Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר תכנון, ייצור ואפיון של מערכת מיקרופלואידית המסוגלת ליישר, לשתק ולדחוס במדויק מאות עוברי Drosophila melanogaster עם התערבות מינימלית של המשתמש. מערכת זו מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה ושחזור של דגימות לניתוח לאחר גירוי וניתן לשנות את קנה המידה שלה כך שיתאים למערכות ביולוגיות רב-תאיות אחרות.
Abstract
במהלך העובר, תנועת תאים מתואמת יוצרת כוחות מכניים המווסתים את ביטוי הגנים ופעילותם. כדי ללמוד את התהליך הזה, כלים כגון שאיפה או דחיסת כיסוי שימשו כדי לעורר באופן מכני עוברים שלמים. גישות אלה מגבילות את התכנון הניסויי מכיוון שהן אינן מדויקות, דורשות טיפול ידני ויכולות לעבד רק כמה עוברים בו זמנית. למערכות מיקרופלואידיות יש פוטנציאל גדול לאוטומציה של משימות ניסיוניות כאלה תוך הגדלת התפוקה והדיוק. מאמר זה מתאר מערכת מיקרופלואידית שפותחה כדי לדחוס במדויק עוברים שלמים של Drosophila melanogaster (זבוב הפירות). מערכת זו כוללת מיקרו-ערוצים עם דפנות מעוותות המופעלות באופן פניאומטי ומאפשרת יישור עוברים, אימוביליזציה, דחיסה ואיסוף לאחר גירוי. על ידי הקבלה של מיקרו-ערוצים אלה לשבעה נתיבים, ניתן ליישם דפוסי דחיסה יציבים או דינמיים על מאות עוברי דרוזופילה בו זמנית. ייצור מערכת זו על מכסה זכוכית מאפשר גירוי מכני בו זמנית והדמיה של דגימות עם מיקרוסקופים ברזולוציה גבוהה. יתר על כן, השימוש בחומרים תואמים ביולוגית, כמו PDMS, והיכולת להזרים נוזל דרך המערכת הופכים את המכשיר הזה לבעל יכולת ניסויים ארוכי טווח עם דגימות תלויות מדיה. גישה זו גם מבטלת את הדרישה להרכבה ידנית אשר מדגישה באופן מכני דגימות. יתר על כן, היכולת לאסוף במהירות דגימות מהמיקרו-ערוצים מאפשרת ניתוחים לאחר גירוי, כולל מבחני -omics הדורשים מספרי דגימות גדולים שאינם ניתנים להשגה באמצעות גישות גירוי מכניות מסורתיות. הגיאומטריה של מערכת זו ניתנת להרחבה בקלות למערכות ביולוגיות שונות, ומאפשרת לשדות רבים ליהנות מהתכונות הפונקציונליות המתוארות כאן, כולל תפוקת דגימה גבוהה, גירוי מכני או אימוביליזציה, ויישור אוטומטי.
Introduction
מערכות חיות חוות ומגיבות ללא הרף לתשומות מכניות שונות במהלך חייהן1. Mechanotransduction נקשר למחלות רבות, כולל הפרעות התפתחותיות, אובדן שרירים ועצמות, ונוירופתולוגיות באמצעות מסלולי איתות המושפעים ישירות או בעקיפין מהסביבה המכנית2. עם זאת, הגנים והחלבונים המווסתים על ידי גירוי מכני3 במסלולי האיתות המכנו-סנסיטיביים4 נותרים ברובם לא ידועים5, ומונעים את הבהרת מנגנוני הוויסות המכני וזיהוי מטרות מולקולריות למחלות הקשורות למכניוטרנסדוקציה פתולוגית 6,7 . אחד הגורמים המגבילים בהקרנת מחקרים מכניוביולוגיים על התהליכים הפיזיולוגיים הקשורים לכך הוא שימוש בתאים בודדים עם כלי תרבית קונבנציונליים במקום באורגניזמים רב-תאיים שלמים. אורגניזמים לדוגמה, כגון Drosophila melanogaster (זבוב הפירות), תרמו רבות להבנת הגנים, מסלולי האיתות והחלבונים המעורבים בהתפתחות בעלי חיים 8,9,10. אף על פי כן, השימוש בדרוזופילה ובאורגניזמי מודל רב-תאיים אחרים במחקר המכנוביולוגי הופרע על ידי אתגרים בכלים ניסיוניים. טכניקות קונבנציונליות להכנה, מיון, הדמיה או יישום גירויים שונים דורשות בעיקר מניפולציה ידנית; גישות אלה גוזלות זמן רב, דורשות מומחיות, מציגות שונות ומגבילות את תכנון הניסוי ואת גודל המדגם11. ההתקדמות המיקרוטכנולוגית האחרונה היא משאב נהדר המאפשר בדיקות ביולוגיות חדשניות עם תפוקה גבוהה מאוד ופרמטרים ניסיוניים מבוקרים מאוד12,13,14.
מאמר זה מתאר את הפיתוח של מכשיר מיקרופלואידי משופר ליישור, שיתוק ויישום מדויק של גירוי מכני בצורה של דחיסה חד-אקסיאלית למאות עוברי דרוזופילה שלמים 15 (איור 1). אינטגרציה של המערכת המיקרופלואידית עם כיסוי זכוכית אפשרה הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה של הדגימות במהלך הגירוי. המכשיר המיקרופלואידי גם איפשר איסוף מהיר של העוברים לאחר הגירוי לבדיקות ריצה -omics (איור 2). הסברים על שיקולי העיצוב של מכשיר זה, כמו גם הייצור באמצעות ליתוגרפיה רכה ואפיון ניסיוני, מתוארים כאן. מכיוון שיצירת תבנית פרוסות סיליקון של מכשיר כזה דורשת ציפוי אחיד של פוטורססיסט עבה (עובי >200 מיקרומטר) על פני שטחים גדולים עם תעלות יחס גובה-רוחב גבוה (AR >5), שיטה זו שינתה במידה ניכרת את פרוטוקול ייצור התבנית הפוטוליתוגרפית המסורתי. בדרך זו, שיטה זו הקלה על הטיפול, ההדבקה, הציפוי, הדפוס והפיתוח של הפוטורסיסט. בנוסף, נדונים מלכודות פוטנציאליות ופתרונותיהן. לבסוף, הרבגוניות של אסטרטגיית תכנון וייצור זו הודגמה באמצעות מערכות רב-תאיות אחרות כגון תאי ביצים דרוזופילה ואורגנואידים מוחיים16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תבנית פרוסות הסיליקון
- נקו את פרוסת הסיליקון (ראו טבלת חומרים) תחילה עם אצטון ולאחר מכן עם אלכוהול איזופרופיל (IPA).
- מניחים את פרוסת הסיליקון על פלטה חמה בטמפרטורה של 250 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לאפייה להתייבשות (איור 3A).
- מצפים את פרוסת הסיליקון בהקסמתיל-דיסילאזאן (HDMS) בתנור אדים ראשוני (ראו טבלת חומרים) (טמפרטורת תהליך: 150 מעלות צלזיוס, לחץ תהליך: 2 טור, זמן תהליך: 5 דקות, נפח HDMS: 5 μL) (איור 3B).
- הכניסו בקבוק פוטורסיסט SU-8 2100 (ראו טבלת חומרים) לתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להפחית את צמיגותו.
הערה: עם חימום בתנור, צמיגות הפוטורסיסט פוחתת. ניתן לטפל בפוטורסיסטים בעלי צמיגות נמוכה יותר בקלות רבה יותר וניתן לשפוך אותם בצורה מדויקת יותר על גבי הוופל. - הניחו את פרוסת הסיליקון על פלטה חמה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס ויוצקו 1 מ"ל מהפוטורסיסט המחומם עבור כל סנטימטר של הוופל עד שהפוטורססיסט יכסה את רוב פני השטח (איור 3C).
- העבירו את פרוסת הסיליקון המצופה בפוטורסיסטים לציפוי ספין (ראו טבלת חומרים).
- יש למרוח תחילה קדם-סיבוב ב-250 סל"ד במשך 30 שניות ולאחר מכן ב-350 סל"ד למשך 30 שניות נוספות, שתיהן עם האצה של 100 סל"ד לשנייה (איור 3D).
- הסר את עודפי הפוטורסיסט משולי פרוסת הסיליקון באמצעות ספוגית חדר נקי.
- החל תחילה סיבוב ב-500 סל"ד במשך 15 שניות עם תאוצה של 100 סל"ד לשנייה ולאחר מכן ב-1450 סל"ד במשך 30 שניות עם תאוצה של 300 סל"ד לשנייה (איור 3E).
- הסר את חרוז הקצה עם ספוגית חדר נקי.
- מניחים את פרוסת הסיליקון על פלטה חמה בטמפרטורה של 50°C ומרססים אצטון על הוופל כדי להסיר פגמים ולקדם ציפוי אחיד (איור 3F).
- העלו באיטיות את הטמפרטורה של הלוח החם ל-95 מעלות צלזיוס בקצב של 2 מעלות צלזיוס לדקה.
- אופים רכה את פרוסת הסיליקון בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס במשך 50 דקות (איור 3G).
- מקררים באיטיות את הצלחת החמה לטמפרטורת החדר בקצב של 2 מעלות צלזיוס לדקה.
- הניחו את פרוסת הסיליקון על מיישר מסיכה (ראו טבלת חומרים) והניחו את מסיכת הצילום מעליה (עיין באיור משלים 1 לגיאומטריה של מסיכת הצילום).
- חשוף את פרוסת הסיליקון לאור UVשל 350 mJ/cm 2 (35 mW/cm2 למשך 10 שניות) דרך מסיכת הצילום באמצעות מיישר מסכת המגע (איור 3H).
- מרחו אפייה רצופה לאחר חשיפה על פרוסת הסיליקון על ידי הנחת הוופל על צלחת חמה בטמפרטורה של 50°C למשך 5 דקות, ב-65°C למשך 5 דקות נוספות, ולבסוף ב-80°C למשך 20 דקות נוספות (איור 3I).
- מקררים באיטיות את פרוסת הסיליקון לטמפרטורת החדר בקצב של 2 מעלות צלזיוס לדקה.
- מניחים מערבל מגנטי בקוטר מעט קטן יותר מאשר פרוסת הסיליקון בכוס. הופכים את פרוסת הסיליקון במהופך ומניחים אותה על גבי הכוס.
- הניחו את הכוס בתוך גדולה יותר ומלאו את הכוס הגדולה יותר בפתרון מפתח חדש (ראו טבלת חומרים). השאירו את פרוסת הסיליקון שקועה במפתח למשך 30 דקות כאשר המערבל מופעל (איור 3J).
- העבירו את פרוסת הסיליקון לתוך סוניק אמבטיה על-קולי מלא במפתח הטרי למשך שעה אחת ב-40 קילוהרץ (איור 3K).
- שטפו היטב את פרוסת הסיליקון עם תמיסת IPA כדי לקבל את תבנית פרוסת הסיליקון הסופית (איור 3L).
2. ייצור השבב המיקרופלואידי
- הניחו את תבנית פרוסת הסיליקון במייבש יחד עם 10 טיפות (~500 μL) של Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS, ראו טבלת חומרים) בסירת שקילה קטנה בקרבת מקום.
- חברו את חומר הייבוש למשאבת ואקום בעוצמה של כ-200 טורים למשך 30 דקות.
- כבו את שסתום הייבוש ונתקו את משאבת הוואקום למשך הלילה לציפוי PFOCTS.
- הכן את תמיסת הפולידימתילסילוקסן (PDMS) שנרפאה מראש על-ידי ערבוב בסיס ה-PDMS עם חומר הריפוי (ראה טבלת חומרים) ביחס של 10:1.
- דגה את התערובת על ידי הצבתה בצנטריפוגה (500 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר).
הערה: צנטריפוגה זו מאפשרת לבועות לנדוד אל המשטח העליון וכתוצאה מכך להסיר אותן בפרק זמן קצר. - יוצקים את תמיסת ה-PDMS שהושחתה על תבנית פרוסות הסיליקון.
- דגה אותו שוב כדי להסיר את בועות האוויר הכלואות על משטח התבנית.
- רפאו את ה-PDMS בתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה ו-50 דקות (איור 3M).
- השתמשו באזמל כדי לחתוך את גבולות אזור ה-PDMS שנרפא, המתאים לגיאומטריה של השבב המיקרופלואידי (איור 3N).
- מקלפים את חלק ה-PDMS ומניחים אותו הפוך על משטח חיתוך.
- השתמשו בתער כדי לחתוך את חלק ה-PDMS לצורתו הסופית (איור 3O).
- נקבו את חורי הכניסה והיציאה ב-PDMS באמצעות ניקוב ביופסיה (ראו טבלת חומרים) או מחט עם קצה קהה (איור 3P).
- עבור חור הכניסה של העובר, השתמש ניקוב בקוטר 4 מ"מ.
- עבור חורי מוצא העובר, השתמש ניקוב בקוטר 1.3 מ"מ.
- עבור חור כניסת הגז, השתמש ניקוב 2 מ"מ.
- השתמש בפיסת סרט סקוטש כדי להסיר חלקיקים שעלולים להישאר על המשטח המעוצב של PDMS.
- נקה שקופית זכוכית מלבנית בגודל 24 מ"מ x 60 מ"מ תחילה עם אצטון ולאחר מכן עם IPA.
- יבשו את משטח הזכוכית באמצעות אקדח אוויר המחובר למקור אוויר מסונן.
- מרחו אפיית התייבשות על מגלשת הזכוכית על ידי הנחתה על פלטה חמה בטמפרטורה של 250 מעלות צלזיוס למשך שעתיים (איור 3Q).
- כסו את מגלשת הזכוכית בכוס למניעת זיהום פני השטח.
- הניחו את ה-PDMS, כשהצד המעוצב שלו כלפי מעלה, והזכוכית המיובשת מחליקה לתוך חומר ניקוי פלזמה (ראו טבלת חומרים).
- טפלו ב-PDMS ובמחליק הזכוכית עם פלזמת חמצן ב-18 וואט למשך 30 שניות.
- הניחו את ה-PDMS על מגלשת הזכוכית כאשר המשטח המעוצב שלה פונה לכיוון מגלשת הזכוכית כדי לאטום את המיקרו-ערוצים באמצעות הדבקה קוולנטית (איור 3R).
- השתמשו בפינצטה כדי לדחוף בעדינות את חלק ה-PDMS כנגד מגלשת הזכוכית כדי להבטיח מגע קונפורמי מלא.
- אחסנו את השבב המיקרופלואידי שהושלם בטמפרטורת החדר למשך הלילה כדי לאפשר לחיבור להגיע לחוזק הסופי שלו.
3. הכנת עוברי זבוב הפירות
- אפשרו לזבובים בוגרים של Oregon-R להטיל ביצים על צלחות אגר של מיץ תפוחים (1.5% אגר, 25% מיץ תפוחים, 2.5% סוכרוז) ולאסוף את הצלחות בזמן ההתפתחותי הרצוי לאחר הטלת הביצים לניסוי הנתון.
הערה: בניסויים הנוכחיים, הצלחות נאספו תוך 140 דקות כדי להכין ולמיין עוברים בשלב התאית17. - הציפו את האגר בשטיפת ביצי עובר (0.12 M NaCl, 0.04% Triton-X 100) והתסיסו בעדינות את העוברים עם מכחול כדי לעקור אותם מהאגר.
- מעבירים את העוברים לתמיסת אקונומיקה של 50% למשך 90 שניות, תוך ערבוב מדי פעם. מסננים את העוברים דרך מסננת רקמות ושוטפים היטב את תמיסת האקונומיקה במים.
- העבירו את העוברים לצלחת פטרי זכוכית 90 מ"מ עם מספיק שטיפת ביצי עוברים כדי לכסות את העוברים במלואם.
- לבחון את העוברים עם טרנסילומינציה במיקרוסקופ מנתח ולבחור עוברים של שלב ההתפתחות הרצוי להעמסה לתוך המכשיר המיקרופלואידי.
הערה: ביישום זה נבחרו עוברים בשלב הסלולריזציה. את התיאורים המפורטים של כיצד להבטיח בחירה נכונה של שלב התפתחותי ניתן למצוא במדריך המעבדה עבור Drosophila17.
4. הפעלת גירוי מכני על עוברי זבוב הפירות באמצעות שבב מיקרופלואידי
- הגדירו את כל שבעת המיקרו-ערוצים של העוברים על ידי מילוים ב-IPA מסונן של 0.4 מיקרומטר דרך יציאת הכניסה הראשית של העובר.
- החלף את ה- IPA במים מסוננים (DI) מסוננים של 0.4 מיקרומטר.
- החלף את מי ה- DI בתמיסת שטיפת ביצים לעובר.
- אספו כ-100 עוברים שנבחרו מראש מצלחת פטרי הזכוכית באמצעות פיפטה מזכוכית.
- צניחת העוברים לתוך פתח הכניסה של העובר (איור 4A).
- יש להפעיל לחץ שלילי של כ-3 PSI (כלומר, ואקום) על כניסת הגז באמצעות משאבת ואקום ניידת כדי לפתוח את המיקרו-ערוצים של העובר.
- הטה את השבב המיקרופלואידי כלפי מטה כדי שהעוברים יתיישרו באופן אוטומטי ויתמקמו במיקרו-ערוצים של העוברים (איור 4B).
- אם כניסות המיקרו-ערוצים של העובר נסתמות על ידי מספר עוברים הנכנסים בו זמנית, הטה את השבב המיקרופלואידי כלפי מעלה ואז שוב כלפי מטה כדי לנקות את הסתימה.
- בהתבסס על התפוקה הנדרשת, הכניסו עד 300 עוברים למיקרו-ערוצים של העוברים.
- לאחר השלמת טעינת העובר, הסר את הוואקום כדי לשתק את העוברים.
- הטה את השבב המיקרופלואידי בחזרה למצב האופקי (איור 4C).
- חבר מקור לחץ חיובי נייד (ראו טבלת חומרים) באמצעות מד לחץ לכניסת הגז כדי להפעיל דחיסת 3 PSI (איור 4D).
- בדוק באופן רציף את מד הלחץ כדי לוודא שהוחלה רמת דחיסה עקבית.
- אם ייערכו ניסויי הדמיה חיים על העוברים המגורה מכנית, הניחו את השבב המיקרופלואידי על מחזיק שקופית זכוכית סטנדרטי בשלב מיקרוסקופ כאשר כניסת הגז מחוברת למקור הלחץ.
- לאחר השלמת ניסוי הדחיסה, ניתן לאסוף את העוברים לניתוח במורד הזרם. כדי לעשות זאת, ראשית, להחיל את הוואקום על כניסת הגז כדי לשחרר את העוברים.
- לאחר מכן, הטה את השבב המיקרופלואידי כלפי מעלה כדי שהעוברים ינועו לכיוון יציאת ההחדרה של העובר (איור 4E).
- לאסוף את העוברים מן השבב microfluidic באמצעות פיפטה זכוכית.
הערה: לאחר האיסוף, ניתן לחקור את השפעות הדחיסה על ההתפתחות והכדאיות של העובר על ידי גידול זבובי הפירות לבגרות. יכולת העיבוד בעלת התפוקה הגבוהה של ההתקן המיקרופלואידי מאפשרת גם להשתמש בעוברים בבדיקות מבוססות אומיקה במורד הזרם, הדורשות מספר רב של דגימות (איור 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המערכת המיקרופלואידית מחולקת לשני תתי-תאים המופרדים על ידי דפנות PDMS מעוותות. התא הראשון הוא המערכת הנוזלית שבה עוברי דרוזופילה מוצגים, מיושרים אוטומטית, מסודרים ודחוסים. התא השני הוא מערכת גז שבה לחץ הגז משני צדי תעלות הדחיסה נשלט באמצעות מיקרו-ערוצים ללא מוצא כדי לשלוט במדויק ברוחב האפקטיבי של ערוצי הדחיסה. המכשיר המיקרופלואידי אטום באמצעות מגלשת זכוכית בתחתית, המאפשרת הדמיה חיה ברזולוציה גבוהה של הדגימות (איור משלים 2) עבור הממדים הרלוונטיים של המכשיר המיקרופלואידי.
אורגניזמים רב-תאיים כגון עוברי דרוזופילה נבחרים בשלב ההתפתחותי העוברי הרצוי. במקרה של עוברי דרוזופילה , כל שלבי ההתפתחות תואמים באותה מידה לגישה זו מכיוון שגודל העובר אינו משתנה עד שהם בוקעים. דגימות נבחרות מוכנסות למכשיר המיקרופלואידי דרך הכניסה הגדולה (כלומר, קוטר 4 מ"מ) באמצעות מיקרופיפט זכוכית. לאחר מכן המכשיר מוטה כלפי מטה כדי לאפשר לעוברים לזרום לתוך שבעת ערוצי הדחיסה המאורגנים באופן מקביל. אטריום ההיצרות המחבר את כניסת העובר לתעלת הדחיסה מבטיח יישור אוטומטי של העוברים לפני שהם מגיעים לפתח תעלות הדחיסה. הוואקום המופעל על כניסת הגז מסיט את דפנות הדפנות המעוותות כלפי חוץ, מגדיל את רוחב המיקרו-ערוצים האפקטיבי ומאפשר לעוברים להיכנס לתעלות הדחיסה ברצף. שבעת ערוצי הדחיסה הם באורך 22 מ"מ, ובמקביל יכולים להכיל עד 300 עוברי דרוזופילה בריצה אחת. ערוצי הדחיסה מסתיימים בצוואר בקבוק שבו רוחב המיקרו-ערוץ יורד לרמה קטנה בהרבה מזו של הדגימות, מה שמאפשר לנוזל לזרום דרכו תוך שמירה על העוברים. באמצעות גישה זו, העוברים מרוכזים בתוך ערוצי הדחיסה. לאחר הכנסת העוברים, הוואקום בכניסת הגז מוסר, ודפנות המיקרו-ערוצים חוזרות למקומן המקורי ומשתקות את העוברים המרופדים משני הצדדים. דחיסה יכולה להיות מושגת על ידי הפעלת לחץ חיובי על כניסת הגז, אשר מסיט את הדפנות המעוותות פנימה ומקטין את רוחב המיקרו-ערוץ האפקטיבי. ניתן לווסת במדויק את כמות הדחיסה המופעלת על עוברים על ידי התאמת מידות המיקרו-ערוץ, עובי הדפנות המעוותות, מודולוס יאנג של ה-PDMS והלחץ המופעל. לאחר ניסוי הדחיסה, ניתן לאסוף את העוברים לניתוח במורד הזרם על ידי הפעלת ואקום על כניסת הגז והטיית המכשיר המיקרופלואידי לכיוון אחר.
מכשיר מיקרופלואידי זה יוצר באמצעות ליתוגרפיה רכה18. עם זאת, ייצור מבנים עבים עם תכונות יחס גובה-רוחב גבוה באמצעות פוטורססיסט אולטרה-עבה דורש סטיות משמעותיות מהפרוטוקולים שהוגדרו לייצור הסטנדרטי (איור 3). יחד עם ציפוי הקסמתיל-דיסילאזאן (HDMS), ופלים הסיליקון נוקו לפני הציפוי המסתובב כדי להסיר שאריות אורגניות ונאפו כדי להסיר לחות פני השטח. שלבים נוספים אלה שיפרו את ההדבקה של שכבת הפוטורסיסט העבה אל פרוסת הסיליקון. הפוטורסיסט גם חומם לפני המזיגה כדי להפחית את הצמיגות, שהייתה חיונית לכיסוי כל משטח הוופל. עובי ציפוי הפוטורסיסט המטרה הושג באמצעות שלושה שלבים מסתובבים, כאשר כל צעד מסתובב הסיר בהדרגה את עודפי הפוטורסיסט מבלי לזהם את משטח הוופל. בהשראת שיטותשפורסמו בעבר 19, אצטון רוסס, שהוא אחד הממסים של photoresist, על פרוסת סיליקון כדי למנוע פגמים photoresist ולהגדיל את אחידות הציפוי. במהלך שלבי האפייה העוקבים, הטמפרטורה השתנתה באיטיות כדי למזער את הלחץ התרמי, מה שעלול להוביל לדלדול של הפוטורסיסט מתוך פרוסת הסיליקון. בשל חששות דומים, טמפרטורת האפייה ירדה תוך הגדלת משך הזמן. אחד השלבים המאתגרים ביותר בייצור פוטוליתוגרפי של תעלות בעלות יחס גובה-רוחב גבוה היה הסרת הפוטורסיסט הלא מרוסן לאחר חשיפה לקרינת UV. כדי למקסם את החדירה של פתרון המפתח לתעלות, פרוסת הסיליקון התהפכה והתערבבה ברציפות עם תמיסת המפתח עם מערבל. בדרך זו, פתרון המפתח הטרי יכול להגיב עם ולהסיר את photoresist uncured. שלב זה היה ואחריו אמבטיה קולית שבה הוסר הפוטורסיסט הנותר. לאחר שתבנית פרוסות הסיליקון נוצרה בהצלחה, תהליך יציקת ההעתק הסטנדרטי כלל ערבוב חומר ריפוי, דה-גז, מזיגה, ריפוי, קילוף, ניקוב והדבקת פלזמה לייצור המכשיר המיקרופלואידי הסופי20.
הפונקציונליות של המכשיר המיקרופלואידי נקבעה באופן ניסיוני על ידי טעינת עוברי דרוזופילה לתעלות הדחיסה והפעלת לחץ חיובי על תעלות הגז. מדידות של הרוחב הפוחת של העוברים תחת מיקרוסקופ (איור 5A) מדגימות כיצד ניתן להשתמש בלחץ הגז כדי להשיג רמת דחיסת מטרה (איור 5B). תמונות בהילוך מהיר של עוברים מיושרים העוברים דחיסה מדגימות גם הן את התאימות של מערכת זו למיקרוסקופיה קונפוקלית.
איור 1: העיצוב והתפקוד של המכשיר המיקרופלואידי. המכשיר המיקרופלואידי מורכב משבעה מיקרו-ערוצים מקבילים בדחיסה שיכולים לבדוק עד 300 עוברי דרוזופילה שלמים בו זמנית. (A) עוברים הוכנסו למכשיר דרך כניסת העובר הראשית, והם התיישרו לאורך הציר האחורי-קדמי באופן אוטומטי עם כניסתם למיקרו-ערוצים. (B) העוברים נעו בחופשיות כאשר הופעל לחץ שלילי דרך כניסת הגז, שכן זה הסיט את דפנות המיקרו-ערוצים המעוותים החוצה. זה איפשר את הטעינה שלהם כמו גם פריקה כנתיב יחיד. כאשר הוסר הלחץ השלילי, העוברים היו משותקים במיקרו-ערוצים. כאשר הופעל לחץ חיובי, דפנות המיקרו-ערוצים דחסו את העוברים על ידי הסטה פנימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: זרימת תהליך של ניסויי דחיסה מיקרופלואידית עבור מחקרים מכניוביולוגיים. (A) התקן המיקרופלואידיות לגירוי מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה עשוי PDMS ושקופית זכוכית לעיבוד מאות דגימות ביולוגיות רב-תאיות. (B) המכשיר מותאם לעבודה עם מערכות רב-תאיות שונות כגון תאי ביציות דרוזופילה, עוברי דרוזופילה או אורגנואידים במוח. מכשיר זה יכול להחיל דפוסי דחיסה יציבים או דינמיים על המערכות הביולוגיות. (C) ניתן לדמות את המערכות במיקרוסקופ קונפוקלי לאורך זמן בזמן שהן דחוסות. ניתן לנתח את רמות הביטוי והלוקליזציה של חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי בתגובה לדחיסה. עם האיסוף, ניתן לנתח את המערכות לצורך בדיקה והדמיה לאחר גירוי. יכולת העיבוד בעלת התפוקה הגבוהה של המכשיר המיקרופלואידי מאפשרת גם לשכב את המערכות ולהשתמש בהן בבדיקות ביולוגיות מבוססות אומיקה הדורשות מספר רב של דגימות, כפי שניתן לראות באיור עם דוגמה של תמונת אלקטרופורזה דיפרנציאלית דו-ממדית של ג'ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: תהליך הייצור של תבנית פרוסות הסיליקון עם תעלות פוטורססיסט עבות ותעלות ביחס גובה-רוחב גבוה. (A,B) תהליך הייצור הכולל החל בהכנת פרוסת הסיליקון לציפוי פוטורסיסט. (ג-ג) ציפוי פוטורסיסט עבה הוחל באופן אחיד על פרוסת הסיליקון. (ח,ט) הפוטורסיסט עוצב בחשיפה לקרינת UV דרך מסכת הצילום. (י-ל) פוטורסיסט לא מרוסן הוסר מתוך פרוסת הסיליקון. (מ-פ) החלק של PDMS יוצר באמצעות ליתוגרפיה רכה. (ש,ר) המכשיר היה אטום למגלשת הזכוכית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: פעולת המכשיר המיקרופלואידי . (A) ראשית, העוברים הוכנסו לכניסת העובר הראשית. (B) שנית, לחץ שלילי הופעל על כניסת הגז, והמכשיר המיקרופלואידי הוטה כלפי מטה כדי לאפשר לעוברים להתיישר ולהעמיס אותם לתוך המיקרו-ערוצים. (C) שלישית, הוסר לחץ שלילי כדי לשתק את העוברים. (D) רביעית, הופעל לחץ חיובי על תעלות הגז כדי לדחוס את העוברים. (E) לבסוף, העוברים נאספו מהמכשיר המיקרופלואידי על ידי חזרה ללחץ שלילי והטיית המכשיר המיקרופלואידי כלפי מעלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: מדידה ניסיונית של רמת דחיסת העובר. (A) עוברים מייצגים בתוך המכשיר המיקרופלואידי ברמות לחץ גז שונות. בעוד שהעוברים אינם חווים דחיסה משמעותית תחת ואקום או במצבי לחץ עצבי, הם נדחסים כאשר מופעל לחץ חיובי. (B) כמות זן הדחיסה החד-אקסיאלי המופעל על העוברים ברמות לחץ גז שונות (פסי שגיאה מייצגים סטיית תקן). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: דחיסה של אורגנואידים במוח במכשיר מיקרופלואידי שתוכנן ויוצר בהתאם לאותה אסטרטגיה . (A) דחיסת האורגנואידים במוח ברמות הולכות וגדלות ככל שלחץ הגז גדל. (B) רוחב האורגנואידים במוח בתוך המיקרו-ערוצים ברמות לחץ שונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
תרשים משלים 1: מבט עליון על מסכת הצילום המשמשת לייצור פוטוליתוגרפי של תבנית פרוסות הסיליקון. ישנן חמש גאומטריות של התקנים מיקרופלואידיים זהים הממוקמים בתוך שטח הקוטר 4 אינץ '. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תרשים משלים 2: מבט מלמעלה על המכשיר המיקרופלואידי ששימש במחקר זה עם הממדים הרלוונטיים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המאמר מתאר את התפתחותו של מכשיר מיקרופלואידי ליישור, שיתוק והפעלה מדויקת של גירוי מכני על מאות עוברי דרוזופילה שלמים. השילוב של המערכת המיקרופלואידית עם כיסוי זכוכית דק איפשר הדמיה של עוברים עם מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה במהלך הגירוי. המכשיר המיקרופלואידי איפשר גם את איסוף העוברים מיד לאחר הגירוי לריצה במורד הזרם בדיקות ביולוגיות. שיקולי העיצוב, שיטת הייצור והאפיון של מכשיר זה תוארו בפירוט. פרוטוקול ייצור עובש פרוסות הסיליקון איפשר ציפוי עבה אחיד של הפוטורסיסט עם תעלות יחס גובה-רוחב גבוה.
כדי שגישת ייצור זו תצליח, חשוב להוריד את הטמפרטורה של שלבי האפייה ולמזער את קצב החימום והקירור של פרוסת הסיליקון לאחר שהיא מצופה בפוטורספריסט. אם זה לא נעשה כראוי, ציפוי photoresist יכול בקלות delaminate ולשנות את גיאומטריית התבנית. לאחר ייצור מוצלח של תבנית פרוסות הסיליקון, ניתן להעתיק אותה לחומרים עמידים יותר כדי למנוע פגיעה בתבנית המקורית במהלך שלבי יציקה רצופים של העתק PDMS, המכילים גם מחזורי חימום וקירור21. הייצור של התקן המיקרופלואידי PDMS באמצעות יציקה משוכפלת מסתמך על קילוף מוצלח של מבני דופן בעלי יחס גובה-רוחב גבוה מהתבנית. כדי ששלב ייצור זה יהיה אמין, חיוני לצפות כראוי את פני השטח של פרוסת הסיליקון עם חומר סילון כדי להקל על הפילינג. כמו כן, יש לחדש את הציפוי לאחר ייצור כ-20 התקני PDMS כדי לפצות על הסרה חלקית של שכבת הסילאן במהלך כל שלב קילוף. אחרת, הדפנות יכולות להיתקע בתוך תבנית הפוטורסיסט, מה שהופך את התבנית לבלתי שמישה. מכיוון שרמת הדחיסה המיושמת על הדגימות היא פונקציה של התכונות המכניות של דפנות, חשוב לשמור על עקביות הפרמטרים של תהליך היציקה המשוכפל של PDMS. יש לעקוב מקרוב אחר יחס חומר הריפוי, הטמפרטורה ומשך הזמן במהלך הייצור. בנוסף, מכיוון שאסטרטגיית התקן זה היא ליישום גירוי מכני בו זמנית למספר רב של אורגניזמים רב-תאיים, הצבירה שלהם בתוך המיקרו-ערוצים עלולה להוביל לסתימה. למרות שבעיה זו לא נחוותה עם האורגניזמים המשמשים כאן, אם זה אכן קורה, ישנם פתרונות אפשריים מהספרות כדי להתגבר על בעיה זו, כגון שימוש בפתרונות נשאים במהלך הצגת הדגימות22.
אף על פי שעוברי דרוזופילה שימשו כאורגניזם רב-תאי שלם בעבודה זו, ניתן ליישם את אסטרטגיית התכנון והייצור המוצגת כאן על גירוי מכני של מערכות רב-תאיות אחרות על-ידי שינוי מידות המכשיר בהתאם (איור 2). ניתן להשיג זאת על ידי הרחבת הרוחב והגובה המרכזיים של המיקרו-ערוצים כך שיתאימו לאלה של המערכות הרב-תאיות. באמצעות גישה זו, דגימות יכולות להיכנס למיקרו-ערוצים ולהידחס באופן דומה על ידי הסטת דפנות המעוותות בלחץ פנאומטי חיובי. כדי להדגים גישה זו, מכשירים דומים יוצרו עבור תאי ביצים של דרוזופילה , כמו גם אורגנואידים במוח. המערכות האלה אפשרו דחיסה מכנית מדויקת של המערכות הביולוגיות האלה בדומה לניסויים בעוברי דרוזופילה (איור 6). כמו כן, מכיוון שגישה זו מאפשרת את חידוש המדיה סביב הדגימות המשותקות, היא יכולה להיות שימושית מאוד לניסויים בגירוי כימי הדורשים חילופי מדיה מהירים מבלי להפריע לדגימות. באופן כללי, גישה רב-תכליתית זו משלבת את יכולות הדיוק והאוטומציה של תפוקה גבוהה של מערכות מיקרופלואידיות תוך שהיא מאפשרת מחקרים מכניוביולוגיים חדשניים על מערכות רב-תאיות שונות כגון דגימות רקמות קטנות, אורגנואידים, עוברים וביציות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין אינטרסים כלכליים במוצרים המתוארים בכתב יד זה ואין להם שום דבר אחר לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (CMMI-1946456), משרד חיל האוויר למחקר מדעי (FA9550-18-1-0262), והמכון הלאומי לבריאות (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
References
- Wang, J. H. -C., Thampatty, B. P. An introductory review of cell mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).
- Ingber, D.
- Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering. Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).
- Bellin, R. M., et al. Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).
- Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).
- Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).
- Maurer, M., Lammerding, J. The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).
- Jennings, B. H. Drosophila-A versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Konno, M., et al. State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine. Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).
- Morgan, T. H.
- Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly. Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).
- Jayamohan, H., et al. Chapter 11 - Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies. Molecular Diagnostics. Patrinos, G., et al. , Academic Press. Cambridge, MA. 197-217 (2017).
- Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology. Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).
- Mohammed, D., et al. Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).
- Shorr, A. Z., Sönmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics. Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).
- Kim, Y. T., et al. Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).
- Ashburner, M. Drosophila. A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (1989).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro-and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).
- Lee, H., et al. A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M.
- Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. Polycarbonate heat molding for soft lithography. Small. 16 (16), 2000241 (2020).
- Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos. Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).
