Summary
本协议描述了微流体系统的设计，制造和表征，该系统能够以最少的用户干预对齐，固定和精确压缩数百个 黑腹果蝇 胚胎。该系统可实现高分辨率成像和样品回收，以进行刺激后分析，并且可以扩展以适应其他多细胞生物系统。
Abstract
在胚胎发生过程中，协调的细胞运动产生调节基因表达和活性的机械力。为了研究这一过程，已经使用抽吸或盖玻片压缩等工具来机械刺激整个胚胎。这些方法限制了实验设计，因为它们不精确，需要人工处理，并且只能同时处理几个胚胎。微流体系统在自动化此类实验任务的同时提高通量和精度方面具有巨大潜力。本文描述了一种微流体系统，用于精确压缩整个 黑腹果 蝇（果蝇）胚胎。该系统具有带有气动驱动可变形侧壁的微通道，可实现胚胎对齐、固定、压缩和刺激后收集。通过将这些微通道并行到七个通道中，可以同时将稳定或动态压缩模式应用于数百个 果蝇 胚胎。在玻璃盖玻片上制造该系统有助于使用高分辨率显微镜同时对样品进行机械刺激和成像。此外，利用生物相容性材料（如PDMS）以及流体流过系统的能力使该设备能够对介质依赖性样品进行长期实验。这种方法还消除了手动安装的需要，手动安装会对样品施加机械压力。此外，从微通道快速收集样品的能力使刺激后分析成为可能，包括需要大量样品的组学测定，这是使用传统机械刺激方法无法实现的。该系统的几何形状易于扩展到不同的生物系统，使许多领域能够从本文描述的功能特征中受益，包括高样品通量、机械刺激或固定以及自动比对。
Introduction
生命系统在其一生中不断经历并响应各种机械输入1.机械转导与许多疾病有关，包括发育障碍、肌肉和骨质流失以及通过直接或间接受机械环境影响的信号通路的神经病理学2。然而，机械敏感信号通路4中受机械刺激3调控的基因和蛋白质在很大程度上仍然未知5，阻碍了机械调节机制的阐明和与病理机械转导相关的疾病的分子靶点的鉴定6，7.将机械生物学研究投射到相关生理过程的一个限制因素是使用具有常规培养皿的单个细胞而不是完整的多细胞生物。模式生物，如黑腹果蝇（果蝇），对理解参与动物发育的基因、信号通路和蛋白质做出了巨大贡献8，9，10。然而，在机械生物学研究中使用果蝇和其他多细胞模式生物受到实验工具挑战的阻碍。用于准备、分类、成像或应用各种刺激的传统技术大多需要手动操作;这些方法非常耗时，需要专业知识，引入可变性，并限制实验设计和样本量11。最近的微技术进步是实现具有非常高通量和高度受控实验参数的新型生物测定的重要资源12，13，14。
本文介绍了一种增强型微流体装置的开发，该装置以单轴压缩的形式对准、固定和精确地将机械刺激应用于数百个完整的 果蝇 胚胎15（图 1）。微流体系统与玻璃盖玻片的集成允许在刺激期间对样品进行高分辨率共聚焦成像。微流体装置还能够在刺激后快速收集胚胎以进行组学测定（图2）。本文描述了该装置的设计考虑因素，以及使用软光刻和实验表征的制造。由于制造这种器件的硅晶圆模具需要在具有高纵横比（AR）沟槽（AR >5）的大面积上均匀涂覆厚光刻胶（厚度>200μm），因此该方法大大修改了传统的光刻模具制造方案。通过这种方式，该方法促进了光刻胶的处理、粘附、涂覆、图案化和开发。此外，还讨论了潜在的陷阱及其解决方案。最后，使用其他多细胞系统（如 果蝇 卵室和脑类器官16）证明了这种设计和制造策略的多功能性。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 硅片模具的制备
- 首先用丙酮清洁硅片（见 材料表），然后用异丙醇（IPA）清洁。
- 将硅晶片放在250°C热板上30分钟以进行脱水烘烤（图3A）。
- 在蒸汽底炉中用六甲基二硅氮烷（HDMS）涂覆硅晶片（见 材料表）（工艺温度：150°C，工艺压力：2托，工艺时间：5分钟，HDMS体积：5μL）（图3B）。
- 将一瓶SU-8 2100光刻胶（见 材料表）放入60°C烘箱中15分钟以降低其粘度。
注意：在烤箱中加热时，光刻胶的粘度降低。粘度较低的光刻胶可以更容易地处理，并且可以更准确地浇注在晶圆顶部。 - 将硅晶片放在60°C热板上，为每英寸晶片倒入1mL加热的光刻胶，直到光刻胶覆盖大部分表面（图3C）。
- 将光刻胶涂层的硅片转移到旋涂机上（参见 材料表）。
- 首先以 250 rpm 的速度预旋转 30 秒，然后在 350 rpm 下再施加 30 秒，两者的加速度均为 100 rpm/s（图 3D）。
- 使用洁净室拭子从硅晶片边缘去除多余的光刻胶。
- 首先以 500 rpm 的速度以 100 rpm/s 的加速度旋转 15 秒，然后以 1450 rpm 的速度以 300 rpm/s 的加速度旋转 30 秒（图 3E）。
- 用洁净室棉签去除边缘珠。
- 将硅晶片放在50°C热板上，并在晶圆上喷洒丙酮以去除缺陷并促进均匀涂层（图3F）。
- 以 2°C/min 的速度缓慢将热板的温度升至 95 °C。
- 在95°C下软烘烤硅片50分钟（图3G）。
- 以 2°C/min 的速度缓慢冷却热板至室温。
- 将硅晶圆放在掩模对准器上（参见 材料表），并将光掩模放在其顶部（有关光掩模几何形状，请参阅 补充图1 ）。
- 使用接触掩模对准器通过光掩模将硅晶圆暴露在 350 mJ/cm 2 紫外光（35 mW/cm2 下 10 秒）（图 3H）。
- 通过将晶片放在50°C的热板上5分钟，在65°C下再加热5分钟，最后在80°C下再加热20分钟，在硅晶片上连续曝光后烘烤（图3I）。
- 以2°C/min的速度缓慢冷却硅片至室温。
- 将直径略小于硅晶片的磁力搅拌器放入烧杯中。将硅晶片倒置，并将其放在烧杯顶部。
- 将烧杯放入另一个较大的烧杯中，并用新的显影剂溶液填充较大的烧杯（参见 材料表）。在搅拌器打开的情况下，将硅晶片浸没在显影剂中30分钟（图3J）。
- 将硅晶片转移到装有新鲜显影剂的超声波浴超声仪中，以40kHz的频率放置1小时（图3K）。
- 用 IPA 溶液彻底清洗硅晶圆以获得最终的硅晶圆模具（图 3L）。
2. 微流控芯片的制造
- 将硅晶圆模具与 10 滴 （~500 μL） 三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷 （PFOCTS，见 材料表） 一起放入干燥器中附近的小称重船中。
- 将干燥器连接到真空泵上，压力约为200托30分钟。
- 关闭干燥阀并断开真空泵过夜以进行PFOCTS涂层。
- 通过将PDMS碱与固化剂（见 材料表）以10：1的比例混合来制备预固化的聚二甲基硅氧烷（PDMS）溶液。
- 通过将混合物放入离心机（室温下500× g5 分钟）中对混合物进行脱气。
注意：这种离心允许气泡迁移到顶部表面，从而在短时间内去除。 - 将脱气的PDMS溶液倒在硅晶圆模具上。
- 再次脱气以去除滞留在模具表面的气泡。
- 将PDMS在60°C烘箱中固化1小时50分钟（图3M）。
- 使用手术刀切割与微流控芯片几何形状相对应的固化PDMS区域的边界（图3N）。
- 剥离 PDMS 部件并将其倒置放在切割垫上。
- 使用剃须刀将PDMS部件切割成最终形状（图3O）。
- 使用活检打孔器（见 材料表）或带有钝尖的针头（图3P）在PDMS上打孔。
- 对于胚胎入口孔，请使用直径为4毫米的冲头。
- 对于胚胎出口孔，请使用直径为1.3毫米的冲头。
- 对于进气孔，请使用 2 mm 冲头。
- 使用一块透明胶带去除可能残留在PDMS图案表面上的任何颗粒。
- 首先用丙酮清洁 24 mm x 60 mm 矩形载玻片，然后用 IPA 清洁。
- 用连接到过滤空气源的气枪擦干玻璃表面。
- 通过将脱水烘烤放在250°C热板上2小时，将其应用于载玻片（图3Q）。
- 用烧杯盖住载玻片以防止表面污染。
- 将PDMS及其图案面朝上，将脱水的玻璃玻片放入等离子清洁器中（参见 材料表）。
- 用18 W的氧气等离子体处理PDMS和载玻片30秒。
- 将PDMS放在载玻片上，其图案表面朝向载玻片，通过共价键合 密封 微通道（图3R）。
- 使用镊子轻轻地将PDMS部件推到载玻片上，以确保完全的构象接触。
- 将完成的微流控芯片在室温下储存过夜，以使键合达到其最终强度。
3. 果蝇胚胎的制备
- 允许俄勒冈-R成蝇在苹果汁琼脂平板（1.5%琼脂，25%苹果汁，2.5%蔗糖）上产卵，并在产卵后的所需发育时间收集平板进行给定实验。
注意：对于本实验，在140分钟收集板以在细胞化阶段17为胚胎准备和分类。 - 用胚胎蛋液（0.12M NaCl，0.04%Triton-X 100）淹没琼脂，并用画笔轻轻搅拌胚胎以将它们从琼脂中取出。
- 将胚胎转移到50%漂白剂溶液中90秒，偶尔搅拌。通过组织筛过滤胚胎，并用水彻底洗去漂白剂溶液。
- 将胚胎转移到90毫米玻璃培养皿中，并有足够的胚胎蛋液以完全覆盖胚胎。
- 在解剖显微镜上用透照检查胚胎，并选择所需发育阶段的胚胎以加载到微流体装置中。
注意：在此应用程序中，选择了细胞化阶段的胚胎。有关如何确保正确选择发育阶段的详细说明，请参阅 果蝇17的实验室手册。
4. 利用微流控芯片对果蝇胚胎进行机械刺激
- 通过主胚胎入口向所有七个胚胎微通道填充0.4μm过滤的IPA。
- 用 0.4 μm 过滤去离子 （DI） 水替换 IPA。
- 用胚胎蛋液代替去离子水。
- 使用玻璃移液管从玻璃培养皿中收集大约 100 个预选胚胎。
- 将胚胎移液到胚胎入口（图4A）。
- 使用便携式真空泵向气体入口施加约3 PSI负压（即真空）以打开胚胎微通道。
- 向下倾斜微流控芯片，使胚胎自动对齐并沉淀到胚胎微通道中（图4B）。
- 如果胚胎微通道入口被同时进入的多个胚胎堵塞，请向上倾斜微流控芯片，然后再次向下倾斜以清除堵塞。
- 根据所需的吞吐量，将多达300个胚胎引入胚胎微通道。
- 胚胎加载完成后，移除真空以固定胚胎。
- 将微流控芯片倾斜回水平位置（图4C）。
- 将带有压力表的便携式正压源（见 材料表）连接到进气口以施加 3 PSI 压缩（图 4D）。
- 持续检查压力表，以确保应用的压缩水平一致。
- 如果要对机械刺激的胚胎进行实时成像实验，请将微流控芯片放在标准显微镜载物台玻璃载玻片支架上，气体入口连接到压力源。
- 压缩实验完成后，可以收集胚胎进行下游分析。为此，首先，将真空施加到气体入口以释放胚胎。
- 然后，向上倾斜微流控芯片以使胚胎向胚胎引入端口移动（图4E）。
- 使用玻璃移液管从微流控芯片中收集胚胎。
注意：收集后，可以通过将果蝇生长到成年期来研究压缩对胚胎发育和活力的影响。微流体装置的高通量处理能力还使胚胎可用于需要大量样品的下游组学测定（图2）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
微流体系统分为两个由可变形的PDMS侧壁隔开的子隔间。第一个隔间是液体系统，其中果 蝇 胚胎被引入，自动对齐，排列和压缩。第二个隔室是气体系统，其中压缩通道两侧的气体压力通过死端微通道 控制 ，以精确控制压缩通道的有效宽度。微流体装置在底部用载玻片密封，从而能够对微流控装置相关尺寸的样品进行高分辨率实时成像（补充图2）。
多细胞生物如 果蝇 胚胎在所需的胚胎发育阶段被选择。就 果蝇 胚胎而言，所有发育阶段都同样符合这种方法，因为胚胎大小在孵化之前不会改变。使用玻璃微量移液器通过大入口（即直径4mm）将选定的样品引入微流体装置。然后将装置向下倾斜，以使胚胎流入以平行方式组织的七个压缩通道。连接胚胎入口和压缩通道的狭窄中庭确保胚胎在到达压缩通道入口之前自动对齐。施加在气体入口上的真空使可变形侧壁向外偏转，增加有效微通道宽度并允许胚胎依次进入压缩通道。七个压缩通道长 22 毫米，并行，单次运行可容纳多达 300 个 果蝇 胚胎。压缩通道终止于瓶颈，其中微通道的宽度减小到比样品小得多的水平，这允许流体在保留胚胎的同时流过。通过这种方法，胚胎集中在压缩通道内。引入胚胎后，气体入口中的真空被移除，微通道侧壁返回到其原始位置并从两侧固定排列的胚胎。压缩可以通过对气体入口施加正压来实现，从而将可变形的侧壁向内偏转并减小有效的微通道宽度。施加到胚胎上的压缩量可以通过定制微通道尺寸、可变形侧壁的厚度、PDMS 的杨氏模量和施加的压力来精确调节。压缩实验后，可以通过对气体入口施加真空并将微流体装置向另一个方向倾斜来收集胚胎进行下游分析。
该微流体装置是使用软光刻18制造的。然而，使用超厚光刻胶制造具有高纵横比特征的厚结构需要与标准制造定义的协议存在重大偏差（图3）。与六甲基二硅氮烷（HDMS）涂层一起，在旋涂之前清洁硅片以去除有机残留物，并烘烤以去除表面水分。这些额外的步骤增强了厚光刻胶层与硅晶圆的结合。光刻胶在浇注前也经过加热以降低粘度，这对于覆盖整个晶圆表面至关重要。目标光刻胶涂层厚度通过三个纺丝步骤实现，其中每个纺丝步骤逐渐去除多余的光刻胶而不会污染晶圆表面。受先前发表的方法19的启发，在硅晶片上喷涂丙酮（光刻胶的溶剂之一），以消除光刻胶的缺陷并增加涂层的均匀性。在连续的烘烤步骤中，温度缓慢变化以最小化热应力，这可能导致光刻胶从硅晶片中分层。由于类似的问题，烘烤温度降低，同时增加了其持续时间。高纵横比沟槽的光刻制造中最具挑战性的步骤之一是在紫外线照射后去除未固化的光刻胶。为了最大限度地提高显影剂溶液在沟槽中的渗透力，将硅片倒置，并用搅拌器与显影剂溶液连续混合。通过这种方式，新鲜的显影剂溶液可以与未固化的光刻胶反应并去除。此步骤之后是超声波浴，其中剩余的光刻胶被去除。一旦硅晶圆模具成功生成，标准的复制成型过程包括固化剂混合、脱气、浇注、固化、剥离、冲孔和等离子键合，用于制造最终的微流体装置20。
通过将果 蝇 胚胎加载到压缩通道中并向气体通道施加正压来实验确定微流体装置的功能。在显微镜下测量胚胎宽度减小（图5A）证明了如何使用气体压力来获得目标压缩水平（图5B）。经过压缩的对齐胚胎的延时图像也证明了该系统与共聚焦显微镜的兼容性。
图 1：微流体装置的设计和功能。 微流体装置由七个平行压缩微通道组成，可以同时测试多达300个完整的 果蝇 胚胎。（A）胚胎通过主胚胎入口 引入 装置，并在进入微通道时沿后 - 前轴自动对齐。（B）当通过气体入口施加负压时，胚胎可以自由移动，因为这会使可变形的微通道侧壁向外偏转。这允许它们作为一条车道进行装载和卸载。当负压被移除时，胚胎被固定在微通道中。当施加正压时，微通道侧壁通过向内偏转来压缩胚胎。 请点击此处查看此图的大图。
图2：用于机械生物学研究的微流体压缩实验的工艺流程 。 （A）高通量微流控机械刺激装置由PDMS和载玻片制成，可处理数百个多细胞生物样品。（B）该设备专为与不同的多细胞系统配合使用而设计，例如 果 蝇卵室， 果蝇 胚胎或脑类器官。该设备可以将稳定或动态压缩模式应用于生物系统。（C）系统可以在压缩过程中随着时间的推移用共聚焦显微镜成像。可以分析荧光标记蛋白响应压缩的表达水平和定位。收集后，可以分析系统以进行刺激后测试和成像。微流体装置的高通量处理能力还允许系统裂解并用于需要大量样品的基于组学的生物测定，如图所示，以二维差分凝胶电泳图像为例。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：具有厚光刻胶和高纵横比沟槽的硅晶圆模具的制造过程。 （A，B）整个制造过程从准备用于光刻胶涂层的硅晶圆开始。（C-G）将厚厚的光刻胶涂层均匀地涂覆在硅晶片上。（H，I）光刻胶通过光掩模进行紫外曝光。（J-L）从未固化的光刻胶中去除硅晶片。（周一至平）PDMS部分是通过软光刻制造的。（问，右）该设备被密封在载玻片上。请点击此处查看此图的大图。
图4：微流体装置的操作。 （A）首先，将胚胎移液到主胚胎入口。（B）其次，对气体入口施加负压，并将微流体装置向下倾斜以使胚胎对齐并加载到微通道中。（C）第三，去除负压以固定胚胎。（四）第四，对气体通道施加正压以压缩胚胎。（E）最后，通过切换回负压并将微流体装置向上倾斜从微流体装置中收集胚胎。 请点击此处查看此图的大图。
图5：胚胎压缩水平的实验测量 。 （A）不同气体压力水平下微流体装置内的代表性胚胎。虽然胚胎在真空或神经压力状态下不会经历显着的压缩，但当施加正压时它们会被压缩。（B）在不同气体压力水平下施加到胚胎上的单轴压缩应变量（误差线代表标准偏差）。 请点击此处查看此图的大图。
图6：按照相同策略设计和制造的微流体装置中脑类器官的压缩 。 （A）随着气体压力的增加，脑类器官的压缩水平越来越高。（B）不同压力水平下微通道内脑类器官的宽度。 请点击此处查看此图的大图。
补充图1： 用于硅晶圆模具光刻制造的光掩模的顶视图。在直径4的区域内有五个相同的微流体器件几何形状。 请点击此处下载此文件。
补充图2： 本研究中使用的微流体装置的顶视图具有相关尺寸。 请点击此处下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本文介绍了一种微流体装置的开发，该装置可以自动对齐，固定并精确地将机械刺激应用于数百个完整的 果蝇 胚胎。微流体系统与薄玻璃盖玻片的集成允许在刺激期间用高分辨率共聚焦显微镜对胚胎进行成像。微流体装置还能够在刺激后立即收集胚胎以进行下游生物测定。详细描述了该器件的设计考虑因素、制造方法和特性。硅晶圆模具制造方案允许光刻胶具有高纵横比沟槽的均匀厚涂层。
为了使这种制造方法取得成功，重要的是降低烘烤步骤的温度，并在硅片涂覆光刻胶后最大限度地降低硅片的加热和冷却速率。如果操作不当，光刻胶涂层很容易分层并改变模具几何形状。一旦硅晶圆模具成功制造，就可以将其复制到更耐用的材料中，以防止在连续的PDMS复制成型步骤中损坏原始模具，其中还包含加热和冷却循环21。通过复制成型制造PDMS微流控装置依赖于从模具中成功剥离高纵横比侧壁结构。为了使该制造步骤可靠，必须用硅烷化剂适当地涂覆硅片表面以促进剥离。在制造大约20个PDMS器件后，涂层也应更新，以补偿每个剥离步骤中硅烷层的部分去除。否则，侧壁可能会卡在光刻胶图案内，使模具无法使用。由于施加到样品上的压缩水平是侧壁机械性能的函数，因此保持PDMS复制成型工艺参数的一致性非常重要。在制造过程中，必须密切监测固化剂比例、温度和持续时间。此外，由于该装置策略用于同时对大量多细胞生物施加机械刺激，因此它们在微通道内的聚集会导致堵塞。尽管本文中使用的生物体没有遇到这个问题，但如果确实发生这种情况，文献中存在克服这个问题的潜在解决方案，例如在引入样品22期间使用载体溶液。
尽管在这项工作中将 果蝇 胚胎用作整个多细胞生物，但此处介绍的设计和制造策略可以通过相应地改变设备的尺寸来应用于其他多细胞系统的机械刺激（图2）。这可以通过扩大中央微通道的宽度和高度以匹配多细胞系统的宽度和高度来实现。通过这种方法，样品可以进入微通道，并通过用正气动压力偏转可变形的侧壁来类似地压缩。为了证明这种方法，为 果蝇 卵室以及脑类器官制造了类似的装置。这些系统能够对这些生物系统进行精确的机械压缩，类似于 果蝇 胚胎实验（图6）。此外，由于这种方法能够补充固定化样品周围的介质，因此对于需要快速更换介质而不干扰样品的化学刺激实验非常有用。总体而言，这种多功能方法结合了微流体系统的精度和高通量自动化能力，同时能够在各种多细胞系统（如小组织样本、类器官、胚胎和卵母细胞）上进行新的机械生物学研究。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者对本手稿中描述的产品没有经济利益，也没有其他信息要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国家科学基金会（CMMI-1946456）、空军科学研究办公室（FA9550-18-1-0262）和美国国立卫生研究院（R01AG06100501A1;R21AR08105201A1）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
References
- Wang, J. H. -C., Thampatty, B. P. An introductory review of cell mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).
- Ingber, D. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).
- Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering. Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).
- Bellin, R. M., et al. Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).
- Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).
- Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).
- Maurer, M., Lammerding, J. The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).
- Jennings, B. H. Drosophila-A versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Konno, M., et al. State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine. Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).
- Morgan, T. H. Sex limited inheritance in Drosophila. Science. 32 (812), 120-122 (1910).
- Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly. Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).
- Jayamohan, H., et al. Chapter 11 - Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies. Molecular Diagnostics. Patrinos, G., et al. , Academic Press. Cambridge, MA. 197-217 (2017).
- Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology. Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).
- Mohammed, D., et al. Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).
- Shorr, A. Z., Sönmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics. Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).
- Kim, Y. T., et al. Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).
- Ashburner, M. Drosophila. A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (1989).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro-and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).
- Lee, H., et al. A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
- Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. Polycarbonate heat molding for soft lithography. Small. 16 (16), 2000241 (2020).
- Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos. Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).
