Summary
El presente protocolo describe el diseño, fabricación y caracterización de un sistema microfluídico capaz de alinear, inmovilizar y comprimir con precisión cientos de embriones de Drosophila melanogaster con una intervención mínima del usuario. Este sistema permite obtener imágenes de alta resolución y recuperar muestras para el análisis posterior a la estimulación y se puede escalar para adaptarse a otros sistemas biológicos multicelulares.
Abstract
Durante la embriogénesis, el movimiento celular coordinado genera fuerzas mecánicas que regulan la expresión y la actividad génica. Para estudiar este proceso, se han utilizado herramientas como la aspiración o la compresión de cubreobjetos para estimular mecánicamente embriones enteros. Estos enfoques limitan el diseño experimental, ya que son imprecisos, requieren manipulación manual y pueden procesar solo un par de embriones simultáneamente. Los sistemas microfluídicos tienen un gran potencial para automatizar tales tareas experimentales al tiempo que aumentan el rendimiento y la precisión. Este artículo describe un sistema microfluídico desarrollado para comprimir con precisión embriones enteros de Drosophila melanogaster (mosca de la fruta). Este sistema cuenta con microcanales con paredes laterales deformables accionadas neumáticamente y permite la alineación del embrión, la inmovilización, la compresión y la recolección posterior a la estimulación. Al paralelizar estos microcanales en siete carriles, se pueden aplicar patrones de compresión constantes o dinámicos a cientos de embriones de Drosophila simultáneamente. La fabricación de este sistema en un cubreobjetos de vidrio facilita la estimulación mecánica simultánea y la obtención de imágenes de muestras con microscopios de alta resolución. Además, la utilización de materiales biocompatibles, como PDMS, y la capacidad de fluir fluido a través del sistema hacen que este dispositivo sea capaz de experimentos a largo plazo con muestras dependientes de medios. Este enfoque también elimina el requisito de montaje manual que estresa mecánicamente las muestras. Además, la capacidad de recoger rápidamente muestras de los microcanales permite análisis posteriores a la estimulación, incluidos los ensayos -ómicos que requieren grandes números de muestra inalcanzables utilizando los enfoques tradicionales de estimulación mecánica. La geometría de este sistema es fácilmente escalable a diferentes sistemas biológicos, lo que permite que numerosos campos se beneficien de las características funcionales descritas en este documento, incluido el alto rendimiento de la muestra, la estimulación mecánica o la inmovilización y la alineación automatizada.
Introduction
Los sistemas vivos experimentan y responden constantemente a diversas entradas mecánicas a lo largo de su vida útil1. La mecanotransducción se ha relacionado con muchas enfermedades, incluyendo trastornos del desarrollo, pérdida muscular y ósea, y neuropatologías a través de vías de señalización directa o indirectamente afectadas por el ambiente mecánico2. Sin embargo, los genes y proteínas que están regulados por la estimulación mecánica3 en las vías de señalización mecanosensibles4 permanecen en gran parte desconocidos5, impidiendo la elucidación de los mecanismos de regulación mecánica y la identificación de dianas moleculares para enfermedades asociadas a la mecanotransducción patológica 6,7 . Un factor limitante en la proyección de estudios mecanobiológicos sobre los procesos fisiológicos relacionados es el uso de células individuales con placas de cultivo convencionales en lugar de organismos multicelulares intactos. Organismos modelo, como Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), han contribuido en gran medida a la comprensión de los genes, las vías de señalización y las proteínas involucradas en el desarrollo animal 8,9,10. Sin embargo, el uso de Drosophila y otros organismos modelo multicelulares en la investigación mecanobiológica se ha visto obstaculizado por desafíos con herramientas experimentales. Las técnicas convencionales para preparar, clasificar, obtener imágenes o aplicar diversos estímulos requieren principalmente manipulación manual; Estos enfoques consumen mucho tiempo, requieren experiencia, introducen variabilidad y limitan el diseño experimental y el tamaño de la muestra11. Los recientes avances microtecnológicos son un gran recurso para permitir nuevos ensayos biológicos con un rendimiento muy alto y parámetros experimentales altamente controlados12,13,14.
Este artículo describe el desarrollo de un dispositivo microfluídico mejorado para alinear, inmovilizar y aplicar con precisión estimulación mecánica en forma de compresión uniaxial a cientos de embriones enteros de Drosophila 15 (Figura 1). La integración del sistema microfluídico con un cubreobjetos de vidrio permitió obtener imágenes confocales de alta resolución de las muestras durante la estimulación. El dispositivo microfluídico también permitió la recolección rápida de los embriones después de la estimulación para ejecutar ensayos -ómicos (Figura 2). Las explicaciones de las consideraciones de diseño de este dispositivo, así como la fabricación utilizando litografía blanda y caracterización experimental, se describen aquí. Dado que la fabricación de un molde de oblea de silicio de un dispositivo de este tipo requiere un recubrimiento uniforme de fotorresistencia gruesa (espesor >200 μm) en grandes áreas con zanjas de alta relación de aspecto (AR) (AR >5), este método modificó considerablemente el protocolo tradicional de fabricación de moldes fotolitográficos. De esta manera, este método facilitó el manejo, adhesión, recubrimiento, modelado y desarrollo de la fotorresistencia. Además, se discuten los peligros potenciales y sus soluciones. Por último, la versatilidad de esta estrategia de diseño y fabricación se demostró utilizando otros sistemas multicelulares como las cámaras de huevos de Drosophila y los organoides cerebrales16.
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Protocol
1. Preparación del molde de oblea de silicio
- Limpie la oblea de silicio (consulte la Tabla de materiales) primero con acetona y luego con alcohol isopropílico (IPA).
- Coloque la oblea de silicio en una placa caliente a 250 °C durante 30 minutos para la deshidratación (Figura 3A).
- Cubra la oblea de silicio con hexametildisilazano (HDMS) en un horno de vapor principal (consulte la Tabla de materiales) (temperatura de proceso: 150 °C, presión de proceso: 2 Torr, tiempo de proceso: 5 min, volumen de HDMS: 5 μL) (Figura 3B).
- Coloque una botella de fotorresistencia SU-8 2100 (consulte la tabla de materiales) en un horno a 60 °C durante 15 minutos para reducir su viscosidad.
NOTA: Al calentar en el horno, la viscosidad de la fotorresistencia disminuye. Los fotorresistentes con viscosidad reducida se pueden manejar más fácilmente y se pueden verter con mayor precisión sobre la oblea. - Coloque la oblea de silicio en una placa caliente a 60 °C y vierta 1 ml de fotorresistencia calentada por cada pulgada de la oblea hasta que la fotorresistencia cubra la mayor parte de la superficie (Figura 3C).
- Transfiera la oblea de silicio recubierta de fotorresistencia a una recubridora de centrifugado (consulte la Tabla de materiales).
- Aplicar el precentrifugado primero a 250 rpm durante 30 s y luego a 350 rpm durante otros 30 s, ambos con una aceleración de 100 rpm/s (Figura 3D).
- Retire el exceso de fotorresistencia de los bordes de la oblea de silicio con un hisopo de sala limpia.
- Aplique un giro primero a 500 rpm durante 15 s con una aceleración de 100 rpm/s y luego a 1450 rpm durante 30 s con una aceleración de 300 rpm/s (Figura 3E).
- Retire la cuenta del borde con un hisopo de sala limpia.
- Coloque la oblea de silicio en una placa caliente a 50 °C y rocíe acetona sobre la oblea para eliminar las imperfecciones y promover un recubrimiento uniforme (Figura 3F).
- Aumente lentamente la temperatura de la placa caliente a 95 °C a razón de 2 °C/min.
- Hornear suavemente la oblea de silicio a 95 °C durante 50 min (Figura 3G).
- Enfríe lentamente la placa caliente a temperatura ambiente a una velocidad de 2 ° C / min.
- Coloque la oblea de silicio en un alineador de máscara (consulte la Tabla de materiales) y coloque la fotomáscara encima de ella (consulte la Figura complementaria 1 para la geometría de la fotomáscara).
- Exponga la oblea de silicio a 350 mJ/cm2 de luz UV (35 mW/cm2 durante 10 s) a través de la fotomáscara utilizando el alineador de máscara de contacto (Figura 3H).
- Aplique horneados consecutivos posteriores a la exposición en la oblea de silicio colocando la oblea en una placa caliente a 50 °C durante 5 min, a 65 °C durante 5 min adicionales y, finalmente, a 80 °C durante otros 20 min (Figura 3I).
- Enfriar lentamente la oblea de silicio a temperatura ambiente a una velocidad de 2 °C/min.
- Coloque un agitador magnético con un diámetro ligeramente más pequeño que la oblea de silicio en un vaso de precipitados. Gire la oblea de silicio al revés y colóquela encima del vaso de precipitados.
- Coloque el vaso de precipitados dentro de otro vaso de precipitados más grande y llene el vaso de precipitados más grande con una nueva solución de revelador (consulte la Tabla de materiales). Deje la oblea de silicio sumergida en el revelador durante 30 minutos con el agitador encendido (Figura 3J).
- Transfiera la oblea de silicio a un sonicador de baño ultrasónico lleno con el revelador fresco durante 1 h a 40 kHz (Figura 3K).
- Lave bien la oblea de silicio con una solución IPA para obtener el molde final de oblea de silicio (Figura 3L).
2. Fabricación del chip microfluídico
- Coloque el molde de oblea de silicio en un desecador junto con 10 gotas (~500 μL) de tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano (PFOCTS, consulte la Tabla de materiales) en un pequeño bote de pesaje cercano.
- Conecte el desecador a una bomba de vacío a aproximadamente 200 Torr durante 30 min.
- Apague la válvula desecador y desconecte la bomba de vacío durante la noche para el recubrimiento PFOCTS.
- Prepare la solución de polidimetilsiloxano precurado (PDMS) mezclando la base de PDMS con el agente de curado (consulte la Tabla de materiales) en una proporción de 10:1.
- Desgasifique la mezcla colocándola en una centrífuga (500 x g durante 5 min a temperatura ambiente).
NOTA: Esta centrifugación permite que las burbujas migren a la superficie superior y, en consecuencia, se eliminen en un corto período de tiempo. - Vierta la solución PDMS desgasificada en el molde de oblea de silicio.
- Desgasifique de nuevo para eliminar las burbujas de aire atrapadas en la superficie del molde.
- Curar el PDMS en un horno a 60 °C durante 1 h y 50 min (Figura 3M).
- Utilice un bisturí para cortar los bordes de la región de PDMS curada correspondiente a la geometría del chip microfluídico (Figura 3N).
- Despegue la pieza PDMS y colóquela boca abajo sobre una estera de corte.
- Utilice una navaja de afeitar para cortar la pieza PDMS en su forma final (Figura 3O).
- Perfore los orificios de entrada y salida del PDMS con un punzón de biopsia (consulte la Tabla de materiales) o una aguja con una punta roma (Figura 3P).
- Para el orificio de entrada del embrión, use un punzón de 4 mm de diámetro.
- Para los orificios de salida del embrión, utilice un punzón de 1,3 mm de diámetro.
- Para el orificio de entrada de gas, utilice un punzón de 2 mm.
- Use un trozo de cinta adhesiva para eliminar cualquier partícula que pueda quedar en la superficie estampada del PDMS.
- Limpie un portaobjetos de vidrio rectangular de 24 mm x 60 mm primero con acetona y luego con IPA.
- Seque la superficie de vidrio con una pistola de aire conectada a una fuente de aire filtrado.
- Aplique un horno de deshidratación al portaobjetos de vidrio colocándolo en una placa caliente a 250 °C durante 2 h (Figura 3Q).
- Cubra el portaobjetos de vidrio con un vaso de precipitados para evitar la contaminación de la superficie.
- Coloque el PDMS, con su lado estampado hacia arriba, y el vidrio deshidratado se desliza en un limpiador de plasma (consulte la Tabla de materiales).
- Tratar el PDMS y el portaobjetos de vidrio con plasma de oxígeno a 18 W durante 30 s.
- Coloque el PDMS en el portaobjetos de vidrio con su superficie estampada mirando hacia el portaobjetos de vidrio para sellar los microcanales mediante unión covalente (Figura 3R).
- Utilice pinzas para empujar suavemente la pieza PDMS contra el portaobjetos de vidrio para garantizar un contacto conformacional completo.
- Almacene el chip microfluídico completo a temperatura ambiente durante la noche para permitir que la unión alcance su fuerza final.
3. Preparación de los embriones de mosca de la fruta
- Permita que las moscas adultas de Oregon-R pongan huevos en placas de agar jugo de manzana (1.5% de agar, 25% de jugo de manzana, 2.5% de sacarosa) y recoja las placas en el momento de desarrollo deseado después de la puesta de huevos para el experimento dado.
NOTA: Para los presentes experimentos, las placas se recolectaron a los 140 min para preparar y clasificar embriones en la etapa de celularización17. - Inundar el agar con el lavado de huevos de embrión (0.12 M NaCl, 0.04% Triton-X 100) y agitar suavemente los embriones con un pincel para desalojarlos del agar.
- Transfiera los embriones a una solución de lejía al 50% durante 90 s, revolviendo ocasionalmente. Cuele los embriones a través de un tamiz de tejido y lave bien la solución de lejía con agua.
- Transfiera los embriones a una placa de Petri de vidrio de 90 mm con suficiente lavado de huevos de embriones para cubrir completamente los embriones.
- Examine los embriones con transiluminación en un microscopio de disección y seleccione embriones de la etapa de desarrollo deseada para cargarlos en el dispositivo microfluídico.
NOTA: En esta aplicación, se seleccionaron embriones en la etapa de celularización. Las descripciones detalladas de cómo garantizar la selección adecuada de la etapa de desarrollo se pueden encontrar en el manual de laboratorio para Drosophila17.
4. Aplicación de estimulación mecánica a embriones de mosca de la fruta utilizando el chip microfluídico
- Prepare los siete microcanales embrionarios llenándolos con IPA filtrada de 0,4 μm a través del puerto de entrada principal del embrión.
- Reemplace el IPA con agua desionizada filtrada (DI) de 0,4 μm.
- Reemplace el agua DI con una solución de lavado de huevos embrionarios.
- Recolectar aproximadamente 100 embriones preseleccionados de la placa de Petri de vidrio usando una pipeta de vidrio.
- Pipetear los embriones en el puerto de entrada del embrión (Figura 4A).
- Aplique una presión negativa de aproximadamente 3 PSI (es decir, vacío) a la entrada de gas utilizando una bomba de vacío portátil para abrir los microcanales del embrión.
- Incline el chip microfluídico hacia abajo para que los embriones se alineen automáticamente y se asienten en los microcanales embrionarios (Figura 4B).
- Si las entradas del microcanal embrionario se obstruyen por múltiples embriones que entran simultáneamente, incline el chip microfluídico hacia arriba y luego hacia abajo nuevamente para despejar la obstrucción.
- Según el rendimiento requerido, introduzca hasta 300 embriones en los microcanales embrionarios.
- Una vez completada la carga embrionaria, retire el vacío para inmovilizar los embriones.
- Incline el chip microfluídico de nuevo a la posición horizontal (Figura 4C).
- Conecte una fuente de presión positiva portátil (consulte la Tabla de materiales) con un manómetro a la entrada de gas para aplicar una compresión de 3 PSI (Figura 4D).
- Revise continuamente el manómetro para asegurarse de que se aplica un nivel de compresión constante.
- Si se van a realizar experimentos de imágenes en vivo en los embriones estimulados mecánicamente, coloque el chip microfluídico en un portaobjetos de vidrio de etapa de microscopio estándar con la entrada de gas conectada a la fuente de presión.
- Una vez que se completa el experimento de compresión, los embriones se pueden recolectar para el análisis posterior. Para hacer esto, primero, aplique el vacío a la entrada de gas para liberar los embriones.
- Luego, incline el chip microfluídico hacia arriba para que los embriones se muevan hacia el puerto de introducción de embriones (Figura 4E).
- Recoger los embriones del chip microfluídico utilizando una pipeta de vidrio.
NOTA: Tras la recolección, los efectos de la compresión en el desarrollo embrionario y la viabilidad pueden investigarse mediante el crecimiento de las moscas de la fruta hasta la edad adulta. La capacidad de procesamiento de alto rendimiento del dispositivo microfluídico también permite que los embriones se utilicen en ensayos basados en ómicas posteriores que requieren un gran número de muestras (Figura 2).
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Representative Results
El sistema microfluídico se divide en dos subcompartimentos separados por paredes laterales PDMS deformables. El primer compartimento es el sistema líquido donde se introducen los embriones de Drosophila , se alinean, alinean y comprimen automáticamente. El segundo compartimento es un sistema de gas donde la presión del gas a ambos lados de los canales de compresión se controla a través de microcanales sin salida para controlar con precisión el ancho efectivo de los canales de compresión. El dispositivo microfluídico está sellado con un portaobjetos de vidrio en la parte inferior, lo que permite obtener imágenes en vivo de alta resolución de las muestras (Figura complementaria 2) para las dimensiones relevantes del dispositivo microfluídico.
Los organismos multicelulares como los embriones de Drosophila se seleccionan en la etapa de desarrollo embrionario deseada. En el caso de los embriones de Drosophila , todas las etapas de desarrollo son igualmente compatibles con este enfoque, ya que el tamaño del embrión no cambia hasta que eclosionan. Las muestras seleccionadas se introducen en el dispositivo microfluídico a través de la entrada grande (es decir, 4 mm de diámetro) utilizando una micropipeta de vidrio. Luego, el dispositivo se inclina hacia abajo para permitir que los embriones fluyan hacia los siete canales de compresión organizados de manera paralela. La aurícula de estrechamiento que conecta la entrada del embrión con el canal de compresión garantiza la alineación automática de los embriones antes de que lleguen a la entrada de los canales de compresión. El vacío aplicado a la entrada de gas desvía las paredes laterales deformables hacia afuera, aumentando el ancho efectivo del microcanal y permitiendo que los embriones entren en los canales de compresión secuencialmente. Los siete canales de compresión tienen una longitud de 22 mm y, en paralelo, pueden acomodar hasta 300 embriones de Drosophila en una sola ejecución. Los canales de compresión terminan en un cuello de botella donde el ancho del microcanal disminuye a un nivel mucho más pequeño que el de las muestras, lo que permite que el fluido fluya mientras retiene los embriones. A través de este enfoque, los embriones se concentran dentro de los canales de compresión. Después de la introducción de los embriones, se elimina el vacío en la entrada de gas, y las paredes laterales del microcanal vuelven a su posición original e inmovilizan los embriones alineados desde ambos lados. La compresión se puede lograr aplicando presión positiva a la entrada de gas, lo que desvía las paredes laterales deformables hacia adentro y reduce el ancho efectivo del microcanal. La cantidad de compresión aplicada a los embriones se puede regular con precisión adaptando las dimensiones del microcanal, el grosor de las paredes laterales deformables, el módulo de Young del PDMS y la presión aplicada. Después del experimento de compresión, los embriones se pueden recolectar para el análisis posterior aplicando un vacío a la entrada de gas e inclinando el dispositivo microfluídico en otra dirección.
Este dispositivo microfluídico fue fabricado utilizando litografía blanda18. Sin embargo, la fabricación de estructuras gruesas con características de alta relación de aspecto utilizando fotorresistencia ultragruesa requiere desviaciones importantes de los protocolos definidos para la fabricación estándar (Figura 3). Junto con el recubrimiento de hexametildisilazano (HDMS), las obleas de silicio se limpiaron antes del recubrimiento de centrifugado para eliminar los residuos orgánicos y se hornearon para eliminar la humedad de la superficie. Estos pasos adicionales mejoraron la unión de la gruesa capa fotorresistente a la oblea de silicio. El fotoprotector también se calentó antes de verter para disminuir la viscosidad, lo cual fue crucial para cubrir toda la superficie de la oblea. El espesor del recubrimiento fotorresistente objetivo se logró a través de tres pasos de hilado, donde cada paso de hilado eliminó gradualmente el exceso de fotorresistencia sin contaminar la superficie de la oblea. Inspirado en métodos publicados anteriormente19, se pulverizó acetona, que es uno de los disolventes de la fotorresistencia, sobre la oblea de silicio para eliminar las imperfecciones fotorresistentes y aumentar la uniformidad del recubrimiento. Durante los pasos consecutivos de cocción, la temperatura se cambió lentamente para minimizar el estrés térmico, lo que podría conducir a la delaminación de la fotorresistencia de la oblea de silicio. Debido a preocupaciones similares, la temperatura de cocción disminuyó al aumentar su duración. Uno de los pasos más desafiantes en la fabricación fotolitográfica de zanjas de alta relación de aspecto fue la eliminación de la fotorresistencia no curada después de la exposición a los rayos UV. Para maximizar la penetración de la solución de desarrollador en las zanjas, la oblea de silicio se puso boca abajo y se mezcló continuamente con la solución de desarrollo con un agitador. De esta manera, la nueva solución de desarrollador podría reaccionar y eliminar la fotorresistencia sin curar. Este paso fue seguido por un baño ultrasónico donde se eliminó la fotorresistencia restante. Una vez que el molde de oblea de silicio se generó con éxito, el proceso de moldeo de réplica estándar consistió en mezclar agentes de curado, desgasificar, verter, curar, pelar, perforar y unir plasma para la fabricación del dispositivo microfluídico final20.
La funcionalidad del dispositivo microfluídico se determinó experimentalmente cargando embriones de Drosophila en los canales de compresión y aplicando presión positiva a los canales de gas. Las mediciones del ancho decreciente de los embriones bajo un microscopio (Figura 5A) demuestran cómo se puede utilizar la presión del gas para obtener un nivel de compresión objetivo (Figura 5B). Las imágenes de lapso de tiempo de embriones alineados sometidos a compresión también demuestran la compatibilidad de este sistema con la microscopía confocal.
Figura 1: El diseño y la función del dispositivo microfluídico. El dispositivo microfluídico consta de siete microcanales de compresión paralelos que pueden probar hasta 300 embriones completos de Drosophila simultáneamente. (A) Los embriones se introdujeron en el dispositivo a través de la entrada principal del embrión, y se alinearon a lo largo del eje posterior-anterior automáticamente cuando entraron en los microcanales. (B) Los embriones se movían libremente cuando se aplicaba presión negativa a través de la entrada de gas, ya que esto desviaba las paredes laterales del microcanal deformable hacia afuera. Esto permitió su carga, así como la descarga como un solo carril. Cuando se eliminó la presión negativa, los embriones se inmovilizaron en los microcanales. Cuando se aplicó presión positiva, las paredes laterales del microcanal comprimieron los embriones desviándose hacia adentro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Flujo de proceso de experimentos de compresión microfluídica para estudios mecanobiológicos. (A) El dispositivo de mecanoestimulación microfluídica de alto rendimiento está hecho de PDMS y un portaobjetos de vidrio para procesar cientos de muestras biológicas multicelulares. (B) El dispositivo está diseñado para trabajar con diferentes sistemas multicelulares, como cámaras de huevos de Drosophila, embriones de Drosophila u organoides cerebrales. Este dispositivo puede aplicar patrones de compresión estables o dinámicos a los biosistemas. (C) Los sistemas pueden ser fotografiados con un microscopio confocal a lo largo del tiempo a medida que se comprimen. Se pueden analizar los niveles de expresión y la localización de proteínas marcadas con fluorescencia en respuesta a la compresión. Tras la recolección, los sistemas se pueden analizar para pruebas posteriores a la estimulación e imágenes. La capacidad de procesamiento de alto rendimiento del dispositivo microfluídico también permite que los sistemas se lisen y se utilicen en ensayos biológicos basados en ómicas que requieren un gran número de muestras, como se muestra en la figura con un ejemplo de imagen de electroforesis en gel diferencial de 2 dimensiones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Proceso de fabricación del molde de oblea de silicio con zanjas gruesas fotorresistentes y de alta relación de aspecto. (A, B) El proceso general de fabricación comenzó con la preparación de la oblea de silicio para el recubrimiento fotorresistente. (C-G) Se aplicó uniformemente un recubrimiento fotorresistente grueso a la oblea de silicio. (H,I) El fotoprotector fue modelado con la exposición UV a través de la fotomáscara. (J-L) Se eliminó la fotorresistencia sin curar de la oblea de silicio. (M-P) La parte PDMS fue fabricada a través de litografía blanda. (Q,R) El dispositivo estaba sellado a la diapositiva de vidrio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: El funcionamiento del dispositivo microfluídico . (A) Primero, los embriones fueron pipeteados en la entrada principal de embriones. (B) En segundo lugar, se aplicó presión negativa a la entrada de gas, y el dispositivo microfluídico se inclinó hacia abajo para permitir que los embriones se alinearan y se cargaran en los microcanales. (C) En tercer lugar, se eliminó la presión negativa para inmovilizar los embriones. (D) En cuarto lugar, se aplicó presión positiva a los canales de gas para comprimir los embriones. (E) Por último, los embriones se recogieron del dispositivo microfluídico volviendo a la presión negativa e inclinando el dispositivo microfluídico hacia arriba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Medición experimental del nivel de compresión embrionaria . (A) Embriones representativos dentro del dispositivo microfluídico bajo diferentes niveles de presión de gas. Si bien los embriones no experimentan una compresión significativa al vacío o en estados de presión neuronal, se comprimen cuando se aplica presión positiva. (B) La cantidad de tensión compresiva uniaxial aplicada a los embriones a diferentes niveles de presión de gas (las barras de error representan la desviación estándar). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Compresión de organoides cerebrales en un dispositivo microfluídico diseñado y fabricado siguiendo la misma estrategia . (A) La compresión de los organoides cerebrales a niveles crecientes a medida que aumenta la presión del gas. (B) El ancho de los organoides cerebrales dentro de los microcanales a diferentes niveles de presión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Vista superior de la fotomáscara utilizada en la fabricación fotolitográfica del molde de oblea de silicio. Hay cinco geometrías idénticas de dispositivos microfluídicos ubicadas dentro del área de 4 pulgadas. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: Vista superior del dispositivo microfluídico utilizado en este estudio con las dimensiones relevantes. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El artículo describe el desarrollo de un dispositivo microfluídico para alinear, inmovilizar y aplicar con precisión estimulación mecánica automáticamente a cientos de embriones completos de Drosophila . La integración del sistema microfluídico con un delgado cubreobjetos de vidrio permitió obtener imágenes de embriones con microscopía confocal de alta resolución durante la estimulación. El dispositivo microfluídico también permitió la recolección de los embriones justo después de la estimulación para ejecutar ensayos biológicos aguas abajo. Las consideraciones de diseño, el método de fabricación y la caracterización de este dispositivo se describieron en detalle. El protocolo de fabricación del molde de oblea de silicio permitió el recubrimiento grueso uniforme de la fotorresistencia con zanjas de alta relación de aspecto.
Para que este enfoque de fabricación tenga éxito, es importante bajar la temperatura de los pasos de cocción y minimizar las velocidades de calentamiento y enfriamiento de la oblea de silicio después de que esté recubierta con fotorresistencia. Si esto no se hace correctamente, el recubrimiento fotorresistente puede deslaminar y alterar fácilmente la geometría del molde. Una vez que el molde de oblea de silicio se fabrica con éxito, se puede copiar en materiales más duraderos para evitar dañar el molde original durante los pasos consecutivos de moldeo de réplica PDMS, que también contienen ciclos de calentamiento y enfriamiento21. La fabricación del dispositivo microfluídico PDMS a través del moldeo de réplica se basa en el pelado exitoso de estructuras laterales de alta relación de aspecto del molde. Para que este paso de fabricación sea confiable, es fundamental recubrir adecuadamente la superficie de la oblea de silicio con un agente silanizante para facilitar el peeling. El recubrimiento también debe renovarse después de fabricar aproximadamente 20 dispositivos PDMS para compensar la eliminación parcial de la capa de silano durante cada paso de pelado. De lo contrario, las paredes laterales pueden atascarse dentro del patrón de fotoresistencia, haciendo que el molde sea inutilizable. Dado que el nivel de compresión aplicado a las muestras es una función de las propiedades mecánicas de las paredes laterales, es importante mantener consistentes los parámetros del proceso de moldeo de réplica PDMS. La relación del agente de curado, la temperatura y la duración deben controlarse de cerca durante la fabricación. Además, dado que esta estrategia de dispositivo es para aplicar estimulación mecánica simultáneamente a un gran número de organismos multicelulares, su agregación dentro de los microcanales puede conducir a la obstrucción. Aunque este problema no fue experimentado con los organismos utilizados en este documento, si esto ocurre, existen soluciones potenciales de la literatura para superar este problema, como el uso de soluciones portadoras durante la introducción de las muestras22.
Aunque los embriones de Drosophila se utilizaron como un organismo multicelular completo en este trabajo, la estrategia de diseño y fabricación presentada aquí se puede aplicar a la estimulación mecánica de otros sistemas multicelulares alterando las dimensiones del dispositivo en consecuencia (Figura 2). Esto se puede lograr expandiendo el ancho y la altura del microcanal central para que coincida con los de los sistemas multicelulares. A través de este enfoque, las muestras pueden ingresar a los microcanales y comprimirse de manera similar al desviar las paredes laterales deformables con presión neumática positiva. Para demostrar este enfoque, se fabricaron dispositivos similares para las cámaras de huevos de Drosophila , así como para organoides cerebrales. Estos sistemas permitieron la compresión mecánica precisa de estos sistemas biológicos similar a los experimentos con embriones de Drosophila (Figura 6). Además, dado que este enfoque permite la reposición de los medios alrededor de las muestras inmovilizadas, puede ser muy útil para experimentos de estimulación química que requieren un intercambio rápido de medios sin perturbar las muestras. En general, este enfoque versátil combina la precisión y las capacidades de automatización de alto rendimiento de los sistemas microfluídicos al tiempo que permite nuevos estudios mecanobiológicos en varios sistemas multicelulares, como pequeñas muestras de tejido, organoides, embriones y ovocitos.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros en los productos descritos en este manuscrito y no tienen nada más que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias (CMMI-1946456), la Oficina de Investigación Científica de la Fuerza Aérea (FA9550-18-1-0262) y el Instituto Nacional de Salud (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
References
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