Summary
يصف البروتوكول الحالي تصميم وتصنيع وتوصيف نظام الموائع الدقيقة القادر على محاذاة وتجميد وضغط المئات من أجنة ذبابة الفاكهة الميلانية بدقة مع الحد الأدنى من تدخل المستخدم. يتيح هذا النظام تصويرا عالي الدقة واستعادة العينات لتحليل ما بعد التحفيز ويمكن تحجيمه لاستيعاب الأنظمة البيولوجية الأخرى متعددة الخلايا.
Abstract
أثناء التطور الجنيني ، تولد حركة الخلية المنسقة قوى ميكانيكية تنظم التعبير الجيني ونشاطه. لدراسة هذه العملية ، تم استخدام أدوات مثل الشفط أو ضغط الانزلاق المغطى لتحفيز الأجنة الكاملة ميكانيكيا. تحد هذه الأساليب من التصميم التجريبي لأنها غير دقيقة ، وتتطلب معالجة يدوية ، ويمكنها معالجة بضعة أجنة فقط في وقت واحد. تتمتع أنظمة الموائع الدقيقة بإمكانات كبيرة لأتمتة مثل هذه المهام التجريبية مع زيادة الإنتاجية والدقة. توضح هذه المقالة نظام الموائع الدقيقة الذي تم تطويره لضغط أجنة ذبابة الفاكهة ( ذبابة الفاكهة ) بدقة. يتميز هذا النظام بقنوات دقيقة ذات جدران جانبية قابلة للتشوه تعمل بالهواء المضغوط ويتيح محاذاة الجنين ، والشلل ، والضغط ، وجمع ما بعد التحفيز. من خلال موازاة هذه القنوات الدقيقة في سبعة ممرات ، يمكن تطبيق أنماط ضغط ثابتة أو ديناميكية على مئات من أجنة ذبابة الفاكهة في وقت واحد. إن تصنيع هذا النظام على غطاء زجاجي يسهل التحفيز الميكانيكي المتزامن وتصوير العينات باستخدام مجاهر عالية الدقة. علاوة على ذلك ، فإن استخدام المواد المتوافقة حيويا ، مثل PDMS ، والقدرة على تدفق السوائل عبر النظام يجعل هذا الجهاز قادرا على إجراء تجارب طويلة الأجل مع عينات تعتمد على الوسائط. يلغي هذا النهج أيضا متطلبات التركيب اليدوي الذي يضغط ميكانيكيا على العينات. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على جمع العينات بسرعة من القنوات الدقيقة تتيح تحليلات ما بعد التحفيز ، بما في ذلك فحوصات -omics التي تتطلب أعدادا كبيرة من العينات لا يمكن تحقيقها باستخدام أساليب التحفيز الميكانيكي التقليدية. هندسة هذا النظام قابلة للتطوير بسهولة لأنظمة بيولوجية مختلفة ، مما يتيح للعديد من المجالات الاستفادة من الميزات الوظيفية الموضحة هنا بما في ذلك إنتاجية العينة العالية ، والتحفيز الميكانيكي أو الشلل ، والمحاذاة الآلية.
Introduction
تشهد الأنظمة الحية باستمرار وتستجيب لمختلف المدخلات الميكانيكية طوال حياتها1. تم ربط النقل الميكانيكي بالعديد من الأمراض ، بما في ذلك اضطرابات النمو ، وفقدان العضلات والعظام ، والأمراض العصبية من خلال مسارات الإشارات المتأثرة بشكل مباشر أو غير مباشر بالبيئة الميكانيكية2. ومع ذلك ، فإن الجينات والبروتينات التي يتم تنظيمها عن طريق التحفيز الميكانيكي3 في مسارات الإشارات الحساسة للميكانيكية4 لا تزال غير معروفة إلى حد كبير5 ، مما يمنع توضيح آليات التنظيم الميكانيكي وتحديد الأهداف الجزيئية للأمراض المرتبطة بالنقل الميكانيكي المرضي 6,7 . أحد العوامل المحددة في إسقاط دراسات البيولوجيا الميكانيكية على العمليات الفسيولوجية ذات الصلة هو استخدام الخلايا الفردية مع أطباق الاستزراع التقليدية بدلا من الكائنات الحية متعددة الخلايا السليمة. ساهمت الكائنات الحية النموذجية ، مثل ذبابة الفاكهة (ذبابة الفاكهة) ، بشكل كبير في فهم الجينات ومسارات الإشارات والبروتينات المشاركة في تنمية الحيوان8،9،10. ومع ذلك ، فإن استخدام ذبابة الفاكهة وغيرها من الكائنات النموذجية متعددة الخلايا في أبحاث البيولوجيا الميكانيكية قد أعيقت بسبب التحديات المتعلقة بالأدوات التجريبية. تتطلب التقنيات التقليدية لإعداد أو فرز أو تصوير أو تطبيق محفزات مختلفة معالجة يدوية في الغالب. تستغرق هذه الأساليب وقتا طويلا ، وتتطلب خبرة ، وإدخال التباين ، والحد من التصميم التجريبي وحجم العينة11. تعد التطورات التكنولوجية الدقيقة الحديثة موردا رائعا لتمكين المقايسات البيولوجية الجديدة ذات الإنتاجية العالية جدا والمعلمات التجريبية عالية التحكم12،13،14.
توضح هذه المقالة تطوير جهاز موائع دقيقة محسن لمحاذاة التحفيز الميكانيكي وشل حركته وتطبيقه بدقة في شكل ضغط أحادي المحور على مئات من أجنة ذبابة الفاكهة الكاملة 15 (الشكل 1). سمح تكامل نظام الموائع الدقيقة مع غطاء زجاجي بتصوير متحد البؤر عالي الدقة للعينات أثناء التحفيز. كما مكن جهاز الموائع الدقيقة من الجمع السريع للأجنة بعد التحفيز لتشغيل مقايسات أوميكس (الشكل 2). يتم وصف تفسيرات اعتبارات التصميم لهذا الجهاز ، بالإضافة إلى التصنيع باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة والتوصيف التجريبي ، هنا. نظرا لأن صنع قالب رقاقة السيليكون لمثل هذا الجهاز يتطلب طلاءا موحدا من مقاومة الضوء السميكة (سمك >200 ميكرومتر) على مساحات كبيرة ذات خنادق ذات نسبة عرض إلى ارتفاع عالية (AR) (AR >5) ، فقد عدلت هذه الطريقة بشكل كبير بروتوكول تصنيع القوالب الحجرية الضوئية. بهذه الطريقة ، سهلت هذه الطريقة التعامل مع مقاومة الضوء والالتصاق والطلاء والنقش وتطويرها. بالإضافة إلى ذلك ، تتم مناقشة المزالق المحتملة وحلولها. أخيرا ، تم إثبات تنوع استراتيجية التصميم والتصنيع هذه باستخدام أنظمة أخرى متعددة الخلايا مثل غرف بيض ذبابة الفاكهة وعضويات الدماغ16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تحضير قالب رقاقة السيليكون
- نظف رقاقة السيليكون (انظر جدول المواد) أولا باستخدام الأسيتون ثم باستخدام كحول الأيزوبروبيل (IPA).
- ضع رقاقة السيليكون على طبق ساخن 250 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لخبز الجفاف (الشكل 3 أ).
- قم بتغطية رقاقة السيليكون ب hexamethyldisilazane (HDMS) في فرن بخار رئيسي (انظر جدول المواد) (درجة حرارة العملية: 150 درجة مئوية ، ضغط العملية: 2 تور ، وقت المعالجة: 5 دقائق ، حجم HDMS: 5 ميكرولتر) (الشكل 3 ب).
- ضع زجاجة من SU-8 2100 المقاوم للضوء (انظر جدول المواد) في فرن 60 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتقليل لزوجتها.
ملاحظة: عند التسخين في الفرن ، تقل لزوجة المقاوم للضوء. يمكن التعامل مع المقاومات الضوئية ذات اللزوجة المنخفضة بسهولة أكبر ويمكن سكبها بدقة أكبر فوق الرقاقة. - ضع رقاقة السيليكون على صفيحة ساخنة 60 درجة مئوية واسكب 1 مل من المقاومة الضوئية الساخنة لكل بوصة من الرقاقة حتى تغطي المقاومة الضوئية معظم السطح (الشكل 3 ج).
- انقل رقاقة السيليكون المطلية بالمقاومة للضوء إلى طبقة دوارة (انظر جدول المواد).
- قم بتطبيق ما قبل الدوران أولا عند 250 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية ثم عند 350 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية أخرى ، وكلاهما بتسارع 100 دورة في الدقيقة / ثانية (الشكل 3D).
- قم بإزالة المقاومة الزائدة للضوء من حواف رقاقة السيليكون باستخدام مسحة غرف الأبحاث.
- قم بتطبيق الدوران أولا عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 15 ثانية مع تسارع 100 دورة في الدقيقة / ثانية ثم عند 1450 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية مع تسارع 300 دورة في الدقيقة / ثانية (الشكل 3E).
- قم بإزالة حبة الحافة باستخدام مسحة غرف الأبحاث.
- ضع رقاقة السيليكون على صفيحة تسخين 50 درجة مئوية ورش الأسيتون على الرقاقة لإزالة العيوب وتعزيز الطلاء الموحد (الشكل 3F).
- ارفع درجة حرارة الصفيحة الساخنة ببطء إلى 95 درجة مئوية بمعدل 2 درجة مئوية / دقيقة.
- اخبز رقاقة السيليكون على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة (الشكل 3G).
- قم بتبريد الطبق الساخن ببطء إلى درجة حرارة الغرفة بمعدل 2 درجة مئوية / دقيقة.
- ضع رقاقة السيليكون على مصفف القناع (انظر جدول المواد) وضع القناع الضوئي فوقه (يرجى الرجوع إلى الشكل التكميلي 1 لهندسة القناع الضوئي).
- قم بتعريض رقاقة السيليكون لضوء الأشعة فوق البنفسجية 350 mJ / cm 2 (35 mW / cm2 لمدة 10 s) من خلال القناع الضوئي باستخدام محاذاة قناع التلامس (الشكل 3H).
- ضع مخبوزات متتالية بعد التعرض على رقاقة السيليكون عن طريق وضع الرقاقة على طبق ساخن عند 50 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق إضافية ، وأخيرا عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة أخرى (الشكل 3I).
- قم بتبريد رقاقة السيليكون ببطء إلى درجة حرارة الغرفة بمعدل 2 درجة مئوية / دقيقة.
- ضع محركا مغناطيسيا بقطر أصغر قليلا من رقاقة السيليكون في دورق. اقلب رقاقة السيليكون رأسا على عقب وضعها فوق الدورق.
- ضع الدورق داخل دورق أكبر آخر واملأ الدورق الأكبر بمحلول مطور جديد (انظر جدول المواد). اترك رقاقة السيليكون مغمورة في المطور لمدة 30 دقيقة مع تشغيل المحرك (الشكل 3J).
- نقل رقاقة السيليكون إلى سونيكاتور حمام بالموجات فوق الصوتية مليئة المطور الطازج لمدة 1 ساعة في 40 كيلو هرتز (الشكل 3K).
- اغسل رقاقة السيليكون جيدا بمحلول IPA للحصول على قالب رقاقة السيليكون النهائي (الشكل 3L).
2. تصنيع رقاقة الموائع الدقيقة
- ضع قالب رقاقة السيليكون في مجفف مع 10 قطرات (~ 500 ميكرولتر) من ثلاثي كلورو (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) silane (PFOCTS ، انظر جدول المواد) في قارب وزن صغير قريب.
- قم بتوصيل المجفف بمضخة تفريغ عند حوالي 200 تور لمدة 30 دقيقة.
- قم بإيقاف تشغيل صمام المجفف وافصل مضخة التفريغ طوال الليل لطلاء PFOCTS.
- قم بإعداد محلول polydimethylsiloxane (PDMS) المعالج مسبقا عن طريق خلط قاعدة PDMS مع عامل المعالجة (انظر جدول المواد) بنسبة 10: 1.
- قم بإزالة الغاز من الخليط عن طريق وضعه في جهاز طرد مركزي (500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة).
ملاحظة: يسمح هذا الطرد المركزي للفقاعات بالهجرة إلى السطح العلوي وبالتالي إزالتها في فترة زمنية قصيرة. - صب محلول PDMS المفرغة على قالب رقاقة السيليكون.
- قم بإزالته مرة أخرى لإزالة فقاعات الهواء المحاصرة على سطح القالب.
- عالج PDMS في فرن 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة و 50 دقيقة (الشكل 3M).
- استخدم مشرطا لقطع حدود منطقة PDMS المعالجة المقابلة لهندسة رقاقة الموائع الدقيقة (الشكل 3N).
- قشر جزء PDMS وضعه رأسا على عقب على حصيرة القطع.
- استخدم ماكينة حلاقة لقطع جزء PDMS إلى شكله النهائي (الشكل 3O).
- قم بثقب فتحات المدخل والمخرج على PDMS باستخدام لكمة خزعة (انظر جدول المواد) أو إبرة بطرف غير حاد (الشكل 3P).
- بالنسبة لفتحة مدخل الجنين ، استخدم لكمة قطرها 4 مم.
- بالنسبة لفتحات مخرج الجنين ، استخدم لكمة قطرها 1.3 مم.
- بالنسبة لفتحة مدخل الغاز ، استخدم لكمة 2 مم.
- استخدم قطعة من شريط سكوتش لإزالة أي جسيمات قد تبقى على السطح المنقوش لنظام PDMS.
- قم بتنظيف شريحة زجاجية مستطيلة مقاس 24 مم × 60 مم أولا باستخدام الأسيتون ثم باستخدام IPA.
- جفف السطح الزجاجي بمسدس هواء متصل بمصدر هواء مفلتر.
- ضع مخبوزة تجفيف على الشريحة الزجاجية بوضعها على طبق ساخن 250 درجة مئوية لمدة 2 ساعة (الشكل 3Q).
- قم بتغطية الشريحة الزجاجية بدورق لمنع تلوث السطح.
- ضع PDMS ، مع جانبه المزخرف لأعلى ، والزجاج المجفف ينزلق في منظف البلازما (انظر جدول المواد).
- عالج PDMS والشريحة الزجاجية ببلازما الأكسجين عند 18 واط لمدة 30 ثانية.
- ضع PDMS على الشريحة الزجاجية بحيث يكون سطحها المزخرف متجها نحو الشريحة الزجاجية لإغلاق القنوات الدقيقة عبر الترابط التساهمي (الشكل 3R).
- استخدم الملقط لدفع جزء PDMS برفق ضد الشريحة الزجاجية لضمان الاتصال المطابق الكامل.
- قم بتخزين شريحة الموائع الدقيقة المكتملة في درجة حرارة الغرفة طوال الليل للسماح للترابط بالوصول إلى قوته النهائية.
3. تحضير أجنة ذبابة الفاكهة
- اسمح للذباب البالغ في ولاية أوريغون آر بوضع البيض على أطباق أجار عصير التفاح (1.5٪ أجار ، 25٪ عصير تفاح ، 2.5٪ سكروز) وجمع الأطباق في وقت النمو المطلوب بعد وضع البيض للتجربة المحددة.
ملاحظة: بالنسبة للتجارب الحالية ، تم جمع الألواح في 140 دقيقة لإعداد وفرز الأجنة في مرحلة الخلوي17. - اغمر الآجار بغسل بيض الجنين (0.12 م كلوريد الصوديوم ، 0.04٪ Triton-X 100) وقم بتحريك الأجنة برفق باستخدام فرشاة رسم لإخراجها من أجار.
- انقل الأجنة إلى محلول مبيض بنسبة 50٪ لمدة 90 ثانية مع التحريك من حين لآخر. صفي الأجنة من خلال غربال الأنسجة واغسلي محلول التبييض جيدا بالماء.
- انقل الأجنة إلى طبق بتري زجاجي 90 مم مع ما يكفي من غسل بيض الجنين لتغطية الأجنة بالكامل.
- فحص الأجنة مع transillumination على مجهر تشريح واختيار الأجنة من مرحلة التطور المطلوبة للتحميل في جهاز الموائع الدقيقة.
ملاحظة: في هذا التطبيق ، تم اختيار الأجنة في مرحلة الخلوية. يمكن العثور على الأوصاف التفصيلية لكيفية ضمان الاختيار السليم لمرحلة النمو في كتيب المختبر لذبابة الفاكهة17.
4. تطبيق التحفيز الميكانيكي على أجنة ذبابة الفاكهة باستخدام رقاقة الموائع الدقيقة
- قم بتجهيز جميع القنوات الدقيقة للأجنة السبعة عن طريق ملئها ب 0.4 ميكرومتر IPA المصفى من خلال منفذ مدخل الجنين الرئيسي.
- استبدل IPA بماء منزوع الأيونات (DI) مصفى 0.4 ميكرومتر.
- استبدل ماء DI بمحلول غسل بيض الجنين.
- اجمع ما يقرب من 100 جنين تم اختيارها مسبقا من طبق بتري الزجاجي باستخدام ماصة زجاجية.
- ماصة الأجنة في منفذ مدخل الجنين (الشكل 4 أ).
- ضع ضغطا سلبيا يبلغ حوالي 3 رطل لكل بوصة مربعة (أي فراغ) على مدخل الغاز باستخدام مضخة تفريغ محمولة لفتح القنوات الدقيقة للجنين.
- قم بإمالة شريحة الموائع الدقيقة لأسفل حتى تتم محاذاة الأجنة تلقائيا وتستقر في القنوات الدقيقة للجنين (الشكل 4 ب).
- إذا انسدادت مداخل القناة الدقيقة للجنين بسبب دخول أجنة متعددة في وقت واحد ، فقم بإمالة شريحة الموائع الدقيقة لأعلى ثم لأسفل مرة أخرى لإزالة الانسداد.
- بناء على الإنتاجية المطلوبة ، أدخل ما يصل إلى 300 جنين في القنوات الدقيقة للأجنة.
- بمجرد اكتمال تحميل الجنين ، قم بإزالة الفراغ لشل حركة الأجنة.
- قم بإمالة شريحة الموائع الدقيقة مرة أخرى إلى الوضع الأفقي (الشكل 4C).
- قم بتوصيل مصدر ضغط إيجابي محمول (انظر جدول المواد) بمقياس ضغط بمدخل الغاز لتطبيق ضغط 3 PSI (الشكل 4D).
- تحقق باستمرار من مقياس الضغط لضمان تطبيق مستوى ضغط ثابت.
- إذا تم إجراء تجارب التصوير الحي على الأجنة المحفزة ميكانيكيا ، فضع شريحة الموائع الدقيقة على حامل منزلق زجاجي قياسي لمرحلة المجهر مع توصيل مدخل الغاز بمصدر الضغط.
- بمجرد اكتمال تجربة الانضغاط ، يمكن جمع الأجنة لتحليلها في المراحل النهائية. من أجل القيام بذلك ، أولا ، قم بتطبيق الفراغ على مدخل الغاز لتحرير الأجنة.
- بعد ذلك ، قم بإمالة شريحة الموائع الدقيقة لأعلى حتى تتحرك الأجنة نحو منفذ إدخال الجنين (الشكل 4 ه).
- جمع الأجنة من رقاقة الموائع الدقيقة باستخدام ماصة زجاجية.
ملاحظة: عند الجمع ، يمكن التحقيق في آثار الضغط على التطور الجنيني وقابليته للحياة عن طريق زراعة ذباب الفاكهة إلى مرحلة البلوغ. كما تتيح قدرة المعالجة عالية الإنتاجية لجهاز الموائع الدقيقة استخدام الأجنة في المقايسات القائمة على أوميكس والتي تتطلب عددا كبيرا من العينات (الشكل 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ينقسم نظام الموائع الدقيقة إلى قسمين فرعيين مفصولين بجدران جانبية PDMS قابلة للتشوه. الحجرة الأولى هي النظام السائل حيث يتم إدخال أجنة ذبابة الفاكهة ومحاذاتها تلقائيا واصطفافها وضغطها. الحجرة الثانية عبارة عن نظام غاز حيث يتم التحكم في ضغط الغاز على جانبي قنوات الضغط عبر قنوات دقيقة مسدودة للتحكم بدقة في العرض الفعال لقنوات الضغط. يتم ختم جهاز الموائع الدقيقة بشريحة زجاجية في الأسفل ، مما يتيح التصوير المباشر عالي الدقة للعينات (الشكل التكميلي 2) للأبعاد ذات الصلة لجهاز الموائع الدقيقة.
يتم اختيار الكائنات متعددة الخلايا مثل أجنة ذبابة الفاكهة في مرحلة النمو الجنيني المطلوبة. في حالة أجنة ذبابة الفاكهة ، تتوافق جميع مراحل النمو بالتساوي مع هذا النهج لأن حجم الجنين لا يتغير حتى يفقس. يتم إدخال عينات مختارة في جهاز الموائع الدقيقة من خلال المدخل الكبير (أي قطر 4 مم) باستخدام ماصة زجاجية دقيقة. ثم يتم إمالة الجهاز لأسفل للسماح للأجنة بالتدفق إلى قنوات الضغط السبع المنظمة بطريقة متوازية. يضمن الأذين الضيق الذي يربط مدخل الجنين بقناة الضغط المحاذاة التلقائية للأجنة قبل وصولها إلى مدخل قنوات الضغط. يعمل الفراغ المطبق على مدخل الغاز على انحراف الجدران الجانبية المشوهة إلى الخارج ، مما يزيد من عرض القناة الدقيقة الفعالة ويسمح للأجنة بدخول قنوات الضغط بالتتابع. يبلغ طول قنوات الضغط السبع 22 مم ، وبالتوازي ، يمكن أن تستوعب ما يصل إلى 300 جنين ذبابة الفاكهة في جولة واحدة. تنتهي قنوات الضغط في عنق الزجاجة حيث ينخفض عرض القناة الدقيقة إلى مستوى أصغر بكثير من عرض العينات ، مما يسمح للسائل بالتدفق مع الاحتفاظ بالأجنة. من خلال هذا النهج ، تتركز الأجنة داخل قنوات الضغط. بعد إدخال الأجنة ، تتم إزالة الفراغ في مدخل الغاز ، وتعود الجدران الجانبية للقناة الدقيقة إلى وضعها الأصلي وتشل حركة الأجنة المصطفة من كلا الجانبين. يمكن تحقيق الضغط عن طريق تطبيق ضغط إيجابي على مدخل الغاز ، مما يؤدي إلى انحراف الجدران الجانبية المشوهة إلى الداخل ويقلل من عرض القناة الدقيقة الفعال. يمكن تنظيم مقدار الضغط المطبق على الأجنة بدقة عن طريق تصميم أبعاد القناة الدقيقة ، وسمك الجدران الجانبية القابلة للتشوه ، ومعامل يونغ لنظام PDMS ، والضغط المطبق. بعد تجربة الضغط ، يمكن جمع الأجنة لتحليلها عن طريق تطبيق فراغ على مدخل الغاز وإمالة جهاز الموائع الدقيقة في اتجاه آخر.
تم تصنيع جهاز الموائع الدقيقة هذا باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة18. ومع ذلك ، فإن تصنيع الهياكل السميكة ذات ميزات نسبة العرض إلى الارتفاع العالية باستخدام مقاومة ضوئية فائقة السماكة يتطلب انحرافات كبيرة عن البروتوكولات المحددة للتصنيع القياسي (الشكل 3). جنبا إلى جنب مع طلاء hexamethyldisilazane (HDMS) ، تم تنظيف رقائق السيليكون قبل طلاء الدوران لإزالة المخلفات العضوية وخبزها لإزالة رطوبة السطح. عززت هذه الخطوات الإضافية ربط الطبقة السميكة المقاومة للضوء برقاقة السيليكون. تم تسخين المقاوم الضوئي أيضا قبل صبه لتقليل اللزوجة ، وهو أمر بالغ الأهمية لتغطية سطح الرقاقة بالكامل. تم تحقيق سمك الطلاء المقاوم للضوء المستهدف من خلال ثلاث خطوات غزل ، حيث أزالت كل خطوة غزل تدريجيا المقاومة الضوئية الزائدة دون تلويث سطح الرقاقة. مستوحاة من الطرق المنشورة سابقا19 ، تم رش الأسيتون ، وهو أحد مذيبات المقاومة للضوء ، على رقاقة السيليكون للتخلص من العيوب المقاومة للضوء وزيادة توحيد الطلاء. أثناء خطوات الخبز المتتالية ، تم تغيير درجة الحرارة ببطء لتقليل الإجهاد الحراري ، مما قد يؤدي إلى تفريغ المقاومة الضوئية من رقاقة السيليكون. بسبب مخاوف مماثلة ، انخفضت درجة حرارة الخبز مع زيادة مدته. كانت إحدى الخطوات الأكثر تحديا في التصنيع الحجري الضوئي للخنادق ذات نسبة العرض إلى الارتفاع العالية هي إزالة المقاومة الضوئية غير المعالجة بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية. لتحقيق أقصى قدر من تغلغل حل المطور في الخنادق ، تم قلب رقاقة السيليكون رأسا على عقب وخلطها باستمرار مع حل المطور باستخدام محرض. بهذه الطريقة ، يمكن أن يتفاعل حل المطور الجديد مع مقاومة الضوء غير المعالجة ويزيلها. تبع هذه الخطوة حمام بالموجات فوق الصوتية حيث تمت إزالة المقاومة الضوئية المتبقية. بمجرد إنشاء قالب رقاقة السيليكون بنجاح ، تألفت عملية التشكيل المقلدة القياسية من خلط عامل المعالجة ، والتفريغ ، والصب ، والمعالجة ، والتقشير ، واللكم ، وربط البلازما لتصنيع جهاز الموائع الدقيقة النهائي20.
تم تحديد وظيفة جهاز الموائع الدقيقة تجريبيا عن طريق تحميل أجنة ذبابة الفاكهة في قنوات الضغط وتطبيق ضغط إيجابي على قنوات الغاز. توضح قياسات العرض المتناقص للأجنة تحت المجهر (الشكل 5 أ) كيف يمكن استخدام ضغط الغاز للحصول على مستوى ضغط مستهدف (الشكل 5 ب). تظهر صور الفاصل الزمني للأجنة المحاذاة التي تخضع للضغط أيضا توافق هذا النظام مع الفحص المجهري متحد البؤر.
الشكل 1: تصميم ووظيفة جهاز الموائع الدقيقة. يتكون جهاز الموائع الدقيقة من سبع قنوات دقيقة ضغط متوازية يمكنها اختبار ما يصل إلى 300 جنين كامل من ذبابة الفاكهة في وقت واحد. (أ) أدخلت الأجنة إلى الجهاز عبر مدخل الجنين الرئيسي، وتمت محاذاتها تلقائيا على طول المحور الخلفي الأمامي عند دخولها القنوات الدقيقة. (ب) كانت الأجنة تتحرك بحرية عندما حدث ضغط سلبي عبر مدخل الغاز؛ لأن ذلك أدى إلى انحراف الجدران الجانبية للقناة الدقيقة المشوهة إلى الخارج. هذا سمح لتحميلها وكذلك تفريغها كحارة واحدة. عندما تمت إزالة الضغط السلبي ، تم تجميد الأجنة في القنوات الدقيقة. عندما تم تطبيق ضغط إيجابي ، ضغطت الجدران الجانبية للقناة الدقيقة على الأجنة عن طريق الانحراف إلى الداخل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تدفق عملية تجارب ضغط الموائع الدقيقة لدراسات البيولوجيا الميكانيكية. (أ) جهاز التحفيز الميكانيكي للموائع الدقيقة عالي الإنتاجية مصنوع من PDMS وشريحة زجاجية لمعالجة مئات العينات البيولوجية متعددة الخلايا. (ب) الجهاز مصمم للعمل مع أنظمة مختلفة متعددة الخلايا مثل غرف بيض ذبابة الفاكهة أو أجنة ذبابة الفاكهة أو عضويات الدماغ. يمكن لهذا الجهاز تطبيق أنماط ضغط ثابتة أو ديناميكية على الأنظمة الحيوية. (ج) يمكن تصوير النظامين باستخدام مجهر متحد البؤر بمرور الوقت أثناء ضغطهما. يمكن تحليل مستويات التعبير وتوطين البروتينات الموسومة بالفلورسنت استجابة للضغط. عند التجميع ، يمكن تحليل الأنظمة لاختبار ما بعد التحفيز والتصوير. تسمح قدرة المعالجة عالية الإنتاجية لجهاز الموائع الدقيقة أيضا بتحليل الأنظمة واستخدامها في المقايسات البيولوجية القائمة على omics والتي تتطلب عددا كبيرا من العينات ، كما هو موضح في الشكل مع مثال صورة الرحلان الكهربائي للهلام التفاضلي 2-Dimension. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: عملية تصنيع قالب رقاقة السيليكون مع خنادق سميكة مقاومة للضوء ونسبة عرض إلى ارتفاع عالية. (أ ، ب) بدأت عملية التصنيع الشاملة بإعداد رقاقة السيليكون للطلاء المقاوم للضوء. (جيم - ز) تم تطبيق طلاء سميك مقاوم للضوء بشكل موحد على رقاقة السيليكون. (ح، ط) تم نقش المقاومة الضوئية بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية من خلال القناع الضوئي. (J-L) تمت إزالة مقاومة الضوء غير المعالجة من رقاقة السيليكون. (م-ف) تم تصنيع جزء PDMS من خلال الطباعة الحجرية الناعمة. (س، ص) تم إغلاق الجهاز على الشريحة الزجاجية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تشغيل جهاز الموائع الدقيقة . (أ) أولا، تم سحب الأجنة في مدخل الجنين الرئيسي. (ب) ثانيا، تم تطبيق ضغط سلبي على مدخل الغاز، وتم إمالة جهاز الموائع الدقيقة لأسفل للسماح للأجنة بالمحاذاة وتحميلها في القنوات الدقيقة. ج: ثالثا، إزالة الضغط السلبي لشل حركة الأجنة. د: رابعا، الضغط الموجب على قنوات الغاز لضغط الأجنة. (ه) وأخيرا، جمعت الأجنة من جهاز الموائع الدقيقة عن طريق العودة إلى الضغط السالب وإمالة جهاز الموائع الدقيقة لأعلى. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: القياس التجريبي لمستوى انضغاط الجنين . (أ) أجنة ممثلة داخل جهاز الموائع الدقيقة تحت مستويات مختلفة من ضغط الغاز. في حين أن الأجنة لا تعاني من ضغط كبير تحت الفراغ أو في حالات الضغط العصبي ، يتم ضغطها عند تطبيق الضغط الإيجابي. (ب) كمية الانضغاط أحادي المحور المطبقة على الأجنة عند مستويات مختلفة من ضغط الغاز (تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: ضغط الكائنات العضوية في الدماغ في جهاز الموائع الدقيقة المصمم والمصنع باتباع نفس الاستراتيجية. أ: انضغاط العضويات في الدماغ عند مستويات متزايدة مع زيادة ضغط الغاز. ب: عرض عضويات الدماغ داخل القنوات الدقيقة عند مستويات ضغط مختلفة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل التكميلي 1: منظر علوي للقناع الضوئي المستخدم في التصنيع الحجري الضوئي لقالب رقاقة السيليكون. هناك خمسة أشكال هندسية متطابقة لجهاز الموائع الدقيقة تقع داخل منطقة قطرها 4. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: منظر علوي لجهاز الموائع الدقيقة المستخدم في هذه الدراسة مع الأبعاد ذات الصلة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصف المقالة تطوير جهاز الموائع الدقيقة لمحاذاة التحفيز الميكانيكي تلقائيا وشل حركته وتطبيقه بدقة على مئات من أجنة ذبابة الفاكهة الكاملة. سمح دمج نظام الموائع الدقيقة مع غطاء زجاجي رقيق بتصوير الأجنة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر عالي الدقة أثناء التحفيز. كما مكن جهاز الموائع الدقيقة من جمع الأجنة مباشرة بعد التحفيز لتشغيل المقايسات البيولوجية في اتجاه مجرى النهر. تم وصف اعتبارات التصميم وطريقة التصنيع وتوصيف هذا الجهاز بالتفصيل. سمح بروتوكول تصنيع قالب رقاقة السيليكون بالطلاء السميك الموحد للمقاومة الضوئية مع خنادق نسبة العرض إلى الارتفاع العالية.
لكي ينجح نهج التصنيع هذا ، من المهم خفض درجة حرارة خطوات الخبز وتقليل معدلات التسخين والتبريد لرقاقة السيليكون بعد طلائها بمقاومة للضوء. إذا لم يتم ذلك بشكل صحيح ، يمكن للطلاء المقاوم للضوء أن يفك بسهولة ويغير هندسة القالب. بمجرد تصنيع قالب رقاقة السيليكون بنجاح ، يمكن نسخه إلى مواد أكثر متانة لمنع إتلاف القالب الأصلي أثناء خطوات التشكيل المتماثلة المتتالية PDMS ، والتي تحتوي أيضا على دورات تسخين وتبريد21. يعتمد تصنيع جهاز الموائع الدقيقة PDMS من خلال القولبة المقلدة على التقشير الناجح لهياكل الجدار الجانبي ذات نسبة العرض إلى الارتفاع العالية من القالب. لكي تكون خطوة التصنيع هذه موثوقة ، من الأهمية بمكان طلاء سطح رقاقة السيليكون بشكل صحيح بعامل سيلانينج لتسهيل التقشير. يجب أيضا تجديد الطلاء بعد تصنيع ما يقرب من 20 جهاز PDMS لتعويض الإزالة الجزئية لطبقة السيلان أثناء كل خطوة تقشير. خلاف ذلك ، يمكن أن تصبح الجدران الجانبية عالقة داخل نمط مقاومة الضوء ، مما يجعل القالب غير قابل للاستخدام. نظرا لأن مستوى الضغط المطبق على العينات هو دالة على الخواص الميكانيكية للجدران الجانبية ، فمن المهم الحفاظ على اتساق معلمات عملية التشكيل المتماثلة PDMS. يجب مراقبة نسبة عامل المعالجة ودرجة الحرارة والمدة عن كثب أثناء التصنيع. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن استراتيجية الجهاز هذه مخصصة لتطبيق التحفيز الميكانيكي في وقت واحد على عدد كبير من الكائنات متعددة الخلايا ، فإن تجميعها داخل القنوات الدقيقة يمكن أن يؤدي إلى انسداد. على الرغم من أن هذه المشكلة لم تكن من ذوي الخبرة مع الكائنات المستخدمة هنا ، إذا حدث ذلك ، فهناك حلول محتملة من الأدبيات للتغلب على هذه المشكلة ، مثل استخدام حلول الناقل أثناء إدخال العينات22.
على الرغم من استخدام أجنة ذبابة الفاكهة ككائن كامل متعدد الخلايا في هذا العمل ، إلا أنه يمكن تطبيق استراتيجية التصميم والتصنيع المعروضة هنا على التحفيز الميكانيكي للأنظمة الأخرى متعددة الخلايا عن طريق تغيير أبعاد الجهاز وفقا لذلك (الشكل 2). يمكن تحقيق ذلك عن طريق توسيع عرض وارتفاع القناة الدقيقة المركزية لتتناسب مع تلك الموجودة في الأنظمة متعددة الخلايا. من خلال هذا النهج ، يمكن أن تدخل العينات إلى القنوات الدقيقة ويتم ضغطها بالمثل عن طريق انحراف الجدران الجانبية القابلة للتشوه بضغط هوائي إيجابي. لإثبات هذا النهج ، تم تصنيع أجهزة مماثلة لغرف بيض ذبابة الفاكهة ، وكذلك عضويات الدماغ. مكنت هذه الأنظمة من الضغط الميكانيكي الدقيق لهذه الأنظمة البيولوجية المشابهة لتجارب أجنة ذبابة الفاكهة (الشكل 6). أيضا ، نظرا لأن هذا النهج يتيح تجديد الوسائط حول العينات المجمدة ، فقد يكون مفيدا جدا لتجارب التحفيز الكيميائي التي تتطلب تبادلا سريعا للوسائط دون إزعاج العينات. بشكل عام ، يجمع هذا النهج متعدد الاستخدامات بين قدرات الأتمتة الدقيقة والإنتاجية العالية لأنظمة الموائع الدقيقة مع تمكين دراسات البيولوجيا الميكانيكية الجديدة على أنظمة متعددة الخلايا المختلفة مثل عينات الأنسجة الصغيرة والكائنات العضوية والأجنة والبويضات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس للمؤلفين أي مصالح مالية في المنتجات الموصوفة في هذه المخطوطة وليس لديهم أي شيء آخر يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (CMMI-1946456) ، ومكتب القوات الجوية للبحث العلمي (FA9550-18-1-0262) ، والمعهد الوطني للصحة (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
References
- Wang, J. H. -C., Thampatty, B. P. An introductory review of cell mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).
- Ingber, D.
- Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering. Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).
- Bellin, R. M., et al. Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).
- Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).
- Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).
- Maurer, M., Lammerding, J. The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).
- Jennings, B. H. Drosophila-A versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Konno, M., et al. State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine. Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).
- Morgan, T. H.
- Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly. Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).
- Jayamohan, H., et al. Chapter 11 - Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies. Molecular Diagnostics. Patrinos, G., et al. , Academic Press. Cambridge, MA. 197-217 (2017).
- Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology. Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).
- Mohammed, D., et al. Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).
- Shorr, A. Z., Sönmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics. Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).
- Kim, Y. T., et al. Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).
- Ashburner, M. Drosophila. A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (1989).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro-and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).
- Lee, H., et al. A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M.
- Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. Polycarbonate heat molding for soft lithography. Small. 16 (16), 2000241 (2020).
- Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos. Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).
