Настоящий протокол описывает проектирование, изготовление и характеристику микрофлюидной системы, способной выравнивать, обездвиживать и точно сжимать сотни эмбрионов Drosophila melanogaster с минимальным вмешательством пользователя. Эта система позволяет получать изображения с высоким разрешением и восстанавливать образцы для постстимуляционного анализа и может быть масштабирована для размещения других многоклеточных биологических систем.
Во время эмбриогенеза скоординированное движение клеток генерирует механические силы, которые регулируют экспрессию и активность генов. Для изучения этого процесса были использованы такие инструменты, как аспирация или компрессия чехла, для механической стимуляции целых эмбрионов. Эти подходы ограничивают экспериментальное проектирование, поскольку они неточны, требуют ручного обращения и могут обрабатывать только пару эмбрионов одновременно. Микрофлюидные системы имеют большой потенциал для автоматизации таких экспериментальных задач при одновременном повышении пропускной способности и точности. В этой статье описывается микрофлюидная система, разработанная для точного сжатия целых эмбрионов Drosophila melanogaster (плодовой мухи). Эта система оснащена микроканалами с пневматически приводимыми деформируемыми боковыми стенками и обеспечивает выравнивание эмбриона, иммобилизацию, компрессию и сбор постстимуляции. Распараллеливая эти микроканалы в семь полос, устойчивые или динамические схемы сжатия могут быть применены к сотням эмбрионов дрозофилы одновременно. Изготовление этой системы на стеклянном крышке облегчает одновременную механическую стимуляцию и визуализацию образцов с помощью микроскопов высокого разрешения. Более того, использование биосовместимых материалов, таких как PDMS, и способность пропускать жидкость через систему делают это устройство способным к долгосрочным экспериментам с образцами, зависящими от среды. Такой подход также устраняет необходимость ручного монтажа, который механически напрягает образцы. Кроме того, возможность быстрого сбора образцов с микроканалов позволяет проводить постстимуляционный анализ, включая омические анализы, которые требуют больших количеств образцов, недостижимых с использованием традиционных подходов механической стимуляции. Геометрия этой системы легко масштабируется для различных биологических систем, что позволяет многочисленным полям извлекать выгоду из функциональных особенностей, описанных в настоящем описании, включая высокую пропускную способность образца, механическую стимуляцию или иммобилизацию и автоматическое выравнивание.
Живые системы постоянно испытывают и реагируют на различные механические входы на протяжении всей своей жизни1. Механотрансдукция была связана со многими заболеваниями, включая нарушения развития, потерю мышечной и костной массы, а также невропатологии через сигнальные пути, прямо или косвенно затронутые механической средой2. Однако гены и белки, которые регулируются механической стимуляцией3 в механочувствительных сигнальных путях4, остаются в значительной степени неизвестными5, препятствуя выяснению механизмов механической регуляции и идентификации молекулярных мишеней для заболеваний, связанных с патологической механотрансдукцией 6,7 . Одним из ограничивающих факторов в проецировании механобиологических исследований на связанные физиологические процессы является использование отдельных клеток с обычными культуральными блюдами вместо интактных многоклеточных организмов. Модельные организмы, такие как Drosophila melanogaster (плодовая муха), внесли большой вклад в понимание генов, сигнальных путей и белков, участвующих в развитии животных 8,9,10. Тем не менее, использование дрозофилы и других многоклеточных модельных организмов в механобиологических исследованиях было затруднено проблемами с экспериментальными инструментами. Традиционные методы подготовки, сортировки, визуализации или применения различных стимулов требуют в основном ручных манипуляций; эти подходы отнимают много времени, требуют специальных знаний, вносят вариативность и ограничивают экспериментальный дизайн и размер выборки11. Последние достижения в области микротехнологий являются отличным ресурсом для создания новых биологических анализов с очень высокой пропускной способностью и строго контролируемыми экспериментальными параметрами 12,13,14.
В этой статье описывается разработка усовершенствованного микрофлюидного устройства для выравнивания, иммобилизации и точного применения механической стимуляции в виде одноосного сжатия к сотням целых эмбрионов дрозофилы 15 (рисунок 1). Интеграция микрофлюидной системы со стеклянным чехлом позволила получить конфокальную визуализацию образцов с высоким разрешением во время стимуляции. Микрофлюидное устройство также позволило быстро собирать эмбрионы после стимуляции для проведения анализов -омики (рисунок 2). Объяснения конструктивных соображений этого устройства, а также изготовления с использованием мягкой литографии и экспериментальной характеристики описаны в настоящем документе. Поскольку изготовление силиконовой пластинчатой формы такого устройства требует равномерного покрытия толстого фоторезиста (толщина >200 мкм) на больших площадях с высоким соотношением сторон (AR) траншей (AR >5), этот метод значительно изменил традиционный протокол изготовления фотолитографической формы. Таким образом, этот метод облегчил обработку, адгезию, покрытие, рисунок и развитие фоторезиста. Кроме того, обсуждаются потенциальные подводные камни и их решения. Наконец, универсальность этой стратегии проектирования и изготовления была продемонстрирована с использованием других многоклеточных систем, таких как камеры яйцеклеток дрозофилы и органоиды мозга16.
В статье описывается разработка микрофлюидного устройства для автоматического выравнивания, обездвиживания и точного применения механической стимуляции к сотням целых эмбрионов дрозофилы . Интеграция микрофлюидной системы с тонким стеклянным покровом позволила во время стиму…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Национальным научным фондом (CMMI-1946456), Управлением научных исследований ВВС (FA9550-18-1-0262) и Национальным институтом здравоохранения (R01AG06100501A1; Р21АР08105201А1).
100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
Bleach | Not brand specific | ||
Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
NaCl | Not brand specific | ||
Oven | Labnet | I5110A | |
Paintbrush | Not brand specific | ||
PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |