Summary
Il presente protocollo descrive la progettazione, la fabbricazione e la caratterizzazione di un sistema microfluidico in grado di allineare, immobilizzare e comprimere con precisione centinaia di embrioni di Drosophila melanogaster con un intervento minimo da parte dell'utente. Questo sistema consente l'imaging ad alta risoluzione e il recupero di campioni per l'analisi post-stimolazione e può essere scalato per adattarsi ad altri sistemi biologici multicellulari.
Abstract
Durante l'embriogenesi, il movimento cellulare coordinato genera forze meccaniche che regolano l'espressione e l'attività genica. Per studiare questo processo, sono stati utilizzati strumenti come l'aspirazione o la compressione del coverslip per stimolare meccanicamente embrioni interi. Questi approcci limitano la progettazione sperimentale in quanto sono imprecisi, richiedono una manipolazione manuale e possono elaborare solo un paio di embrioni contemporaneamente. I sistemi microfluidici hanno un grande potenziale per automatizzare tali attività sperimentali, aumentando al contempo la produttività e la precisione. Questo articolo descrive un sistema microfluidico sviluppato per comprimere con precisione interi embrioni di Drosophila melanogaster (moscerino della frutta). Questo sistema è dotato di microcanali con pareti laterali deformabili azionate pneumaticamente e consente l'allineamento dell'embrione, l'immobilizzazione, la compressione e la raccolta post-stimolazione. Parallelizzando questi microcanali in sette corsie, i modelli di compressione stazionari o dinamici possono essere applicati a centinaia di embrioni di Drosophila contemporaneamente. La fabbricazione di questo sistema su un vetrino facilita la stimolazione meccanica simultanea e l'imaging di campioni con microscopi ad alta risoluzione. Inoltre, l'utilizzo di materiali biocompatibili, come il PDMS, e la capacità di far fluire il fluido attraverso il sistema rendono questo dispositivo capace di esperimenti a lungo termine con campioni dipendenti dai media. Questo approccio elimina anche la necessità di un montaggio manuale che sollecita meccanicamente i campioni. Inoltre, la capacità di raccogliere rapidamente campioni dai microcanali consente analisi post-stimolazione, compresi i saggi -omici che richiedono grandi numeri di campioni irraggiungibili utilizzando i tradizionali approcci di stimolazione meccanica. La geometria di questo sistema è facilmente scalabile a diversi sistemi biologici, consentendo a numerosi campi di beneficiare delle caratteristiche funzionali qui descritte, tra cui l'elevata produttività del campione, la stimolazione meccanica o l'immobilizzazione e l'allineamento automatico.
Introduction
I sistemi viventi sperimentano e rispondono costantemente a vari input meccanici per tutta la loro vita1. La meccanotrasduzione è stata collegata a molte malattie, tra cui disturbi dello sviluppo, perdita muscolare e ossea e neuropatologie attraverso vie di segnalazione direttamente o indirettamente influenzate dall'ambiente meccanico2. Tuttavia, i geni e le proteine che sono regolati dalla stimolazione meccanica3 nelle vie di segnalazione meccanosensibili4 rimangono in gran parte sconosciuti5, impedendo la delucidazione dei meccanismi di regolazione meccanica e l'identificazione di bersagli molecolari per le malattie associate alla meccanotrasduzione patologica 6,7 . Un fattore limitante nel proiettare gli studi di meccanobiologia sui processi fisiologici correlati è l'utilizzo di singole cellule con piatti di coltura convenzionali invece di organismi multicellulari intatti. Organismi modello, come Drosophila melanogaster (moscerino della frutta), hanno contribuito notevolmente alla comprensione dei geni, delle vie di segnalazione e delle proteine coinvolte nello sviluppo animale 8,9,10. Tuttavia, l'uso di Drosophila e di altri organismi modello multicellulari nella ricerca meccanobiologica è stato ostacolato da sfide con strumenti sperimentali. Le tecniche convenzionali per la preparazione, l'ordinamento, l'imaging o l'applicazione di vari stimoli richiedono principalmente una manipolazione manuale; Questi approcci richiedono tempo, richiedono esperienza, introducono variabilità e limitano il disegno sperimentale e la dimensione del campione11. I recenti progressi microtecnologici sono una grande risorsa per consentire nuovi saggi biologici con un rendimento molto elevato e parametri sperimentali altamente controllati12,13,14.
Questo articolo descrive lo sviluppo di un dispositivo microfluidico potenziato per allineare, immobilizzare e applicare con precisione la stimolazione meccanica sotto forma di compressione uniassiale a centinaia di embrioni interi di Drosophila 15 (Figura 1). L'integrazione del sistema microfluidico con un vetrino di vetro ha permesso l'imaging confocale ad alta risoluzione dei campioni durante la stimolazione. Il dispositivo microfluidico ha anche permesso una rapida raccolta degli embrioni dopo la stimolazione per l'esecuzione di saggi -omici (Figura 2). Le spiegazioni delle considerazioni di progettazione di questo dispositivo, nonché la fabbricazione mediante litografia morbida e caratterizzazione sperimentale, sono descritte nel presente documento. Poiché la realizzazione di uno stampo per wafer di silicio di tale dispositivo richiede un rivestimento uniforme di fotoresist spesso (spessore >200 μm) su ampie aree con trincee ad alto rapporto di aspetto (AR) (AR >5), questo metodo ha modificato considerevolmente il tradizionale protocollo di fabbricazione di stampi fotolitografici. In questo modo, questo metodo ha facilitato la manipolazione, l'adesione, il rivestimento, il pattern e lo sviluppo del fotoresist. Inoltre, vengono discusse le potenziali insidie e le loro soluzioni. Infine, la versatilità di questa strategia di progettazione e fabbricazione è stata dimostrata utilizzando altri sistemi multicellulari come camere d'uovo di Drosophila e organoidi cerebrali16.
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Protocol
1. Preparazione dello stampo per wafer di silicio
- Pulire il wafer di silicio (vedi tabella dei materiali) prima con acetone e poi con alcool isopropilico (IPA).
- Posizionare il wafer di silicio su una piastra calda a 250 °C per 30 minuti per la disidratazione (Figura 3A).
- Rivestire il wafer di silicio con esametildisilazano (HDMS) in un forno a vapore (vedere la tabella dei materiali) (temperatura di processo: 150 °C, pressione di processo: 2 Torr, tempo di processo: 5 min, volume HDMS: 5 μL) (Figura 3B).
- Mettere una bottiglia di SU-8 2100 photoresist (vedi Tabella dei materiali) in un forno a 60 °C per 15 minuti per ridurne la viscosità.
NOTA: Dopo il riscaldamento nel forno, la viscosità del fotoresist diminuisce. I fotoresist con viscosità ridotta possono essere maneggiati più facilmente e possono essere versati con maggiore precisione sulla parte superiore del wafer. - Posizionare il wafer di silicio su una piastra riscaldante a 60 °C e versare 1 mL di fotoresist riscaldato per ogni pollice del wafer fino a quando il fotoresist copre la maggior parte della superficie (Figura 3C).
- Trasferire il wafer di silicio rivestito con fotoresist su uno spin coater (vedere Tabella dei materiali).
- Applicare il pre-spin prima a 250 giri/min per 30 s e poi a 350 giri/min per altri 30 s, entrambi con accelerazione di 100 giri/min (Figura 3D).
- Rimuovere il fotoresist in eccesso dai bordi del wafer di silicio utilizzando un tampone per camera bianca.
- Applicare una rotazione prima a 500 giri/min per 15 s con accelerazione di 100 giri/min e poi a 1450 giri/min per 30 giri/min con accelerazione di 300 giri/min (Figura 3E).
- Rimuovere il bordo con un tampone per camera bianca.
- Posizionare il wafer di silicio su una piastra riscaldante a 50 °C e spruzzare acetone sul wafer per rimuovere le imperfezioni e promuovere un rivestimento uniforme (Figura 3F).
- Aumentare lentamente la temperatura della piastra riscaldante a 95 °C alla velocità di 2°C/min.
- Cuocere morbidamente il wafer di silicio a 95 °C per 50 minuti (Figura 3G).
- Raffreddare lentamente la piastra calda a temperatura ambiente ad una velocità di 2°C/min.
- Posizionare il wafer di silicio su un allineatore per maschera (vedere la tabella dei materiali) e posizionare la fotomaschera sopra di esso (fare riferimento alla Figura supplementare 1 per la geometria della maschera fotografica).
- Esporre il wafer di silicio a 350 mJ/cm 2 di luce UV (35 mW/cm2 per 10 s) attraverso la fotomaschera utilizzando l'allineatore della maschera di contatto (Figura 3H).
- Applicare cuocere consecutivamente post-esposizione sul wafer di silicio posizionando il wafer su una piastra calda a 50 °C per 5 minuti, a 65 °C per altri 5 minuti e infine a 80 °C per altri 20 minuti (Figura 3I).
- Raffreddare lentamente il wafer di silicio a temperatura ambiente alla velocità di 2 °C/min.
- Posizionare un agitatore magnetico con un diametro leggermente inferiore rispetto al wafer di silicio in un becher. Capovolgere il wafer di silicio e posizionarlo sopra il becher.
- Posizionare il becher all'interno di un altro becher più grande e riempire il becher più grande con una nuova soluzione di sviluppo (vedere Tabella dei materiali). Lasciare il wafer di silicio immerso nello sviluppatore per 30 minuti con l'agitatore acceso (Figura 3J).
- Trasferire il wafer di silicio in un sonicatore a bagno ad ultrasuoni riempito con lo sviluppatore fresco per 1 ora a 40 kHz (Figura 3K).
- Lavare accuratamente il wafer di silicio con una soluzione IPA per ottenere lo stampo finale del wafer di silicio (Figura 3L).
2. Fabbricazione del chip microfluidico
- Posizionare lo stampo per wafer di silicio in un essiccatore insieme a 10 gocce (~ 500 μL) di tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluoroottil)silano (PFOCTS, vedi tabella dei materiali) in una piccola barca di pesatura nelle vicinanze.
- Collegare l'essiccatore a una pompa per vuoto a circa 200 Torr per 30 minuti.
- Spegnere la valvola dell'essiccatore e scollegare la pompa per vuoto durante la notte per il rivestimento PFOCTS.
- Preparare la soluzione di polidimetilsilossano (PDMS) prepolimerizzato mescolando la base PDMS con l'agente di polimerizzazione (vedere la tabella dei materiali) con un rapporto di 10:1.
- Degasare la miscela mettendola in una centrifuga (500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente).
NOTA: Questa centrifugazione consente alle bolle di migrare verso la superficie superiore e di conseguenza di essere rimosse in un breve periodo di tempo. - Versare la soluzione PDMS degassata sullo stampo del wafer di silicio.
- Degasarlo nuovamente per rimuovere le bolle d'aria intrappolate sulla superficie dello stampo.
- Polimerizzare il PDMS in un forno a 60 °C per 1 ora e 50 minuti (Figura 3M).
- Utilizzare un bisturi per tagliare i bordi della regione PDMS polimerizzata corrispondente alla geometria del chip microfluidico (Figura 3N).
- Sbucciare la parte PDMS e posizionarla capovolta su un tappetino da taglio.
- Utilizzare un rasoio per tagliare la parte PDMS nella sua forma finale (Figura 3O).
- Pugni i fori di ingresso e uscita sul PDMS usando un punzone bioptico (vedi Tabella dei materiali) o un ago con una punta smussata (Figura 3P).
- Per il foro di ingresso dell'embrione, utilizzare un punzone di 4 mm di diametro.
- Per i fori di uscita dell'embrione, utilizzare un punzone di 1,3 mm di diametro.
- Per il foro di ingresso del gas, utilizzare un punzone da 2 mm.
- Utilizzare un pezzo di scotch per rimuovere eventuali particelle che potrebbero rimanere sulla superficie modellata del PDMS.
- Pulire un vetrino rettangolare di vetro 24 mm x 60 mm prima con acetone e poi con alcool isopropilico.
- Asciugare la superficie del vetro con una pistola ad aria compressa collegata a una fonte d'aria filtrata.
- Applicare un forno per disidratazione sul vetrino posizionandolo su una piastra calda a 250 °C per 2 ore (Figura 3Q).
- Coprire il vetrino con un becher per evitare la contaminazione superficiale.
- Posizionare il PDMS, con il suo lato modellato verso l'alto, e il vetro disidratato scivolare in un detergente al plasma (vedere Tabella dei materiali).
- Trattare il PDMS e il vetrino con plasma di ossigeno a 18 W per 30 s.
- Posizionare il PDMS sul vetrino con la superficie modellata rivolta verso il vetrino per sigillare i microcanali tramite legame covalente (Figura 3R).
- Utilizzare una pinzetta per spingere delicatamente la parte PDMS contro il vetrino per garantire un contatto conformazionale completo.
- Conservare il chip microfluidico completato a temperatura ambiente durante la notte per consentire al legame di raggiungere la sua forza finale.
3. Preparazione degli embrioni di moscerino della frutta
- Consentire alle mosche adulte Oregon-R di deporre le uova su piastre di agar al succo di mela (1,5% di agar, 25% di succo di mela, 2,5% di saccarosio) e raccogliere le piastre al momento di sviluppo desiderato dopo la deposizione delle uova per l'esperimento dato.
NOTA: Per i presenti esperimenti, le piastre sono state raccolte a 140 minuti per preparare e ordinare gli embrioni nella fase di cellularizzazione17. - Inondare l'agar con il lavaggio dell'ovulo embrionale (0,12 M NaCl, 0,04% Triton-X 100) e agitare delicatamente gli embrioni con un pennello per rimuoverli dall'agar.
- Trasferire gli embrioni in una soluzione di candeggina al 50% per 90 s, mescolando di tanto in tanto. Filtrare gli embrioni attraverso un setaccio tissutale e lavare accuratamente la soluzione di candeggina con acqua.
- Trasferire gli embrioni in una capsula di Petri di vetro da 90 mm con un lavaggio sufficiente a coprire completamente gli embrioni.
- Esaminare gli embrioni con transilluminazione su un microscopio da dissezione e selezionare gli embrioni della fase di sviluppo desiderata per il caricamento nel dispositivo microfluidico.
NOTA: In questa applicazione sono stati selezionati embrioni in fase di cellularizzazione. Le descrizioni dettagliate di come garantire una corretta selezione della fase di sviluppo sono disponibili nel manuale di laboratorio per Drosophila17.
4. Applicare la stimolazione meccanica agli embrioni di moscerino della frutta utilizzando il chip microfluidico
- Innesca tutti e sette i microcanali embrionali riempiendoli con alcool isopropilico filtrato da 0,4 μm attraverso la porta principale di ingresso dell'embrione.
- Sostituire l'alcool isopropilico con acqua deionizzata (DI) filtrata da 0,4 μm.
- Sostituire l'acqua DI con la soluzione di lavaggio dell'uovo embrionale.
- Raccogliere circa 100 embrioni preselezionati dalla capsula di Petri di vetro utilizzando una pipetta di vetro.
- Pipettare gli embrioni nella porta di ingresso dell'embrione (Figura 4A).
- Applicare una pressione negativa di circa 3 PSI (cioè vuoto) all'ingresso del gas utilizzando una pompa per vuoto portatile per aprire i microcanali dell'embrione.
- Inclinare il chip microfluidico verso il basso in modo che gli embrioni si allineino automaticamente e si depositino nei microcanali dell'embrione (Figura 4B).
- Se le entrate dei microcanali dell'embrione vengono ostruite da più embrioni che entrano contemporaneamente, inclinare il chip microfluidico verso l'alto e poi di nuovo verso il basso per eliminare l'intasamento.
- In base alla produttività richiesta, introdurre fino a 300 embrioni nei microcanali embrionali.
- Una volta completato il carico dell'embrione, rimuovere il vuoto per immobilizzare gli embrioni.
- Inclinare il chip microfluidico in posizione orizzontale (Figura 4C).
- Collegare una sorgente di pressione positiva portatile (vedere la tabella dei materiali) con un manometro all'ingresso del gas per applicare una compressione di 3 PSI (Figura 4D).
- Controllare continuamente il manometro per garantire che venga applicato un livello di compressione costante.
- Se verranno condotti esperimenti di imaging dal vivo sugli embrioni stimolati meccanicamente, posizionare il chip microfluidico su un supporto per vetrino da palcoscenico standard per microscopio con l'ingresso del gas collegato alla sorgente di pressione.
- Una volta completato l'esperimento di compressione, gli embrioni possono essere raccolti per l'analisi a valle. Per fare ciò, in primo luogo, applicare il vuoto all'ingresso del gas per liberare gli embrioni.
- Quindi, inclinare il chip microfluidico verso l'alto in modo che gli embrioni si muovano verso la porta di introduzione dell'embrione (Figura 4E).
- Raccogliere gli embrioni dal chip microfluidico usando una pipetta di vetro.
NOTA: Al momento della raccolta, gli effetti della compressione sullo sviluppo embrionale e sulla vitalità possono essere studiati facendo crescere i moscerini della frutta nell'età adulta. La capacità di elaborazione ad alta produttività del dispositivo microfluidico consente inoltre di utilizzare gli embrioni in saggi basati su omiche a valle che richiedono un gran numero di campioni (Figura 2).
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Representative Results
Il sistema microfluidico è diviso in due sottocompartimenti separati da pareti laterali PDMS deformabili. Il primo compartimento è il sistema liquido in cui vengono introdotti gli embrioni di Drosophila , automaticamente allineati, allineati e compressi. Il secondo compartimento è un sistema a gas in cui la pressione del gas su entrambi i lati dei canali di compressione è controllata tramite microcanali senza uscita per controllare con precisione la larghezza effettiva dei canali di compressione. Il dispositivo microfluidico è sigillato con un vetrino nella parte inferiore, che consente l'imaging live ad alta risoluzione dei campioni (figura supplementare 2) per le dimensioni rilevanti del dispositivo microfluidico.
Gli organismi multicellulari come gli embrioni di Drosophila vengono selezionati nella fase di sviluppo embrionale desiderata. Nel caso degli embrioni di Drosophila , tutte le fasi di sviluppo sono ugualmente compatibili con questo approccio poiché le dimensioni dell'embrione non cambiano fino alla schiusa. I campioni selezionati vengono introdotti nel dispositivo microfluidico attraverso l'ingresso grande (cioè 4 mm di diametro) utilizzando una micropipetta di vetro. Il dispositivo viene quindi inclinato verso il basso per consentire agli embrioni di fluire nei sette canali di compressione organizzati in modo parallelo. Il restringimento dell'atrio che collega l'ingresso dell'embrione al canale di compressione garantisce l'allineamento automatico degli embrioni prima che raggiungano l'ingresso dei canali di compressione. Il vuoto applicato all'ingresso del gas devia le pareti laterali deformabili verso l'esterno, aumentando l'effettiva larghezza del microcanale e consentendo agli embrioni di entrare nei canali di compressione in sequenza. I sette canali di compressione sono lunghi 22 mm e, in parallelo, possono ospitare fino a 300 embrioni di Drosophila in una singola corsa. I canali di compressione terminano in un collo di bottiglia in cui la larghezza del microcanale diminuisce a un livello molto più piccolo di quello dei campioni, il che consente al fluido di fluire attraverso mantenendo gli embrioni. Attraverso questo approccio, gli embrioni sono concentrati all'interno dei canali di compressione. Dopo l'introduzione degli embrioni, il vuoto nell'ingresso del gas viene rimosso e le pareti laterali del microcanale ritornano nella loro posizione originale e immobilizzano gli embrioni allineati da entrambi i lati. La compressione può essere ottenuta applicando una pressione positiva all'ingresso del gas, che devia le pareti laterali deformabili verso l'interno e riduce la larghezza effettiva del microcanale. La quantità di compressione applicata agli embrioni può essere regolata con precisione adattando le dimensioni dei microcanali, lo spessore delle pareti laterali deformabili, il modulo di Young del PDMS e la pressione applicata. Dopo l'esperimento di compressione, gli embrioni possono essere raccolti per l'analisi a valle applicando un vuoto all'ingresso del gas e inclinando il dispositivo microfluidico in un'altra direzione.
Questo dispositivo microfluidico è stato fabbricato utilizzando la litografia morbida18. Tuttavia, la fabbricazione di strutture spesse con caratteristiche di rapporto di aspetto elevato utilizzando fotoresist ultraspessi richiede importanti deviazioni dai protocolli definiti per la fabbricazione standard (Figura 3). Insieme al rivestimento di esametildisilazano (HDMS), i wafer di silicio sono stati puliti prima del rivestimento di centrifuga per rimuovere i residui organici e cotti per rimuovere l'umidità superficiale. Questi passaggi aggiuntivi hanno migliorato il legame dello spesso strato fotoresist al wafer di silicio. Anche il fotoresist è stato riscaldato prima di versare per ridurre la viscosità, che era fondamentale per coprire l'intera superficie del wafer. Lo spessore del rivestimento fotoresist target è stato ottenuto attraverso tre fasi di rotazione, in cui ogni fase di rotazione ha gradualmente rimosso il fotoresist in eccesso senza contaminare la superficie del wafer. Ispirato ai metodi precedentemente pubblicati19, l'acetone è stato spruzzato, che è uno dei solventi del fotoresist, sul wafer di silicio per eliminare le imperfezioni del fotoresist e aumentare l'uniformità del rivestimento. Durante le fasi di cottura consecutive, la temperatura è stata modificata lentamente per ridurre al minimo lo stress termico, che potrebbe portare alla delaminazione del fotoresist dal wafer di silicio. A causa di preoccupazioni simili, la temperatura di cottura è stata ridotta aumentando la sua durata. Uno dei passaggi più impegnativi nella fabbricazione fotolitografica di trincee ad alto rapporto d'aspetto è stata la rimozione del fotoresist non polimerizzato dopo l'esposizione ai raggi UV. Per massimizzare la penetrazione della soluzione di sviluppo nelle trincee, il wafer di silicio è stato capovolto e continuamente miscelato con la soluzione di sviluppo con un agitatore. In questo modo, la nuova soluzione di sviluppo potrebbe reagire e rimuovere il fotoresist non polimerizzato. Questo passaggio è stato seguito da un bagno ad ultrasuoni in cui è stato rimosso il fotoresist rimanente. Una volta generato con successo lo stampo per wafer di silicio, il processo di stampaggio standard consisteva nella miscelazione dell'agente di polimerizzazione, degasaggio, versamento, polimerizzazione, pelatura, punzonatura e incollaggio al plasma per la fabbricazione del dispositivo microfluidico finale20.
La funzionalità del dispositivo microfluidico è stata determinata sperimentalmente caricando embrioni di Drosophila nei canali di compressione e applicando una pressione positiva ai canali del gas. Le misurazioni della larghezza decrescente degli embrioni al microscopio (Figura 5A) dimostrano come la pressione del gas può essere utilizzata per ottenere un livello di compressione target (Figura 5B). Le immagini time-lapse di embrioni allineati sottoposti a compressione dimostrano anche la compatibilità di questo sistema con la microscopia confocale.
Figura 1: Il design e la funzione del dispositivo microfluidico. Il dispositivo microfluidico è costituito da sette microcanali a compressione parallela che possono testare fino a 300 embrioni interi di Drosophila contemporaneamente. (A) Gli embrioni sono stati introdotti nel dispositivo attraverso l'ingresso principale dell'embrione e si sono allineati lungo l'asse posteriore-anteriore automaticamente quando sono entrati nei microcanali. (B) Gli embrioni si muovevano liberamente quando veniva applicata una pressione negativa attraverso l'ingresso del gas, poiché ciò deviava le pareti laterali deformabili del microcanale verso l'esterno. Ciò ha permesso il loro carico e scarico come una sola corsia. Quando la pressione negativa è stata rimossa, gli embrioni sono stati immobilizzati nei microcanali. Quando veniva applicata una pressione positiva, le pareti laterali dei microcanali comprimevano gli embrioni deviando verso l'interno. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Flusso di processo di esperimenti di compressione microfluidica per studi di meccanobiologia. (A) Il dispositivo di meccanostimolazione microfluidica ad alta produttività è costituito da PDMS e da un vetrino per elaborare centinaia di campioni biologici multicellulari. (B) Il dispositivo è progettato per funzionare con diversi sistemi multicellulari come camere uovo di Drosophila, embrioni di Drosophila o organoidi cerebrali. Questo dispositivo può applicare modelli di compressione stazionari o dinamici ai biosistemi. (C) I sistemi possono essere ripresi con un microscopio confocale nel tempo mentre vengono compressi. Possono essere analizzati i livelli di espressione e la localizzazione di proteine marcate con fluorescenza in risposta alla compressione. Al momento della raccolta, i sistemi possono essere analizzati per test post-stimolazione e imaging. L'elevata capacità di elaborazione del dispositivo microfluidico consente inoltre di lisare i sistemi e di utilizzarli in saggi biologici basati su omiche che richiedono un gran numero di campioni, come mostrato nella figura con un esempio di immagine di elettroforesi differenziale su gel 2-dimensionale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Processo di fabbricazione dello stampo per wafer di silicio con scavi fotoresistenti spessi e ad alto rapporto di aspetto. (A,B) Il processo di fabbricazione complessivo è iniziato con la preparazione del wafer di silicio per il rivestimento fotoresistente. (C-G) Uno spesso rivestimento fotoresistente è stato applicato uniformemente al wafer di silicio. (H,I) Il fotoresist è stato modellato con esposizione UV attraverso la maschera fotografica. (J-L) Il fotoresist non polimerizzato è stato rimosso dal wafer di silicio. (M-P) La parte PDMS è stata fabbricata attraverso la litografia morbida. (Q,R) Il dispositivo è stato sigillato sul vetrino. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Il funzionamento del dispositivo microfluidico . (A) In primo luogo, gli embrioni sono stati pipettati nell'ingresso principale dell'embrione. (B) In secondo luogo, è stata applicata una pressione negativa all'ingresso del gas e il dispositivo microfluidico è stato inclinato verso il basso per consentire agli embrioni di allinearsi e caricarli nei microcanali. (C) In terzo luogo, è stata rimossa la pressione negativa per immobilizzare gli embrioni. (D) In quarto luogo, è stata applicata una pressione positiva ai canali del gas per comprimere gli embrioni. (E) Infine, gli embrioni sono stati raccolti dal dispositivo microfluidico tornando alla pressione negativa e inclinando il dispositivo microfluidico verso l'alto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Misurazione sperimentale del livello di compressione embrionale . (A) Embrioni rappresentativi all'interno del dispositivo microfluidico sotto diversi livelli di pressione del gas. Mentre gli embrioni non subiscono una compressione significativa sotto vuoto o in stati di pressione neurale, vengono compressi quando viene applicata una pressione positiva. (B) La quantità di sforzo di compressione uniassiale applicata agli embrioni a diversi livelli di pressione del gas (le barre di errore rappresentano la deviazione standard). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Compressione di organoidi cerebrali in un dispositivo microfluidico progettato e fabbricato seguendo la stessa strategia. (A) La compressione degli organoidi cerebrali a livelli crescenti all'aumentare della pressione del gas. (B) La larghezza degli organoidi cerebrali all'interno dei microcanali a diversi livelli di pressione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1: Vista dall'alto della fotomaschera utilizzata nella fabbricazione fotolitografica dello stampo per wafer di silicio. Ci sono cinque geometrie identiche del dispositivo microfluidico situate all'interno dell'area di 4 di diametro. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Vista dall'alto del dispositivo microfluidico utilizzato in questo studio con le relative dimensioni. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
L'articolo descrive lo sviluppo di un dispositivo microfluidico per allineare automaticamente, immobilizzare e applicare con precisione la stimolazione meccanica a centinaia di embrioni interi di Drosophila . L'integrazione del sistema microfluidico con un sottile vetrino di copertura ha permesso l'imaging degli embrioni con microscopia confocale ad alta risoluzione durante la stimolazione. Il dispositivo microfluidico ha anche permesso la raccolta degli embrioni subito dopo la stimolazione per l'esecuzione di saggi biologici a valle. Le considerazioni di progettazione, il metodo di fabbricazione e la caratterizzazione di questo dispositivo sono stati descritti in dettaglio. Il protocollo di fabbricazione dello stampo per wafer di silicio ha consentito il rivestimento spesso uniforme del fotoresist con trincee ad alto rapporto di aspetto.
Affinché questo approccio di fabbricazione abbia successo, è importante abbassare la temperatura delle fasi di cottura e ridurre al minimo le velocità di riscaldamento e raffreddamento del wafer di silicio dopo che è stato rivestito con fotoresist. Se ciò non viene eseguito correttamente, il rivestimento fotoresistente può facilmente delaminare e alterare la geometria dello stampo. Una volta che lo stampo per wafer di silicio è stato fabbricato con successo, può essere copiato in materiali più durevoli per evitare di danneggiare lo stampo originale durante le fasi consecutive di stampaggio della replica PDMS, che contengono anche cicli di riscaldamento e raffreddamento21. La fabbricazione del dispositivo microfluidico PDMS attraverso lo stampaggio di replica si basa sul successo del peeling delle strutture laterali ad alto rapporto di aspetto dallo stampo. Affinché questa fase di fabbricazione sia affidabile, è fondamentale rivestire correttamente la superficie del wafer di silicio con un agente silanizzante per facilitare il peeling. Il rivestimento deve anche essere rinnovato dopo aver fabbricato circa 20 dispositivi PDMS per compensare la rimozione parziale dello strato di silano durante ogni fase di peeling. In caso contrario, i fianchi possono rimanere bloccati all'interno del modello fotoresist, rendendo lo stampo inutilizzabile. Poiché il livello di compressione applicato ai campioni è una funzione delle proprietà meccaniche delle pareti laterali, è importante mantenere coerenti i parametri del processo di stampaggio replica PDMS. Il rapporto dell'agente polimerizzante, la temperatura e la durata devono essere attentamente monitorati durante la fabbricazione. Inoltre, poiché questa strategia del dispositivo prevede l'applicazione simultanea della stimolazione meccanica a un gran numero di organismi multicellulari, la loro aggregazione all'interno dei microcanali può portare all'intasamento. Sebbene questo problema non sia stato riscontrato con gli organismi utilizzati nel presente documento, se ciò si verifica, ci sono potenziali soluzioni dalla letteratura per superare questo problema, come l'uso di soluzioni di supporto durante l'introduzione dei campioni22.
Sebbene gli embrioni di Drosophila siano stati utilizzati come un intero organismo multicellulare in questo lavoro, la strategia di progettazione e fabbricazione qui presentata può essere applicata alla stimolazione meccanica di altri sistemi multicellulari modificando di conseguenza le dimensioni del dispositivo (Figura 2). Ciò può essere ottenuto espandendo la larghezza e l'altezza del microcanale centrale in modo che corrispondano a quelle dei sistemi multicellulari. Attraverso questo approccio, i campioni possono entrare nei microcanali ed essere compressi in modo simile deviando i fianchi deformabili con pressione pneumatica positiva. Per dimostrare questo approccio, dispositivi simili sono stati fabbricati per le camere delle uova di Drosophila , così come gli organoidi cerebrali. Questi sistemi hanno permesso la compressione meccanica precisa di questi sistemi biologici simili agli esperimenti sugli embrioni di Drosophila (Figura 6). Inoltre, poiché questo approccio consente il rifornimento dei mezzi attorno ai campioni immobilizzati, può essere molto utile per esperimenti di stimolazione chimica che richiedono un rapido scambio di supporti senza disturbare i campioni. Nel complesso, questo approccio versatile combina la precisione e le capacità di automazione ad alta produttività dei sistemi microfluidici, consentendo al contempo nuovi studi di meccanobiologia su vari sistemi multicellulari come piccoli campioni di tessuto, organoidi, embrioni e ovociti.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari nei prodotti descritti in questo manoscritto e non hanno nient'altro da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla National Science Foundation (CMMI-1946456), dall'Air Force Office of Scientific Research (FA9550-18-1-0262) e dal National Institute of Health (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
References
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