Summary
O presente protocolo descreve o projeto, fabricação e caracterização de um sistema microfluídico capaz de alinhar, imobilizar e comprimir com precisão centenas de embriões de Drosophila melanogaster com intervenção mínima do usuário. Este sistema permite imagens de alta resolução e recuperação de amostras para análise pós-estimulação e pode ser dimensionado para acomodar outros sistemas biológicos multicelulares.
Abstract
Durante a embriogênese, o movimento celular coordenado gera forças mecânicas que regulam a expressão e a atividade gênica. Para estudar esse processo, ferramentas como aspiração ou compressão de deslizamento de cobertura têm sido usadas para estimular mecanicamente embriões inteiros. Essas abordagens limitam o projeto experimental, pois são imprecisas, exigem manuseio manual e podem processar apenas alguns embriões simultaneamente. Os sistemas microfluídicos têm um grande potencial para automatizar essas tarefas experimentais e, ao mesmo tempo, aumentar a produtividade e a precisão. Este artigo descreve um sistema microfluídico desenvolvido para comprimir com precisão embriões inteiros de Drosophila melanogaster (mosca da fruta). Este sistema possui microcanais com paredes laterais deformáveis acionadas pneumaticamente e permite o alinhamento embrionário, imobilização, compressão e coleta pós-estimulação. Ao paralelizar esses microcanais em sete faixas, padrões de compressão constantes ou dinâmicos podem ser aplicados a centenas de embriões de Drosophila simultaneamente. A fabricação deste sistema em uma tampa de vidro facilita a estimulação mecânica simultânea e a imagem de amostras com microscópios de alta resolução. Além disso, a utilização de materiais biocompatíveis, como o PDMS, e a capacidade de fluir fluido através do sistema tornam este dispositivo capaz de experimentos de longo prazo com amostras dependentes de mídia. Essa abordagem também elimina a necessidade de montagem manual que tensiona mecanicamente as amostras. Além disso, a capacidade de coletar rapidamente amostras dos microcanais permite análises pós-estimulação, incluindo ensaios -ômicos que exigem um grande número de amostras inatingíveis usando abordagens tradicionais de estimulação mecânica. A geometria deste sistema é facilmente escalável para diferentes sistemas biológicos, permitindo que vários campos se beneficiem das características funcionais aqui descritas, incluindo alto rendimento da amostra, estimulação mecânica ou imobilização e alinhamento automatizado.
Introduction
Os sistemas vivos experimentam e respondem constantemente a várias entradas mecânicas ao longo de suas vidas1. A mecanotransdução tem sido associada a muitas doenças, incluindo distúrbios do desenvolvimento, perda muscular e óssea e neuropatologias através de vias de sinalização direta ou indiretamente afetadas pelo ambiente mecânico2. No entanto, os genes e proteínas regulados pela estimulação mecânica3 nas vias de sinalização mecanossensíveis4 permanecem em grande parte desconhecidos5, impedindo a elucidação dos mecanismos de regulação mecânica e a identificação de alvos moleculares para doenças associadas à mecanotransdução patológica 6,7 . Um fator limitante na projeção de estudos de mecanobiologia nos processos fisiológicos relacionados é o uso de células individuais com placas de cultura convencionais em vez de organismos multicelulares intactos. Organismos modelo, como a Drosophila melanogaster (mosca da fruta), têm contribuído sobremaneira para a compreensão dos genes, vias de sinalização e proteínas envolvidas no desenvolvimento animal 8,9,10. No entanto, o uso de Drosophila e outros organismos modelo multicelulares na pesquisa em mecanobiologia tem sido dificultado por desafios com ferramentas experimentais. Técnicas convencionais para preparar, classificar, fazer imagens ou aplicar vários estímulos requerem principalmente manipulação manual; essas abordagens são demoradas, exigem experiência, introduzem variabilidade e limitam o desenho experimental e o tamanho da amostra11. Os recentes avanços microtecnológicos são um grande recurso para permitir novos ensaios biológicos com rendimento muito alto e parâmetros experimentais altamente controlados12,13,14.
Este artigo descreve o desenvolvimento de um dispositivo microfluídico aprimorado para alinhar, imobilizar e aplicar com precisão estimulação mecânica na forma de compressão uniaxial a centenas de embriões inteiros de Drosophila 15 (Figura 1). A integração do sistema microfluídico com uma tampa de vidro permitiu imagens confocais de alta resolução das amostras durante a estimulação. O dispositivo microfluídico também possibilitou a coleta rápida dos embriões após a estimulação para ensaios de corrida -ômica (Figura 2). Explicações sobre as considerações de projeto deste dispositivo, bem como a fabricação usando litografia suave e caracterização experimental, são descritas aqui. Uma vez que a fabricação de um molde de wafer de silício de tal dispositivo requer um revestimento uniforme de fotorresistência espessa (espessura >200 μm) em grandes áreas com trincheiras de alta proporção (AR) (AR >5), esse método modificou consideravelmente o protocolo tradicional de fabricação de moldes fotolitográficos. Desta forma, este método facilitou o manuseio, adesão, revestimento, padronização e desenvolvimento do fotorresistente. Além disso, possíveis armadilhas e suas soluções são discutidas. Por fim, a versatilidade dessa estratégia de projeto e fabricação foi demonstrada por meio de outros sistemas multicelulares, como câmaras de ovos de Drosophila e organoides cerebrais16.
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Protocol
1. Preparação do molde de bolacha de silício
- Limpe a bolacha de silício (ver Tabela de Materiais) primeiro com acetona e depois com álcool isopropílico (IPA).
- Colocar a bolacha de silício sobre uma placa quente de 250 °C durante 30 minutos para desidratação (figura 3A).
- Revestir a bolacha de silício com hexametildisilazano (HDMS) num forno de vapor prime (ver Tabela de Materiais) (temperatura do processo: 150 °C, pressão do processo: 2 Torr, tempo do processo: 5 min, volume do HDMS: 5 μL) (Figura 3B).
- Coloque uma garrafa de fotorresistente SU-8 2100 (ver Tabela de Materiais) em um forno a 60 °C por 15 minutos para reduzir sua viscosidade.
NOTA: Após o aquecimento no forno, a viscosidade do fotorresistente diminui. Fotorresistentes com viscosidade reduzida podem ser manuseados com mais facilidade e podem ser despejados com mais precisão em cima da bolacha. - Colocar a bolacha de silício sobre uma placa quente de 60 °C e deitar 1 ml do fotorresistente aquecido por cada polegada da bolacha até que o fotorresistente cubra a maior parte da superfície (Figura 3C).
- Transfira a bolacha de silício revestida com fotorresistência para um revestidor de rotação (consulte Tabela de materiais).
- Aplique o pré-spin primeiro a 250 rpm por 30 s e depois a 350 rpm por mais 30 s, ambos com aceleração de 100 rpm/s (Figura 3D).
- Remova o excesso de fotorresistência das bordas da bolacha de silício usando um cotonete de sala limpa.
- Aplique um giro primeiro a 500 rpm por 15 s com aceleração de 100 rpm/s e depois a 1450 rpm por 30 s com aceleração de 300 rpm/s (Figura 3E).
- Remova o talão de borda com um cotonete de sala limpa.
- Coloque a bolacha de silício sobre uma placa quente de 50 °C e pulverize acetona na bolacha para remover imperfeições e promover um revestimento uniforme (Figura 3F).
- Aumentar lentamente a temperatura da placa quente para 95 °C à velocidade de 2 °C/min.
- Asse suavemente a bolacha de silício a 95 °C durante 50 minutos (Figura 3G).
- Arrefecer lentamente a placa quente até à temperatura ambiente a uma taxa de 2°C/min.
- Coloque a bolacha de silício em um alinhador de máscara (consulte Tabela de materiais) e coloque a fotomáscara em cima dela (consulte a Figura 1 Suplementar para a geometria da fotomáscara).
- Expor a bolacha de silício a 350 mJ/cm 2 de luz UV (35 mW/cm2 por 10 s) através da fotomáscara usando o alinhador de máscara de contato (Figura 3H).
- Aplicar cozimentos consecutivos pós-exposição na bolacha de silício, colocando-a numa placa quente a 50 °C durante 5 minutos, a 65 °C durante mais 5 minutos e, por último, a 80 °C durante mais 20 minutos (Figura 3I).
- Arrefecer lentamente a bolacha de silício até à temperatura ambiente a uma velocidade de 2 °C/min.
- Coloque um agitador magnético com um diâmetro ligeiramente menor do que a bolacha de silício em um béquer. Vire a bolacha de silicone de cabeça para baixo e coloque-a em cima do béquer.
- Coloque o copo dentro de outro copo maior e encha o copo maior com uma nova solução de revelador (consulte Tabela de materiais). Deixe a bolacha de silício submersa na incorporadora por 30 minutos com o agitador ligado (Figura 3J).
- Transfira o wafer de silício para um sonicator de banho ultrassônico preenchido com o revelador fresco por 1 h a 40 kHz (Figura 3K).
- Lavar bem a bolacha de silício com uma solução IPA para obter o molde final da bolacha de silício (Figura 3L).
2. Fabricação do chip microfluídico
- Coloque o molde de bolacha de silício em um exsicador juntamente com 10 gotas (~ 500 μL) de Tricloro (1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano (PFOCTS, ver Tabela de Materiais) em um pequeno barco de pesagem nas proximidades.
- Ligue o exsicador a uma bomba de vácuo a aproximadamente 200 Torr durante 30 minutos.
- Desligue a válvula exsicadora e desconecte a bomba de vácuo durante a noite para o revestimento PFOCTS.
- Preparar a solução de polidimetilsiloxano (PDMS) pré-curada misturando a base PDMS com o agente de cura (ver Tabela de Materiais) numa proporção de 10:1.
- Desgaseifique a mistura colocando-a numa centrífuga (500 x g durante 5 min à temperatura ambiente).
NOTA: Esta centrifugação permite que as bolhas migrem para a superfície superior e, consequentemente, sejam removidas em um curto período de tempo. - Despeje a solução PDMS desgaseificada no molde de wafer de silício.
- Desgaseifique-o novamente para remover as bolhas de ar presas na superfície do molde.
- Curar o PDMS em forno a 60 °C por 1 h e 50 min (Figura 3M).
- Use um bisturi para cortar as bordas da região do PDMS curada correspondente à geometria do chip microfluídico (Figura 3N).
- Descasque a parte do PDMS e coloque-a de cabeça para baixo em um tapete de corte.
- Use uma navalha para cortar a peça do PDMS em sua forma final (Figura 3O).
- Perfure os orifícios de entrada e saída no PDMS usando um punch de biópsia (ver Tabela de materiais) ou uma agulha com uma ponta contundente (Figura 3P).
- Para o orifício de entrada do embrião, use um punção de 4 mm de diâmetro.
- Para os orifícios de saída do embrião, use um punção de 1,3 mm de diâmetro.
- Para o orifício de entrada de gás, use um punção de 2 mm.
- Use um pedaço de fita adesiva para remover qualquer partícula que possa permanecer na superfície padronizada do PDMS.
- Limpe uma lâmina de vidro retangular de 24 mm x 60 mm primeiro com acetona e depois com IPA.
- Seque a superfície de vidro com uma pistola de ar conectada a uma fonte de ar filtrada.
- Aplique um cozimento de desidratação na lâmina de vidro, colocando-a em uma placa quente de 250 °C por 2 h (Figura 3Q).
- Cubra a lâmina de vidro com um copo para evitar a contaminação da superfície.
- Coloque o PDMS, com o seu lado padronizado para cima, e o vidro desidratado deslize para um limpador de plasma (ver Tabela de Materiais).
- Trate o PDMS e a lâmina de vidro com plasma de oxigênio a 18 W por 30 s.
- Coloque o PDMS na lâmina de vidro com sua superfície padronizada voltada para a lâmina de vidro para selar os microcanais via colagem covalente (Figura 3R).
- Use uma pinça para empurrar suavemente a parte do PDMS contra a lâmina de vidro para garantir o contato conformacional completo.
- Armazene o chip microfluídico completo à temperatura ambiente durante a noite para permitir que a ligação atinja sua resistência final.
3. Preparação dos embriões da mosca da fruta
- Permita que as moscas adultas Oregon-R coloquem ovos em placas de ágar suco de maçã (1,5% de ágar, 25% de suco de maçã, 2,5% de sacarose) e colete as placas no momento de desenvolvimento desejado após a postura dos ovos para o experimento dado.
NOTA: Para os presentes experimentos, as placas foram coletadas aos 140 min para preparação e classificação dos embriões no estádio de celularização17. - Inundar o ágar com lavagem de ovos embrionários (0,12 M NaCl, 0,04% Triton-X 100) e agitar suavemente os embriões com um pincel para desalojá-los do ágar.
- Transfira os embriões para uma solução de água sanitária a 50% por 90 s, mexendo ocasionalmente. Coe os embriões através de uma peneira de tecido e lave bem a solução de água sanitária com água.
- Transfira os embriões para uma placa de Petri de vidro de 90 mm com lavagem de ovos embrionária suficiente para cobrir totalmente os embriões.
- Examine os embriões com transiluminação em um microscópio de dissecação e selecione embriões do estágio de desenvolvimento desejado para carregamento no dispositivo microfluídico.
NOTA: Nesta aplicação, foram selecionados embriões em estágio de celularização. As descrições detalhadas de como garantir a seleção adequada do estágio de desenvolvimento podem ser encontradas no manual de laboratório da Drosophila17.
4. Aplicação de estimulação mecânica a embriões de moscas da fruta usando o chip microfluídico
- Prepare todos os sete microcanais embrionários preenchendo-os com IPA filtrada de 0,4 μm através da porta de entrada principal do embrião.
- Substitua o IPA por 0,4 μm de água filtrada deionizada (DI).
- Substitua a água DI por uma solução de lavagem de ovos embrionários.
- Colete aproximadamente 100 embriões pré-selecionados da placa de Petri de vidro usando uma pipeta de vidro.
- Pipetar os embriões para a porta de entrada do embrião (Figura 4A).
- Aplique uma pressão negativa de aproximadamente 3 PSI (ou seja, vácuo) na entrada de gás usando uma bomba de vácuo portátil para abrir os microcanais embrionários.
- Incline o chip microfluídico para baixo para que os embriões se alinhem e se instalem automaticamente nos microcanais embrionários (Figura 4B).
- Se as entradas do microcanal do embrião ficarem entupidas por vários embriões que entram simultaneamente, incline o chip microfluídico para cima e depois para baixo novamente para limpar o entupimento.
- Com base no rendimento necessário, introduza até 300 embriões nos microcanais embrionários.
- Uma vez que o carregamento do embrião esteja concluído, remova o vácuo para imobilizar os embriões.
- Incline o chip microfluídico de volta à posição horizontal (Figura 4C).
- Conecte uma fonte de pressão positiva portátil (consulte Tabela de materiais) com um manômetro à entrada de gás para aplicar 3 PSI de compressão (Figura 4D).
- Verifique continuamente o manômetro para garantir que um nível de compressão consistente seja aplicado.
- Se experimentos de imagem ao vivo forem conduzidos nos embriões estimulados mecanicamente, coloque o chip microfluídico em um suporte de lâmina de vidro de estágio de microscópio padrão com a entrada de gás conectada à fonte de pressão.
- Uma vez que o experimento de compressão é concluído, os embriões podem ser coletados para análise a jusante. Para fazer isso, primeiro, aplique o vácuo na entrada de gás para liberar os embriões.
- Em seguida, incline o chip microfluídico para cima para que os embriões se movam em direção à porta de introdução do embrião (Figura 4E).
- Recolha os embriões do chip microfluídico utilizando uma pipeta de vidro.
NOTA: Após a coleta, os efeitos da compressão no desenvolvimento embrionário e na viabilidade podem ser investigados pelo crescimento das moscas da fruta até a idade adulta. A capacidade de processamento de alto rendimento do dispositivo microfluídico também permite que embriões sejam usados em ensaios baseados em ômica a jusante que exigem um grande número de amostras (Figura 2).
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Representative Results
O sistema microfluídico é dividido em dois subcompartimentos separados por paredes laterais PDMS deformáveis. O primeiro compartimento é o sistema líquido onde os embriões de Drosophila são introduzidos, automaticamente alinhados, alinhados e comprimidos. O segundo compartimento é um sistema de gás onde a pressão do gás em ambos os lados dos canais de compressão é controlada através de microcanais sem saída para controlar com precisão a largura efetiva dos canais de compressão. O dispositivo microfluídico é selado com uma lâmina de vidro na parte inferior, o que permite imagens ao vivo de alta resolução das amostras (Figura 2 Suplementar) para as dimensões relevantes do dispositivo microfluídico.
Organismos multicelulares, como embriões de Drosophila , são selecionados no estágio de desenvolvimento embrionário desejado. No caso dos embriões de Drosophila , todos os estágios de desenvolvimento são igualmente compatíveis com essa abordagem, uma vez que o tamanho do embrião não muda até que eles eclodam. As amostras selecionadas são introduzidas no dispositivo microfluídico através da grande entrada (ou seja, 4 mm de diâmetro) usando uma micropipeta de vidro. O dispositivo é então inclinado para baixo para permitir que os embriões fluam para os sete canais de compressão organizados de forma paralela. O átrio de estreitamento que conecta a entrada do embrião ao canal de compressão garante o alinhamento automático dos embriões antes que eles atinjam a entrada dos canais de compressão. O vácuo aplicado à entrada de gás desvia as paredes laterais deformáveis para fora, aumentando a largura efetiva do microcanal e permitindo que os embriões entrem nos canais de compressão sequencialmente. Os sete canais de compressão têm 22 mm de comprimento e, em paralelo, podem acomodar até 300 embriões de Drosophila em uma única corrida. Os canais de compressão terminam em um gargalo onde a largura do microcanal diminui para um nível muito menor do que o das amostras, o que permite que o fluido flua enquanto retém os embriões. Através desta abordagem, os embriões são concentrados dentro dos canais de compressão. Após a introdução dos embriões, o vácuo na entrada de gás é removido e as paredes laterais do microcanal retornam à sua posição original e imobilizam os embriões alinhados de ambos os lados. A compressão pode ser alcançada aplicando pressão positiva na entrada de gás, o que desvia as paredes laterais deformáveis para dentro e reduz a largura efetiva do microcanal. A quantidade de compressão aplicada aos embriões pode ser regulada com precisão adaptando as dimensões dos microcanais, a espessura das paredes laterais deformáveis, o Módulo de Young do PDMS e a pressão aplicada. Após o experimento de compressão, os embriões podem ser coletados para análise a jusante, aplicando um vácuo à entrada de gás e inclinando o dispositivo microfluídico em outra direção.
Este dispositivo microfluídico foi fabricado com litografia suave18. No entanto, a fabricação de estruturas espessas com características de alta proporção usando fotorresistência ultraespessa requer grandes desvios dos protocolos definidos para a fabricação padrão (Figura 3). Juntamente com o revestimento de hexametildisilazina (HDMS), as bolachas de silício foram limpas antes do revestimento por rotação para remover resíduos orgânicos e assadas para remover a umidade da superfície. Essas etapas extras aumentaram a ligação da espessa camada fotorresistente à bolacha de silício. O fotorresistente também foi aquecido antes de derramar para diminuir a viscosidade, o que foi crucial para cobrir toda a superfície da bolacha. A espessura do revestimento fotorresistente alvo foi alcançada através de três etapas de fiação, onde cada etapa de fiação removeu gradualmente o excesso de fotorresistência sem contaminar a superfície da bolacha. Inspirada em métodos publicados anteriormente19, a acetona foi pulverizada, que é um dos solventes do fotorresistente, na bolacha de silício para eliminar imperfeições fotorresistentes e aumentar a uniformidade do revestimento. Durante as etapas consecutivas de cozimento, a temperatura foi alterada lentamente para minimizar o estresse térmico, o que poderia levar à delaminação do fotorresistente da bolacha de silício. Devido a preocupações semelhantes, a temperatura de cozimento foi diminuída enquanto aumentava sua duração. Uma das etapas mais desafiadoras na fabricação fotolitográfica de trincheiras de alta proporção foi a remoção do fotorresistente não curado após a exposição aos raios UV. Para maximizar a penetração da solução de desenvolvedor nas trincheiras, o wafer de silício foi virado de cabeça para baixo e continuamente misturado com a solução de desenvolvedor com um agitador. Desta forma, a nova solução de desenvolvedor poderia reagir e remover o fotorresistente não curado. Este passo foi seguido por um banho ultra-sônico onde o fotorresistente restante foi removido. Uma vez que o molde de wafer de silício foi gerado com sucesso, o processo de moldagem de réplica padrão consistiu em mistura de agentes de cura, desgaseificação, derramamento, cura, descascamento, punção e ligação a plasma para a fabricação do dispositivo microfluídico final20.
A funcionalidade do dispositivo microfluídico foi determinada experimentalmente carregando embriões de Drosophila nos canais de compressão e aplicando pressão positiva nos canais de gás. Medições da largura decrescente dos embriões ao microscópio (Figura 5A) demonstram como a pressão do gás pode ser usada para obter um nível de compressão alvo (Figura 5B). Imagens de lapso de tempo de embriões alinhados submetidos à compressão também demonstram a compatibilidade deste sistema com a microscopia confocal.
Figura 1: Projeto e função do dispositivo microfluídico. O dispositivo microfluídico consiste em sete microcanais de compressão paralelos que podem testar até 300 embriões inteiros de Drosophila simultaneamente. (A) Os embriões foram introduzidos no dispositivo através da entrada principal do embrião, e eles se alinharam ao longo do eixo posterior-anterior automaticamente à medida que entravam nos microcanais. (B) Os embriões estavam se movendo livremente quando a pressão negativa foi aplicada através da entrada de gás, pois isso desviou as paredes laterais do microcanal deformável para fora. Isso permitiu sua carga, bem como o descarregamento como uma única faixa. Quando a pressão negativa foi removida, os embriões foram imobilizados nos microcanais. Quando a pressão positiva foi aplicada, as paredes laterais do microcanal comprimiram os embriões desviando-se para dentro. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fluxo de processo de experimentos de compressão microfluídica para estudos de mecanobiologia. (A) O dispositivo de mecanoestimulação microfluídica de alto rendimento é feito de PDMS e uma lâmina de vidro para processar centenas de amostras biológicas multicelulares. (B) O dispositivo é adaptado para trabalhar com diferentes sistemas multicelulares, como câmaras de ovos de Drosophila, embriões de Drosophila ou organoides cerebrais. Este dispositivo pode aplicar padrões de compressão constantes ou dinâmicos aos biossistemas. (C) Os sistemas podem ser fotografados com um microscópio confocal ao longo do tempo à medida que estão sendo comprimidos. Os níveis de expressão e localização de proteínas marcadas fluorescentemente em resposta à compressão podem ser analisados. Após a coleta, os sistemas podem ser analisados para testes pós-estimulação e imagem. A capacidade de processamento de alto rendimento do dispositivo microfluídico também permite que os sistemas sejam lisados e usados em ensaios biológicos baseados em ômica que exigem um grande número de amostras, como mostrado na figura com um exemplo de imagem de eletroforese em gel diferencial de 2 dimensões. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Processo de fabricação do molde de wafer de silício com fotorresistência espessa e trincheiras de alta proporção. (A,B) O processo geral de fabricação começou com a preparação da bolacha de silício para revestimento fotorresistente. (C-G) Um revestimento fotorresistente espesso foi uniformemente aplicado à bolacha de silício. (H,I) O fotorresistente foi padronizado com exposição UV através da fotomáscara. (J-L) O fotorresistente não curado foi removido da bolacha de silício. (M-P) A parte PDMS foi fabricada através de litografia suave. (Q,R) O dispositivo foi selado à lâmina de vidro. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: O funcionamento do dispositivo microfluídico . (A) Primeiro, os embriões foram pipetados para a entrada principal do embrião. (B) Em segundo lugar, a pressão negativa foi aplicada à entrada de gás, e o dispositivo microfluídico foi inclinado para baixo para permitir que os embriões se alinhassem e fossem carregados nos microcanais. (C) Em terceiro lugar, a pressão negativa foi removida para imobilizar os embriões. (D) Em quarto lugar, pressão positiva foi aplicada aos canais de gás para comprimir os embriões. (E) Por fim, os embriões foram coletados do dispositivo microfluídico voltando à pressão negativa e inclinando o dispositivo microfluídico para cima. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Medição experimental do nível de compressão embrionária . (A) Embriões representativos dentro do dispositivo microfluídico sob diferentes níveis de pressão de gás. Embora os embriões não experimentem compressão significativa sob vácuo ou em estados de pressão neural, eles são comprimidos quando a pressão positiva é aplicada. (B) A quantidade de deformação compressiva uniaxial aplicada aos embriões em diferentes níveis de pressão de gás (barras de erro representam desvio padrão). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Compressão de organoides cerebrais em um dispositivo microfluídico projetado e fabricado seguindo a mesma estratégia. (A) A compressão dos organoides cerebrais em níveis crescentes à medida que a pressão do gás é aumentada. (B) A largura dos organoides cerebrais dentro dos microcanais em diferentes níveis de pressão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 1 suplementar: Vista superior da fotomáscara usada na fabricação fotolitográfica do molde de bolacha de silício. Existem cinco geometrias idênticas de dispositivos microfluídicos localizadas dentro da área de 4 em diâmetro. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 2 suplementar: Vista superior do dispositivo microfluídico utilizado neste estudo com as dimensões relevantes. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O artigo descreve o desenvolvimento de um dispositivo microfluídico para alinhar, imobilizar e aplicar com precisão estimulação mecânica a centenas de embriões inteiros de Drosophila . A integração do sistema microfluídico com uma fina tampa de vidro permitiu a imagem de embriões com microscopia confocal de alta resolução durante a estimulação. O dispositivo microfluídico também permitiu a coleta dos embriões logo após a estimulação para ensaios biológicos a jusante. As considerações de design, o método de fabricação e a caracterização deste dispositivo foram descritos em detalhes. O protocolo de fabricação de molde de wafer de silício permitiu o revestimento espesso uniforme do fotorresistente com trincheiras de alta proporção.
Para que essa abordagem de fabricação seja bem-sucedida, é importante diminuir a temperatura das etapas de cozimento e minimizar as taxas de aquecimento e resfriamento da bolacha de silício depois de ser revestida com fotorresistente. Se isso não for feito corretamente, o revestimento fotorresistente pode facilmente delaminar e alterar a geometria do molde. Uma vez que o molde de wafer de silício é fabricado com sucesso, ele pode ser copiado em materiais mais duráveis para evitar danificar o molde original durante etapas consecutivas de moldagem de réplicas PDMS, que também contêm ciclos de aquecimento e resfriamento21. A fabricação do dispositivo microfluídico PDMS através da moldagem de réplicas depende do peeling bem-sucedido de estruturas de parede lateral de alta proporção do molde. Para que esta etapa de fabricação seja confiável, é fundamental revestir adequadamente a superfície da bolacha de silício com um agente silanizante para facilitar o peeling. O revestimento também deve ser renovado após a fabricação de aproximadamente 20 dispositivos PDMS para compensar a remoção parcial da camada de silano durante cada etapa de descascamento. Caso contrário, as paredes laterais podem ficar presas dentro do padrão fotorresistente, tornando o molde inutilizável. Como o nível de compressão aplicado às amostras é uma função das propriedades mecânicas das paredes laterais, é importante manter os parâmetros do processo de moldagem de réplicas PDMS consistentes. A proporção, a temperatura e a duração do agente de cura devem ser monitoradas de perto durante a fabricação. Além disso, como essa estratégia do dispositivo é para aplicar estimulação mecânica simultaneamente a um grande número de organismos multicelulares, sua agregação dentro dos microcanais pode levar ao entupimento. Embora esse problema não tenha sido vivenciado com os organismos aqui utilizados, se isso ocorrer, existem potenciais soluções da literatura para superar esse problema, como a utilização de soluções portadoras durante a introdução das amostras22.
Embora os embriões de Drosophila tenham sido utilizados como um organismo multicelular inteiro neste trabalho, a estratégia de projeto e fabricação aqui apresentada pode ser aplicada à estimulação mecânica de outros sistemas multicelulares, alterando as dimensões do dispositivo de acordo (Figura 2). Isso pode ser feito expandindo a largura e a altura do microcanal central para corresponder às dos sistemas multicelulares. Através desta abordagem, as amostras podem entrar nos microcanais e ser igualmente comprimidas, desviando as paredes laterais deformáveis com pressão pneumática positiva. Para demonstrar essa abordagem, dispositivos semelhantes foram fabricados para câmaras de ovos de Drosophila , bem como organoides cerebrais. Esses sistemas permitiram a compressão mecânica precisa desses sistemas biológicos semelhantes aos experimentos embrionários de Drosophila (Figura 6). Além disso, uma vez que esta abordagem permite o reabastecimento dos meios em torno das amostras imobilizadas, pode ser muito útil para experimentos de estimulação química que exigem troca rápida de mídia sem perturbar as amostras. No geral, essa abordagem versátil combina a precisão e os recursos de automação de alto rendimento dos sistemas microfluídicos, ao mesmo tempo em que permite novos estudos de mecanobiologia em vários sistemas multicelulares, como pequenas amostras de tecido, organoides, embriões e ovócitos.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros nos produtos descritos neste manuscrito e não têm mais nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation (CMMI-1946456), pelo Escritório de Pesquisa Científica da Força Aérea (FA9550-18-1-0262) e pelo Instituto Nacional de Saúde (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
References
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