobilizasyon, sıkıştırma ve stimülasyon sonrası toplanmasını sağlar. Bu mikro kanalları yedi şeride paralel hale getirerek, aynı anda yüzlerce Drosophila embriyosuna sabit veya dinamik sıkıştırma desenleri uygulanabilir. Bu sistemin bir cam kapak parçası üzerinde imal edilmesi, numunelerin yüksek çözünürlüklü mikroskoplarla eşzamanlı mekanik stimülasyonunu ve görüntülenmesini kolaylaştırır. Dahası, PDMS gibi biyouyumlu malzemelerin kullanımı ve sistemden sıvı akıtma yeteneği, bu cihazı medyaya bağımlı numunelerle uzun süreli deneyler yapabilmektedir. Bu yaklaşım aynı zamanda numuneleri mekanik olarak geren manuel montaj gereksinimini de ortadan kaldırır. Ayrıca, mikrokanallardan hızlı bir şekilde numune toplama yeteneği, geleneksel mekanik stimülasyon yaklaşımları kullanılarak elde edilemeyen büyük örneklem sayıları gerektiren -omik testler de dahil olmak üzere stimülasyon sonrası analizlere olanak tanır. Bu sistemin geometrisi, farklı biyolojik sistemlere kolayca ölçeklenebilir ve çok sayıda alanın, yüksek numune verimi, mekanik stimülasyon veya immobilizasyon ve otomatik hizalama dahil olmak üzere burada açıklanan işlevsel özelliklerden yararlanmasını sağlar.
Introduction
Canlı sistemler, yaşamları boyunca çeşitli mekanik girdileri sürekli olarak deneyimlemekte ve bunlara yanıt vermektedir1. Mekanotransdüksiyon, gelişimsel bozukluklar, kas ve kemik kaybı ve mekanik ortamdan doğrudan veya dolaylı olarak etkilenen sinyal yolları yoluyla nöropatolojiler dahil olmak üzere birçok hastalıkla ilişkilendirilmiştir2. Bununla birlikte, mekanosensitif sinyal yolakları4'te mekanik stimülasyon3 ile düzenlenen genler ve proteinler büyük ölçüde bilinmemektedir5, mekanik düzenleme mekanizmalarının aydınlatılmasını ve patolojik mekanotransdüksiyonla ilişkili hastalıklar için moleküler hedeflerin belirlenmesini engellemektedir 6,7 . Mekanobiyoloji çalışmalarının ilgili fizyolojik süreçlere yansıtılmasında sınırlayıcı bir faktör, bozulmamış çok hücreli organizmalar yerine geleneksel kültür çanaklarına sahip bireysel hücrelerin kullanılmasıdır. Drosophila melanogaster (meyve sineği) gibi model organizmalar, hayvan gelişiminde rol oynayan genlerin, sinyal yollarının ve proteinlerin anlaşılmasına büyük katkıda bulunmuştur 8,9,10. Bununla birlikte, mekanobiyoloji araştırmalarında Drosophila ve diğer çok hücreli model organizmaların kullanılması, deneysel araçlarla ilgili zorluklarla engellenmiştir. Çeşitli uyaranları hazırlamak, sıralamak, görüntülemek veya uygulamak için kullanılan geleneksel teknikler çoğunlukla manuel manipülasyon gerektirir; Bu yaklaşımlar zaman alıcıdır, uzmanlık gerektirir, değişkenlik getirir ve deneysel tasarımı ve örneklem büyüklüğünü sınırlar11. Son mikroteknolojik gelişmeler, çok yüksek verim ve yüksek kontrollü deneysel parametrelere sahip yeni biyolojik tahlillerin etkinleştirilmesi için harika bir kaynaktır12,13,14.
Bu makalede, yüzlerce Drosophila embriyosuna tek eksenli sıkıştırma şeklinde mekanik stimülasyonu hizalamak, hareketsiz hale getirmek ve hassas bir şekilde uygulamak için geliştirilmiş bir mikroakışkan cihazın geliştirilmesi anlatılmaktadır15 (Şekil 1). Mikroakışkan sistemin bir cam kapak kayışı ile entegrasyonu, stimülasyon sırasında numunelerin yüksek çözünürlüklü konfokal görüntülenmesini sağladı. Mikroakışkan cihaz ayrıca -omik tahlillerin çalıştırılması için stimülasyondan sonra embriyoların hızlı bir şekilde toplanmasını sağladı (Şekil 2). Bu cihazın tasarım hususlarının yanı sıra yumuşak litografi ve deneysel karakterizasyon kullanılarak yapılan imalatın açıklamaları burada açıklanmaktadır. Böyle bir cihazın silikon gofret kalıbını yapmak, yüksek en-boy oranlı (AR) hendeklere (AR >5) sahip geniş alanlar üzerinde kalın fotodirencin (kalınlık >200 μm) düzgün bir kaplamasını gerektirdiğinden, bu yöntem geleneksel fotolitografik kalıp imalat protokolünü önemli ölçüde değiştirdi. Bu şekilde, bu yöntem fotodirencin taşınmasını, yapışmasını, kaplanmasını, desenlenmesini ve geliştirilmesini kolaylaştırdı. Ek olarak, potansiyel tuzaklar ve çözümleri tartışılmaktadır. Son olarak, bu tasarım ve üretim stratejisinin çok yönlülüğü, Drosophila yumurta odaları ve beyin organoidleri16 gibi diğer çok hücreli sistemler kullanılarak gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Silikon gofret kalıbının hazırlanması
- Silikon gofreti (bakınız Malzeme Tablosu) önce asetonla, sonra izopropil alkolle (IPA) temizleyin.
- Silikon gofreti, dehidrasyon fırını için 30 dakika boyunca 250 °C'lik bir sıcak plakaya yerleştirin (Şekil 3A).
- Silikon gofreti buhar asal fırında hekzametildiilazan (HDMS) ile kaplayın (bkz. Malzeme Tablosu) (proses sıcaklığı: 150 °C, proses basıncı: 2 Torr, işlem süresi: 5 dakika, HDMS hacmi: 5 μL) (Şekil 3B).
- Viskozitesini azaltmak için bir şişe SU-8 2100 fotorezistini ( Malzeme Tablosuna bakınız) 60 °C'lik bir fırında 15 dakika bekletin.
NOT: Fırında ısıtıldıktan sonra, fotodirencin viskozitesi azalır. Alçaltılmış viskoziteye sahip fotodirençler daha kolay işlenebilir ve gofret üzerine daha doğru bir şekilde dökülebilir. - Silikon gofreti 60 °C'lik bir sıcak plakaya yerleştirin ve fotodirenç yüzeyin çoğunu kaplayana kadar gofretin her bir inç için ısıtılmış fotodirencin 1 mL'sini dökün (Şekil 3C).
- Fotodirenç kaplı silikon gofreti bir spin kaplayıcıya aktarın (bkz.
- Ön spini önce 30 s için 250 rpm'de, daha sonra her ikisi de 100 rpm/s ivmelenme ile başka bir 30 s için 350 rpm'de uygulayın (Şekil 3D).
- Fazla fotodirenci silikon gofretin kenarlarından temiz oda çubuğu kullanarak çıkarın.
- Önce 100 rpm/s ivmelenme ile 15 s için 500 rpm'de, daha sonra 300 rpm/s ivmelenme ile 30 s için 1450 rpm'de bir spin uygulayın (Şekil 3E).
- Kenar boncuğunu temiz oda çubuğuyla çıkarın.
- Silikon gofreti 50 °C'lik bir sıcak plakaya yerleştirin ve kusurları gidermek ve düzgün kaplamayı teşvik etmek için gofret üzerine aseton püskürtün (Şekil 3F).
- Sıcak plakanın sıcaklığını 2 ° C / dak oranında yavaşça 95 ° C'ye yükseltin.
- Silikon gofreti 95 °C'de 50 dakika boyunca yumuşak bir şekilde pişirin (Şekil 3G).
- Sıcak plakayı oda sıcaklığına 2°C/dak hızında yavaşça soğutun.
- Silikon gofreti bir maske hizalayıcısına yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve fotomaskeyi üzerine yerleştirin (fotomaske geometrisi için lütfen Ek Şekil 1'e bakın).
- Silikon gofreti, temas maskesi hizalayıcısını kullanarak fotomaske aracılığıyla 350 mJ/cm2 UV ışığına (10 s için 35 mW/cm2 ) maruz bırakın (Şekil 3H).
- Gofreti 5 dakika boyunca 50 ° C'de, 65 ° C'de 5 dakika daha ve son olarak 80 ° C'de 20 dakika daha sıcak bir plakaya yerleştirerek silikon gofret üzerine ardışık pozlama sonrası fırınlar uygulayın (Şekil 3I).
- Silikon gofreti 2 °C/dak oranında oda sıcaklığına yavaşça soğutun.
- Bir beherin içine silikon gofretten biraz daha küçük çaplı manyetik bir karıştırıcı yerleştirin. Silikon gofreti baş aşağı çevirin ve kabın üzerine yerleştirin.
- Beheri daha büyük başka bir kabın içine yerleştirin ve daha büyük beheri yeni bir geliştirici çözümüyle doldurun (bkz. Silikon gofreti, karıştırıcı açıkken 30 dakika boyunca geliştiriciye batırılmış halde bırakın (Şekil 3J).
- Silikon gofreti, 40 kHz'de 1 saat boyunca taze geliştirici ile doldurulmuş bir ultrasonik banyo sonikatörüne aktarın (Şekil 3K).
- Son silikon gofret kalıbını elde etmek için silikon gofreti bir IPA çözeltisi ile iyice yıkayın (Şekil 3L).
2. Mikroakışkan çipin imalatı
- Silikon gofret kalıbını, yakındaki küçük bir tartım teknesinde 10 damla (~ 500 μL) Trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perflorooktil) silan (PFOCTS, Malzeme Tablosuna bakınız) ile birlikte bir kurutucuya yerleştirin.
- Kurutucuyu 30 dakika boyunca yaklaşık 200 Torr'da bir vakum pompasına bağlayın.
- Kurutucu vanayı kapatın ve PFOCTS kaplama için vakum pompasını gece boyunca ayırın.
- PDMS bazını kürleme maddesi ile karıştırarak önceden kürlenmiş polidimetilsiloksan (PDMS) çözeltisini hazırlayın (bkz.
- Karışımı bir santrifüje yerleştirerek gazdan arındırın (oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g).
NOT: Bu santrifüjleme, kabarcıkların üst yüzeye geçmesine ve sonuç olarak kısa sürede çıkarılmasına izin verir. - Gazdan arındırılmış PDMS çözeltisini silikon gofret kalıbına dökün.
- Kalıp yüzeyinde sıkışmış hava kabarcıklarını gidermek için tekrar gazdan arındırın.
- PDMS'yi 60 °C'lik bir fırında 1 saat 50 dakika kürleyin (Şekil 3M).
- Mikroakışkan çip geometrisine karşılık gelen kürlenmiş PDMS bölgesinin sınırlarını kesmek için bir neşter kullanın (Şekil 3N).
- PDMS parçasını soyun ve bir kesme paspası üzerine baş aşağı yerleştirin.
- PDMS parçasını son şekline kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın (Şekil 3O).
- PDMS üzerindeki giriş ve çıkış deliklerini biyopsi zımbalama (bkz. Malzeme Tablosu) veya künt uçlu bir iğne (Şekil 3P) kullanarak delin.
- Embriyo giriş deliği için 4 mm çapında bir zımba kullanın.
- Embriyo çıkış delikleri için 1,3 mm çapında bir zımba kullanın.
- Gaz giriş deliği için 2 mm'lik bir zımba kullanın.
- PDMS'nin desenli yüzeyinde kalabilecek partikülleri çıkarmak için bir parça viski bandı kullanın.
- 24 mm x 60 mm dikdörtgen cam sürgüyü önce asetonla, sonra IPA ile temizleyin.
- Cam yüzeyi, filtrelenmiş bir hava kaynağına bağlı bir hava tabancasıyla kurulayın.
- Cam kızağa 2 saat boyunca 250 °C'lik bir sıcak plakaya yerleştirerek bir dehidrasyon fırını uygulayın (Şekil 3Q).
- Yüzey kontaminasyonunu önlemek için cam sürgüyü bir beherle örtün.
- PDMS'yi desenli tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve kurutulmuş cam bir plazma temizleyiciye kayar (bkz.
- PDMS'yi ve cam kaydırağı 30 saniye boyunca 18 W'ta oksijen plazması ile tedavi edin.
- PDMS'yi, kovalent yapıştırma yoluyla mikrokanalları kapatmak için desenli yüzeyi cam slayda bakacak şekilde cam slaytın üzerine yerleştirin (Şekil 3R).
- Tam konformasyonel temas sağlamak üzere PDMS parçasını cam kızağa nazikçe itmek için cımbız kullanın.
- Yapıştırmanın son gücüne ulaşmasını sağlamak için tamamlanmış mikroakışkan çipi gece boyunca oda sıcaklığında saklayın.
3. Meyve sineği embriyolarının hazırlanması
- Oregon-R yetişkin sineklerinin elma suyu agar plakalarına (% 1.5 agar,% 25 elma suyu,% 2.5 sakaroz) yumurta bırakmasına izin verin ve verilen deney için yumurtlamadan sonra plakaları istenen gelişim zamanında toplayın.
NOT: Mevcut deneyler için, plakalar hücreselleştirme aşaması17'deki embriyoları hazırlamak ve sıralamak için 140 dakikada toplanmıştır. - Agar'ı embriyo yumurta yıkama ile doldurun (0.12 M NaCl,% 0.04 Triton-X 100) ve embriyoları agardan çıkarmak için bir boya fırçasıyla hafifçe çalkalayın.
- Embriyoları, ara sıra karıştırarak, 90 s için% 50'lik bir ağartıcı çözeltisine aktarın. Embriyoları bir doku eleğinden süzün ve ağartıcı çözeltisini suyla iyice yıkayın.
- Embriyoları, embriyoları tamamen örtmek için yeterli embriyo yumurta yıkama ile 90 mm'lik bir cam Petri kabına aktarın.
- Embriyoları diseksiyon mikroskobunda transillumination ile inceleyin ve mikroakışkan cihaza yüklenmek üzere istenen gelişim aşamasındaki embriyoları seçin.
NOT: Bu uygulamada hücreselleştirme aşamasındaki embriyolar seçilmiştir. Doğru gelişim aşaması seçiminin nasıl sağlanacağına dair ayrıntılı açıklamalar, Drosophila17 için laboratuvar el kitabında bulunabilir.
4. Mikroakışkan çip kullanılarak meyve sineği embriyolarına mekanik stimülasyon uygulanması
- Yedi embriyo mikrokanalının tümünü, ana embriyo giriş portundan 0.4 μm filtrelenmiş IPA ile doldurarak astarlayın.
- IPA'yı 0,4 μm filtrelenmiş deiyonize (DI) su ile değiştirin.
- DI suyunu embriyo yumurta yıkama çözeltisi ile değiştirin.
- Bir cam pipet kullanarak cam Petri kabından yaklaşık 100 önceden seçilmiş embriyo toplayın.
- Embriyoları embriyo giriş portuna pipetle yerleştirin (Şekil 4A).
- Embriyo mikrokanallarını açmak için taşınabilir bir vakum pompası kullanarak gaz girişine yaklaşık 3 PSI negatif basınç (yani vakum) uygulayın.
- Embriyoların otomatik olarak hizalanması ve embriyo mikrokanallarına yerleşmesi için mikroakışkan çipi aşağı doğru eğin (Şekil 4B).
- Embriyo mikrokanal girişleri aynı anda giren birden fazla embriyo tarafından tıkanırsa, tıkanmayı temizlemek için mikroakışkan çipi yukarı ve sonra tekrar aşağı doğru eğin.
- Gerekli verime dayanarak, embriyo mikrokanallarına 300 kadar embriyo sokuldu.
- Embriyo yüklemesi tamamlandıktan sonra, embriyoları hareketsiz hale getirmek için vakumu çıkarın.
- Mikroakışkan çipi yatay konuma geri eğin (Şekil 4C).
- 3 PSI sıkıştırma uygulamak için gaz girişine bir basınç göstergesi ile taşınabilir bir pozitif basınç kaynağı (bkz. Malzeme Tablosu) bağlayın (Şekil 4D).
- Tutarlı bir sıkıştırma seviyesinin uygulandığından emin olmak için basınç göstergesini sürekli kontrol edin.
- Mekanik olarak uyarılan embriyolar üzerinde canlı görüntüleme deneyleri yapılacaksa, mikroakışkan çipi, basınç kaynağına bağlı gaz girişi ile standart bir mikroskop sahne cam slayt tutucusuna yerleştirin.
- Sıkıştırma deneyi tamamlandıktan sonra, embriyolar aşağı akış analizi için toplanabilir. Bunu yapmak için, önce embriyoları serbest bırakmak için vakumu gaz girişine uygulayın.
- Ardından, embriyoların embriyo giriş portuna doğru hareket etmesi için mikroakışkan çipi yukarı doğru eğin (Şekil 4E).
- Bir cam pipet kullanarak embriyoları mikroakışkan çipten toplayın.
NOT: Toplandıktan sonra, sıkıştırmanın embriyonik gelişim ve canlılık üzerindeki etkileri, meyve sineklerinin yetişkinliğe kadar büyütülmesiyle araştırılabilir. Mikroakışkan cihazın yüksek verimli işleme kapasitesi, embriyoların çok sayıda numune gerektiren aşağı akış omik tabanlı tahlillerde kullanılmasını da sağlar (Şekil 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroakışkan sistem, deforme olabilen PDMS yan duvarları ile ayrılmış iki alt bölmeye ayrılmıştır. İlk bölme, Drosophila embriyolarının tanıtıldığı, otomatik olarak hizalandığı, sıralandığı ve sıkıştırıldığı sıvı sistemdir. İkinci bölme, sıkıştırma kanallarının her iki tarafındaki gaz basıncının, sıkıştırma kanallarının etkin genişliğini hassas bir şekilde kontrol etmek için çıkmaz mikro kanallar aracılığıyla kontrol edildiği bir gaz sistemidir. Mikroakışkan cihaz, mikroakışkan cihazın ilgili boyutları için numunelerin yüksek çözünürlüklü canlı görüntülenmesini sağlayan altta bir cam slayt ile kapatılmıştır (Ek Şekil 2).
Drosophila embriyoları gibi çok hücreli organizmalar istenen embriyonik gelişim aşamasında seçilir. Drosophila embriyoları söz konusu olduğunda, tüm gelişim aşamaları bu yaklaşımla eşit derecede uyumludur, çünkü embriyo büyüklüğü yumurtadan çıkana kadar değişmez. Seçilen numuneler, bir cam mikropipet kullanılarak büyük girişten (yani 4 mm çapta) mikroakışkan cihaza verilir. Cihaz daha sonra embriyoların paralel bir şekilde düzenlenen yedi sıkıştırma kanalına akmasına izin vermek için aşağı doğru eğilir. Embriyo girişini sıkıştırma kanalına bağlayan daralan atriyum, embriyoların sıkıştırma kanallarının girişine ulaşmadan önce otomatik olarak hizalanmasını sağlar. Gaz girişine uygulanan vakum, deforme olabilen yan duvarları dışa doğru saptırarak etkili mikrokanal genişliğini arttırır ve embriyoların sıkıştırma kanallarına sırayla girmesine izin verir. Yedi sıkıştırma kanalı 22 mm uzunluğundadır ve paralel olarak tek bir çalışmada 300 Drosophila embriyosunu barındırabilir. Sıkıştırma kanalları, mikrokanalın genişliğinin numunelerinkinden çok daha küçük bir seviyeye düştüğü ve embriyoları tutarken sıvının akmasına izin veren bir darboğazda sona erer. Bu yaklaşımla, embriyolar sıkıştırma kanalları içinde yoğunlaşır. Embriyoların sokulmasından sonra, gaz girişindeki vakum çıkarılır ve mikrokanal yan duvarları orijinal konumlarına geri döner ve sıralanmış embriyoları her iki taraftan da hareketsiz hale getirir. Sıkıştırma, deforme olabilen yan duvarları içe doğru saptıran ve etkili mikrokanal genişliğini azaltan gaz girişine pozitif basınç uygulanarak elde edilebilir. Embriyolara uygulanan sıkıştırma miktarı, mikrokanal boyutları, deforme olabilen yan duvarların kalınlığı, PDMS'nin Young Modülü ve uygulanan basınç uyarlanarak hassas bir şekilde düzenlenebilir. Sıkıştırma deneyinden sonra, embriyolar, gaz girişine bir vakum uygulanarak ve mikroakışkan cihazı başka bir yöne eğerek aşağı akış analizi için toplanabilir.
Bu mikroakışkan cihaz, yumuşak litografi18 kullanılarak üretilmiştir. Bununla birlikte, ultra kalın fotodirenç kullanarak yüksek en boy oranı özelliklerine sahip kalın yapıların imal edilmesi, standart imalat için tanımlanan protokollerden büyük sapmalar gerektirir (Şekil 3). Hekzametildiilazanen (HDMS) kaplama ile birlikte, silikon gofretler organik kalıntıları gidermek için spin kaplamadan önce temizlendi ve yüzey nemini gidermek için pişirildi. Bu ekstra adımlar, kalın fotodirenç tabakasının silikon gofrete bağlanmasını geliştirdi. Fotorezist, tüm gofret yüzeyini kaplamak için çok önemli olan viskoziteyi azaltmak için dökülmeden önce de ısıtıldı. Hedef fotodirenç kaplama kalınlığı, her eğirme adımının gofret yüzeyini kirletmeden fazla fotodirenci kademeli olarak ortadan kaldırdığı üç eğirme adımıyla elde edildi. Daha önce yayınlanmış yöntemler19'dan esinlenerek, fotodirencin çözücülerinden biri olan aseton, fotodirenç kusurlarını ortadan kaldırmak ve kaplamanın homojenliğini arttırmak için silikon gofret üzerine püskürtüldü. Ardışık pişirme adımları sırasında, termal stresi en aza indirmek için sıcaklık yavaşça değiştirildi, bu da fotodirencin silikon gofretten delaminasyonuna yol açabilir. Benzer endişeler nedeniyle, pişirme sıcaklığı azalırken süresi uzatıldı. Yüksek en-boy oranlı hendeklerin fotolitografik imalatındaki en zorlu adımlardan biri, UV ışınlarına maruz kaldıktan sonra kürlenmemiş fotodirencin çıkarılmasıydı. Geliştirici çözümünün siperlere nüfuzunu en üst düzeye çıkarmak için, silikon gofret baş aşağı çevrildi ve geliştirici çözümüyle sürekli olarak bir karıştırıcı ile karıştırıldı. Bu şekilde, yeni geliştirici çözümü, kürlenmemiş fotodirençle reaksiyona girebilir ve kaldırabilir. Bu adımı, kalan fotodirencin çıkarıldığı ultrasonik bir banyo izledi. Silikon gofret kalıbı başarıyla üretildikten sonra, standart replika kalıplama işlemi, nihai mikroakışkan cihaz20'nin imalatı için kürleme maddesi karıştırma, gaz giderme, dökme, kürleme, soyma, delme ve plazma bağlamadan oluşuyordu.
Mikroakışkan cihazın işlevselliği, Drosophila embriyolarının sıkıştırma kanallarına yüklenmesi ve gaz kanallarına pozitif basınç uygulanması ile deneysel olarak belirlendi. Mikroskop altında embriyoların azalan genişliğinin ölçümleri (Şekil 5A), hedef sıkıştırma seviyesini elde etmek için gaz basıncının nasıl kullanılabileceğini göstermektedir (Şekil 5B). Sıkıştırma uygulanan hizalanmış embriyoların hızlandırılmış görüntüleri de bu sistemin konfokal mikroskopi ile uyumluluğunu göstermektedir.
Resim 1: Mikroakışkan cihazın tasarımı ve işlevi. Mikroakışkan cihaz, aynı anda 300 adede kadar Drosophila embriyosunu test edebilen yedi paralel sıkıştırma mikrokanalından oluşur. (A) Embriyolar ana embriyo girişi yoluyla cihaza sokuldu ve mikrokanallara girerken otomatik olarak arka-anterior eksen boyunca hizalandılar. (B) Gaz girişinden negatif basınç uygulandığında embriyolar serbestçe hareket ediyordu, çünkü bu deforme olabilen mikrokanal yan duvarlarını dışa doğru saptırıyordu. Bu, tek bir şerit olarak yüklenmelerinin yanı sıra boşaltmalarına da izin verdi. Negatif basınç kaldırıldığında, embriyolar mikrokanallarda hareketsiz hale getirildi. Pozitif basınç uygulandığında, mikrokanal yan duvarları embriyoları içe doğru saptırarak sıkıştırdı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mekanobiyoloji çalışmaları için mikroakışkan sıkıştırma deneylerinin proses akışı. (A) Yüksek verimli mikroakışkan mekanostimülasyon cihazı, yüzlerce çok hücreli biyolojik numuneyi işlemek için PDMS ve cam bir slayttan yapılmıştır. (B) Cihaz, Drosophila yumurta odaları, Drosophila embriyoları veya beyin organoidleri gibi farklı çok hücreli sistemlerle çalışacak şekilde uyarlanmıştır. Bu cihaz, biyosistemlere sabit veya dinamik sıkıştırma desenleri uygulayabilir. (C) Sistemler, sıkıştırılırken zaman içinde konfokal mikroskopla görüntülenebilir. Floresan olarak etiketlenmiş proteinlerin kompresyona yanıt olarak ekspresyon seviyeleri ve lokalizasyonu analiz edilebilir. Toplandıktan sonra, sistemler stimülasyon sonrası test ve görüntüleme için analiz edilebilir. Mikroakışkan cihazın yüksek verimli işleme kapasitesi, 2 boyutlu diferansiyel jel elektroforez görüntü örneği ile şekilde gösterildiği gibi, sistemlerin lize edilmesine ve çok sayıda numune gerektiren omik tabanlı biyolojik tahlillerde kullanılmasına izin verir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kalın fotorezistli ve yüksek en-boy oranlı açmalara sahip silikon gofret kalıbının imalat süreci. (A,B) Genel imalat süreci, silikon gofretinin fotorezistlik kaplama için hazırlanmasıyla başladı. (C-G) Silikon gofrete kalın bir fotodirenç kaplaması düzgün bir şekilde uygulandı. (H,I) Fotodirenç, fotomaske aracılığıyla UV pozlaması ile desenlenmiştir. (J-L) Kürlenmemiş fotodirenç silikon gofretten çıkarıldı. (M-P) PDMS kısmı yumuşak litografi ile üretilmiştir. (Q,R) Cihaz cam slayta kapatıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Mikroakışkan cihazın çalışması . (A) İlk olarak, embriyolar ana embriyo girişine pipetlendi. (B) İkincisi, gaz girişine negatif basınç uygulandı ve mikroakışkan cihaz, embriyoların hizalanmasına ve mikrokanallara yüklenmesine izin vermek için aşağı doğru eğildi. (C) Üçüncüsü, embriyoları hareketsiz hale getirmek için negatif basınç kaldırıldı. (D) Dördüncüsü, embriyoları sıkıştırmak için gaz kanallarına pozitif basınç uygulandı. (E) Son olarak, embriyolar negatif basınca geri dönülerek ve mikroakışkan cihaz yukarı doğru eğilerek mikroakışkan cihazdan toplanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Embriyo sıkıştırma seviyesinin deneysel ölçümü . (A) Farklı gaz basıncı seviyeleri altında mikroakışkan cihaz içindeki temsili embriyolar. Embriyolar vakum altında veya nöral basınç durumlarında önemli bir sıkışma yaşamazken, pozitif basınç uygulandığında sıkıştırılırlar. (B) Farklı gaz basıncı seviyelerinde embriyolara uygulanan tek eksenli sıkıştırma gerinimi miktarı (hata çubukları standart sapmayı temsil eder). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Beyin organoidlerinin aynı strateji izlenerek tasarlanmış ve imal edilmiş mikroakışkan bir cihazda sıkıştırılması. (A) Gaz basıncı arttıkça beyin organoidlerinin artan seviyelerde sıkıştırılması. (B) Mikrokanalların içindeki beyin organoidlerinin farklı basınç seviyelerindeki genişliği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Silikon gofret kalıbının fotolitografik imalatında kullanılan fotomaskenin üstten görünümü. 4 çap alanı içinde yer alan beş özdeş mikroakışkan cihaz geometrisi vardır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: Bu çalışmada kullanılan mikroakışkan cihazın ilgili boyutları ile üstten görünümü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Makale, yüzlerce Drosophila embriyosuna mekanik stimülasyonu otomatik olarak hizalamak, hareketsiz hale getirmek ve hassas bir şekilde uygulamak için mikroakışkan bir cihazın geliştirilmesini açıklamaktadır. Mikroakışkan sistemin ince bir cam kapak kayması ile entegrasyonu, stimülasyon sırasında embriyoların yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile görüntülenmesini sağlamıştır. Mikroakışkan cihaz ayrıca, aşağı akış biyolojik tahlillerinin çalıştırılması için stimülasyondan hemen sonra embriyoların toplanmasını sağladı. Bu cihazın tasarım hususları, imalat yöntemi ve karakterizasyonu ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Silikon gofret kalıp imalat protokolü, fotodirencin yüksek en-boy oranlı hendeklerle düzgün kalın kaplanmasına izin verdi.
Bu imalat yaklaşımının başarılı olması için, pişirme adımlarının sıcaklığını düşürmek ve silikon gofretin fotodirençle kaplandıktan sonra ısıtma ve soğutma oranlarını en aza indirmek önemlidir. Bu düzgün bir şekilde yapılmazsa, fotodirenç kaplama kolayca delaminasyona uğrayabilir ve kalıp geometrisini değiştirebilir. Silikon gofret kalıbı başarıyla üretildikten sonra, ısıtma ve soğutma döngüleri21'i de içeren ardışık PDMS replika kalıplama adımları sırasında orijinal kalıbın zarar görmesini önlemek için daha dayanıklı malzemelere kopyalanabilir. PDMS mikroakışkan cihazının replika kalıplama yoluyla üretimi, yüksek en-boy oranlı yanak yapılarının kalıptan başarılı bir şekilde soyulmasına dayanır. Bu imalat adımının güvenilir olması için, soyulmayı kolaylaştırmak için silikon gofret yüzeyinin bir silanjör maddesi ile düzgün bir şekilde kaplanması kritik öneme sahiptir. Kaplama, her soyma adımı sırasında silan tabakasının kısmen çıkarılmasını telafi etmek için yaklaşık 20 PDMS cihazı imal edildikten sonra da yenilenmelidir. Aksi takdirde, yan duvarlar fotodirenç deseninin içine sıkışabilir ve kalıbı kullanılamaz hale getirebilir. Numunelere uygulanan sıkıştırma seviyesi, yan duvarların mekanik özelliklerinin bir fonksiyonu olduğundan, PDMS replika kalıplama işlemi parametrelerinin tutarlı tutulması önemlidir. Kürleme maddesi oranı, sıcaklığı ve süresi imalat sırasında yakından izlenmelidir. Ek olarak, bu cihaz stratejisi çok sayıda çok hücreli organizmaya aynı anda mekanik stimülasyon uygulamak için olduğundan, mikro kanalların içindeki agregasyonları tıkanmaya neden olabilir. Burada kullanılan organizmalarda bu sorun yaşanmamış olsa da, eğer bu gerçekleşirse, örneklerin tanıtılması sırasında taşıyıcı çözümlerin kullanılması gibi literatürden bu sorunun üstesinden gelmek için potansiyel çözümler vardır22.
Bu çalışmada Drosophila embriyoları bütün olarak çok hücreli bir organizma olarak kullanılmış olsa da, burada sunulan tasarım ve üretim stratejisi, cihazın boyutları buna göre değiştirilerek diğer çok hücreli sistemlerin mekanik uyarımına uygulanabilir (Şekil 2). Bu, merkezi mikro kanal genişliğini ve yüksekliğini çok hücreli sistemlerinkiyle eşleşecek şekilde genişleterek gerçekleştirilebilir. Bu yaklaşım sayesinde, numuneler mikro kanallara girebilir ve deforme olabilen yan duvarları pozitif pnömatik basınçla saptırarak benzer şekilde sıkıştırılabilir. Bu yaklaşımı göstermek için, Drosophila yumurta odaları ve beyin organoidleri için benzer cihazlar üretildi. Bu sistemler, Drosophila embriyo deneylerine benzer şekilde bu biyolojik sistemlerin hassas mekanik sıkıştırmasını sağlamıştır (Şekil 6). Ayrıca, bu yaklaşım hareketsiz numunelerin etrafındaki ortamın yenilenmesini sağladığından, numuneleri rahatsız etmeden hızlı ortam değişimi gerektiren kimyasal stimülasyon deneyleri için çok yararlı olabilir. Genel olarak, bu çok yönlü yaklaşım, mikroakışkan sistemlerin hassas ve yüksek verimli otomasyon yeteneklerini birleştirirken, küçük doku örnekleri, organoidler, embriyolar ve oositler gibi çeşitli çok hücreli sistemler üzerinde yeni mekanobiyoloji çalışmalarına olanak tanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların bu makalede açıklanan ürünler üzerinde hiçbir finansal çıkarları yoktur ve açıklayacak başka bir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı (CMMI-1946456), Hava Kuvvetleri Bilimsel Araştırma Ofisi (FA9550-18-1-0262) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
References
- Wang, J. H. -C., Thampatty, B. P. An introductory review of cell mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).
- Ingber, D. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).
- Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering. Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).
- Bellin, R. M., et al. Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).
- Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).
- Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).
- Maurer, M., Lammerding, J. The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).
- Jennings, B. H. Drosophila-A versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Konno, M., et al. State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine. Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).
- Morgan, T. H. Sex limited inheritance in Drosophila. Science. 32 (812), 120-122 (1910).
- Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly. Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).
- Jayamohan, H., et al. Chapter 11 - Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies. Molecular Diagnostics. Patrinos, G., et al. , Academic Press. Cambridge, MA. 197-217 (2017).
- Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology. Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).
- Mohammed, D., et al. Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).
- Shorr, A. Z., Sönmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics. Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).
- Kim, Y. T., et al. Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).
- Ashburner, M. Drosophila. A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (1989).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro-and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).
- Lee, H., et al. A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
- Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. Polycarbonate heat molding for soft lithography. Small. 16 (16), 2000241 (2020).
- Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos. Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).
