Summary
Het huidige protocol beschrijft het ontwerp, de fabricage en de karakterisering van een microfluïdisch systeem dat in staat is om honderden Drosophila melanogaster-embryo's uit te lijnen, te immobiliseren en nauwkeurig te comprimeren met minimale tussenkomst van de gebruiker. Dit systeem maakt beeldvorming met hoge resolutie en herstel van monsters mogelijk voor poststimulatieanalyse en kan worden geschaald om plaats te bieden aan andere meercellige biologische systemen.
Abstract
Tijdens embryogenese genereert gecoördineerde celbeweging mechanische krachten die genexpressie en -activiteit reguleren. Om dit proces te bestuderen, zijn hulpmiddelen zoals aspiratie of coverslipcompressie gebruikt om hele embryo's mechanisch te stimuleren. Deze benaderingen beperken experimenteel ontwerp omdat ze onnauwkeurig zijn, handmatige hantering vereisen en slechts een paar embryo's tegelijkertijd kunnen verwerken. Microfluïdische systemen hebben een groot potentieel voor het automatiseren van dergelijke experimentele taken terwijl ze de doorvoer en precisie verhogen. Dit artikel beschrijft een microfluïdisch systeem dat is ontwikkeld om hele Drosophila melanogaster (fruitvlieg) embryo's nauwkeurig te comprimeren. Dit systeem beschikt over microkanalen met pneumatisch bediende vervormbare zijwanden en maakt embryo-uitlijning, immobilisatie, compressie en verzameling na stimulatie mogelijk. Door deze microkanalen in zeven rijstroken te parallelliseren, kunnen stabiele of dynamische compressiepatronen tegelijkertijd op honderden Drosophila-embryo's worden toegepast. Het fabriceren van dit systeem op een glazen coverslip vergemakkelijkt de gelijktijdige mechanische stimulatie en beeldvorming van monsters met microscopen met hoge resolutie. Bovendien maken het gebruik van biocompatibele materialen, zoals PDMS, en de mogelijkheid om vloeistof door het systeem te laten stromen, dit apparaat in staat tot langdurige experimenten met media-afhankelijke monsters. Deze aanpak elimineert ook de vereiste voor handmatige montage die monsters mechanisch belast. Bovendien maakt de mogelijkheid om snel monsters uit de microkanalen te verzamelen poststimulatieanalyses mogelijk, inclusief -omics-assays die grote steekproefaantallen vereisen die onbereikbaar zijn met behulp van traditionele mechanische stimulatiebenaderingen. De geometrie van dit systeem is gemakkelijk schaalbaar naar verschillende biologische systemen, waardoor tal van velden kunnen profiteren van de hierin beschreven functionele kenmerken, waaronder een hoge monsterdoorvoer, mechanische stimulatie of immobilisatie en geautomatiseerde uitlijning.
Introduction
Levende systemen ervaren en reageren voortdurend op verschillende mechanische inputs gedurende hun hele levensduur1. Mechanotransductie is in verband gebracht met vele ziekten, waaronder ontwikkelingsstoornissen, spier- en botverlies en neuropathologieën via signaalroutes die direct of indirect worden beïnvloed door de mechanische omgeving2. De genen en eiwitten die worden gereguleerd door mechanische stimulatie3 in de mechanosensitive signaling pathways4 blijven echter grotendeels onbekend5, waardoor de opheldering van de mechanische regulatiemechanismen en de identificatie van moleculaire doelwitten voor ziekten geassocieerd met pathologische mechanotransductie wordt voorkomen 6,7 . Een beperkende factor bij het projecteren van mechanobiologische studies op de gerelateerde fysiologische processen is het gebruik van individuele cellen met conventionele kweekschalen in plaats van intacte meercellige organismen. Modelorganismen, zoals Drosophila melanogaster (fruitvlieg), hebben sterk bijgedragen aan het begrijpen van de genen, signaalroutes en eiwitten die betrokken zijn bij de ontwikkeling van dieren 8,9,10. Niettemin is het gebruik van Drosophila en andere meercellige modelorganismen in mechanobiologisch onderzoek belemmerd door uitdagingen met experimentele hulpmiddelen. Conventionele technieken voor het voorbereiden, sorteren, in beeld brengen of toepassen van verschillende stimuli vereisen meestal handmatige manipulatie; deze benaderingen zijn tijdrovend, vereisen expertise, introduceren variabiliteit en beperken het experimentele ontwerp en de steekproefgrootte11. Recente microtechnologische ontwikkelingen zijn een geweldige bron voor het mogelijk maken van nieuwe biologische testen met een zeer hoge doorvoer en zeer gecontroleerde experimentele parameters 12,13,14.
Dit artikel beschrijft de ontwikkeling van een verbeterd microfluïdisch apparaat om mechanische stimulatie in de vorm van uniaxiale compressie uit te lijnen, te immobiliseren en nauwkeurig toe te passen op honderden hele Drosophila-embryo's 15 (figuur 1). Integratie van het microfluïdische systeem met een glazen afdekplaat maakte een hoge resolutie confocale beeldvorming van de monsters tijdens de stimulatie mogelijk. Het microfluïdische apparaat maakte ook een snelle verzameling van de embryo's mogelijk na de stimulatie voor het uitvoeren van -omics-testen (figuur 2). Uitleg over de ontwerpoverwegingen van dit apparaat, evenals de fabricage met behulp van zachte lithografie en experimentele karakterisering, worden hierin beschreven. Omdat het maken van een siliciumwafermal van een dergelijk apparaat een uniforme coating van dikke fotoresist (dikte > 200 μm) vereist over grote oppervlakken met hoge beeldverhouding (AR) sleuven (AR >5), heeft deze methode het traditionele fotolithografische matrijsfabricageprotocol aanzienlijk gewijzigd. Op deze manier vergemakkelijkte deze methode de hantering, hechting, coating, patroonvorming en ontwikkeling van de fotoresist. Daarnaast worden mogelijke valkuilen en hun oplossingen besproken. Ten slotte werd de veelzijdigheid van deze ontwerp- en fabricagestrategie aangetoond met behulp van andere meercellige systemen zoals Drosophila-eikamers en hersenorganoïden16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de silicium wafer mal
- Reinig de siliciumwafer (zie Materiaaltabel) eerst met aceton en daarna met isopropylalcohol (IPA).
- Plaats de siliciumwafer gedurende 30 minuten op een hete plaat van 250 °C voor dehydratiebakken (figuur 3A).
- Bekleed de siliciumwafer met hexamethyldisilazane (HDMS) in een dampprimeoven (zie Materiaaltabel) (procestemperatuur: 150 °C, procesdruk: 2 Torr, procestijd: 5 min, HDMS-volume: 5 μL) (figuur 3B).
- Plaats een fles SU-8 2100 fotoresist (zie Materiaaltabel) gedurende 15 minuten in een oven van 60 °C om de viscositeit te verminderen.
OPMERKING: Bij verwarming in de oven neemt de viscositeit van de fotoresist af. Fotoresisten met verlaagde viscositeit kunnen gemakkelijker worden gehanteerd en kunnen nauwkeuriger op de wafer worden gegoten. - Plaats de siliciumwafer op een hete plaat van 60 °C en giet 1 ml van de verwarmde fotoresist voor elke inch van de wafer totdat de fotoresist het grootste deel van het oppervlak bedekt (figuur 3C).
- Breng de fotoresist-gecoate silicium wafer over op een spin coater (zie Materiaaltabel).
- Pas eerst pre-spin toe bij 250 tpm gedurende 30 s en vervolgens bij 350 tpm voor nog eens 30 s, beide met 100 tpm / s versnelling (figuur 3D).
- Verwijder de overtollige fotoresist van de randen van de siliciumwafer met behulp van een cleanroom-wattenstaafje.
- Pas eerst een draai toe bij 500 tpm gedurende 15 s met 100 tpm / s acceleratie en vervolgens bij 1450 tpm voor 30 s met 300 tpm / s versnelling (figuur 3E).
- Verwijder de randkraal met een cleanroomdoekje.
- Plaats de siliciumwafer op een hete plaat van 50 °C en spuit aceton op de wafer om onvolkomenheden te verwijderen en een uniforme coating te bevorderen (figuur 3F).
- Verhoog langzaam de temperatuur van de kookplaat tot 95 °C met een snelheid van 2 °C/min.
- Bak de siliciumwafer zacht op 95 °C gedurende 50 minuten (figuur 3G).
- Koel de hete plaat langzaam af tot kamertemperatuur met een snelheid van 2°C/min.
- Plaats de siliciumwafer op een maskeruitlijner (zie Materiaaltabel) en plaats het fotomasker erop (zie Aanvullende figuur 1 voor de geometrie van het fotomasker).
- Stel de siliciumwafer bloot aan 350 mJ/cm2 UV-licht (35 mW/cm2 gedurende 10 s) door het fotomasker met behulp van de contactmasker aligner (figuur 3H).
- Breng opeenvolgende baksels na blootstelling aan op de siliciumwafer door de wafer gedurende 5 minuten op een hete plaat bij 50 °C, nog eens 5 minuten bij 65 °C en ten slotte nog eens 20 minuten bij 80 °C (figuur 3I) te plaatsen.
- Koel de siliciumwafer langzaam af tot kamertemperatuur met een snelheid van 2 °C/min.
- Plaats een magneetroerder met een iets kleinere diameter dan de siliciumwafer in een bekerglas. Draai de siliconen wafer ondersteboven en leg deze bovenop het bekerglas.
- Plaats het bekerglas in een ander groter bekerglas en vul het grotere bekerglas met een nieuwe ontwikkelaarsoplossing (zie Materiaaltabel). Laat de siliciumwafer 30 minuten ondergedompeld in de ontwikkelaar met de roerder ingeschakeld (figuur 3J).
- Breng de siliciumwafer over in een ultrasone badsonicator gevuld met de verse ontwikkelaar gedurende 1 uur bij 40 kHz (figuur 3K).
- Was de siliciumwafer grondig met een IPA-oplossing om de uiteindelijke siliciumwafervorm te verkrijgen (figuur 3L).
2. Fabricage van de microfluïdische chip
- Plaats de siliciumwafervorm in een exsiccator samen met 10 druppels (~ 500 μL) trichlooriso (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silaan (PFOCTS, zie materiaaltabel) in een kleine weegboot in de buurt.
- Sluit de exsiccator gedurende 30 minuten aan op een vacuümpomp van ongeveer 200 Torr.
- Schakel de exsiccatorklep uit en koppel de vacuümpomp 's nachts los voor PFOCTS-coating.
- Bereid de voorgeharde polydimethylsiloxaanoplossing (PDMS) door de PDMS-basis te mengen met het uithardingsmiddel (zie Materiaaltabel) in een verhouding van 10:1.
- Ontgas het mengsel door het in een centrifuge te plaatsen (500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur).
OPMERKING: Deze centrifugatie zorgt ervoor dat bubbels naar het bovenoppervlak migreren en bijgevolg in korte tijd worden verwijderd. - Giet de ontgaste PDMS-oplossing op de siliciumwafervorm.
- Ontgas het opnieuw om de luchtbellen te verwijderen die op het schimmeloppervlak zijn opgesloten.
- Laat het PDMS uitharden in een oven van 60 °C gedurende 1 uur en 50 minuten (figuur 3M).
- Gebruik een scalpel om de randen van het uitgeharde PDMS-gebied te snijden dat overeenkomt met de microfluïdische chipgeometrie (figuur 3N).
- Pel het PDMS-gedeelte en leg het ondersteboven op een snijmat.
- Gebruik een scheermes om het PDMS-deel in zijn uiteindelijke vorm te snijden (figuur 3O).
- Pons de inlaat- en uitlaatgaten op PDMS met behulp van een biopsiepons (zie Materiaaltabel) of een naald met een stompe punt (figuur 3P).
- Gebruik voor het embryo-inlaatgat een pons met een diameter van 4 mm.
- Gebruik voor de embryo-uitlaatgaten een pons met een diameter van 1,3 mm.
- Gebruik voor het gasinlaatgat een pons van 2 mm.
- Gebruik een stuk plakband om eventuele deeltjes te verwijderen die op het patroonoppervlak van het PDMS kunnen achterblijven.
- Reinig een rechthoekige glasplaat van 24 mm x 60 mm eerst met aceton en vervolgens met IPA.
- Droog het glazen oppervlak met een luchtpistool dat is aangesloten op een gefilterde luchtbron.
- Breng een dehydratiebak aan op de glasplaat door deze gedurende 2 uur op een hete plaat van 250 °C te plaatsen (figuur 3Q).
- Bedek de glasplaat met een bekerglas om oppervlakteverontreiniging te voorkomen.
- Plaats het PDMS, met de patroonzijde naar boven, en het gedehydrateerde glas glijdt in een plasmareiniger (zie Materiaaltabel).
- Behandel het PDMS en de glasschuif met zuurstofplasma bij 18 W gedurende 30 s.
- Plaats het PDMS op de glasplaat met het patroonoppervlak naar de glasschuif gericht om de microkanalen af te dichten via covalente binding (figuur 3R).
- Gebruik een pincet om het PDMS-gedeelte voorzichtig tegen de glasschuif te duwen om volledig conformatiecontact te garanderen.
- Bewaar de voltooide microfluïdische chip 's nachts bij kamertemperatuur om de binding zijn uiteindelijke sterkte te laten bereiken.
3. Bereiding van de fruitvliegembryo's
- Laat Oregon-R volwassen vliegen eieren leggen op appelsap agarplaten (1,5% agar, 25% appelsap, 2,5% sucrose) en verzamel de platen op de gewenste ontwikkelingstijd na het leggen van eieren voor het gegeven experiment.
OPMERKING: Voor de huidige experimenten werden de platen verzameld na 140 minuten om embryo's voor te bereiden en te sorteren in het cellularisatiestadium17. - Overgiet de agar met embryo-eiwassing (0,12 M NaCl, 0,04% Triton-X 100) en roer de embryo's voorzichtig met een kwast om ze los te maken van de agar.
- Breng de embryo's gedurende 90 s over op een 50% bleekoplossing, af en toe roerend. Zeef de embryo's door een weefselzeef en spoel de bleekoplossing grondig weg met water.
- Breng de embryo's over in een glazen petrischaaltje van 90 mm met voldoende embryo-eicelwas om de embryo's volledig te bedekken.
- Onderzoek de embryo's met transilluminatie op een ontleedmicroscoop en selecteer embryo's van de gewenste ontwikkelingsfase voor het laden in het microfluïdische apparaat.
OPMERKING: In deze toepassing werden embryo's in het cellularisatiestadium geselecteerd. De gedetailleerde beschrijvingen van hoe een goede selectie van de ontwikkelingsfase kan worden gegarandeerd, zijn te vinden in het laboratoriumhandboek voor Drosophila17.
4. Mechanische stimulatie toepassen op fruitvliegembryo's met behulp van de microfluïdische chip
- Primeer alle zeven embryomicrokanalen door ze te vullen met 0,4 μm gefilterde IPA door de belangrijkste embryo-inlaatpoort.
- Vervang de IPA door 0,4 μm gefilterd gedeïoniseerd (DI) water.
- Vervang het DI-water door embryo-eiwasoplossing.
- Verzamel ongeveer 100 voorgeselecteerde embryo's uit de glazen petrischaal met behulp van een glazen pipet.
- Pipetteer de embryo's in de inlaatpoort van het embryo (figuur 4A).
- Breng een negatieve druk van ongeveer 3 PSI (d.w.z. vacuüm) aan op de gasinlaat met behulp van een draagbare vacuümpomp om de microkanalen van het embryo te openen.
- Kantel de microfluïdische chip naar beneden zodat de embryo's automatisch kunnen uitlijnen en zich in de microkanalen van het embryo kunnen nestelen (figuur 4B).
- Als de embryo-microkanaalinlaten verstopt raken door meerdere embryo's die tegelijkertijd binnenkomen, kantelt u de microfluïdische chip naar boven en vervolgens weer naar beneden om de verstopping op te ruimen.
- Breng op basis van de vereiste doorvoer maar liefst 300 embryo's in de embryomicrokanalen.
- Zodra de embryolading is voltooid, verwijdert u het vacuüm om de embryo's te immobiliseren.
- Kantel de microfluïdische chip terug naar de horizontale positie (figuur 4C).
- Sluit een draagbare overdrukbron (zie materiaaltabel) met een manometer aan op de gasinlaat om 3 PSI-compressie toe te passen (figuur 4D).
- Controleer de manometer continu om ervoor te zorgen dat een consistent compressieniveau wordt toegepast.
- Als live beeldvormingsexperimenten worden uitgevoerd op de mechanisch gestimuleerde embryo's, plaatst u de microfluïdische chip op een standaard microscooptrap glazen diahouder met de gasinlaat aangesloten op de drukbron.
- Zodra het compressie-experiment is voltooid, kunnen de embryo's worden verzameld voor downstream-analyse. Om dit te doen, breng eerst het vacuüm aan op de gasinlaat om de embryo's te bevrijden.
- Kantel vervolgens de microfluïdische chip naar boven zodat de embryo's naar de introductiepoort van het embryo kunnen bewegen (figuur 4E).
- Verzamel de embryo's van de microfluïdische chip met behulp van een glazen pipet.
OPMERKING: Na verzameling kunnen de effecten van compressie op de embryonale ontwikkeling en levensvatbaarheid worden onderzocht door de fruitvliegjes tot volwassenheid te laten groeien. De verwerkingscapaciteit met hoge doorvoer van het microfluïdische apparaat maakt het ook mogelijk embryo's te gebruiken in downstream omics-gebaseerde testen waarvoor een groot aantal monsters nodig is (figuur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het microfluïdische systeem is verdeeld in twee subcompartimenten gescheiden door vervormbare PDMS-zijwanden. Het eerste compartiment is het vloeibare systeem waar Drosophila-embryo's worden geïntroduceerd, automatisch uitgelijnd, uitgelijnd en gecomprimeerd. Het tweede compartiment is een gassysteem waarbij de gasdruk aan weerszijden van de compressiekanalen wordt geregeld via doodlopende microkanalen om de effectieve breedte van de compressiekanalen nauwkeurig te regelen. Het microfluïdische apparaat is verzegeld met een glazen schuif aan de onderkant, die live beeldvorming met hoge resolutie van de monsters mogelijk maakt (aanvullende figuur 2) voor de relevante afmetingen van het microfluïdische apparaat.
Meercellige organismen zoals Drosophila embryo's worden geselecteerd in het gewenste embryonale ontwikkelingsstadium. In het geval van de Drosophila-embryo's zijn alle ontwikkelingsstadia even compatibel met deze benadering, omdat de grootte van het embryo niet verandert totdat ze uitkomen. Geselecteerde monsters worden in het microfluïdische apparaat geïntroduceerd via de grote inlaat (d.w.z. 4 mm diameter) met behulp van een glazen micropipette. Het apparaat wordt vervolgens naar beneden gekanteld om de embryo's in de zeven compressiekanalen te laten stromen die op een parallelle manier zijn georganiseerd. Het versmallende atrium dat de embryo-inlaat verbindt met het compressiekanaal zorgt voor een automatische uitlijning van de embryo's voordat ze de ingang van de compressiekanalen bereiken. Het vacuüm dat op de gasinlaat wordt aangebracht, buigt de vervormbare zijwanden naar buiten af, waardoor de effectieve microkanaalbreedte toeneemt en de embryo's achtereenvolgens de compressiekanalen kunnen binnendringen. De zeven compressiekanalen zijn 22 mm lang en bieden tegelijkertijd plaats aan maximaal 300 Drosophila-embryo's in één keer. Compressiekanalen eindigen in een knelpunt waar de breedte van het microkanaal afneemt tot een niveau dat veel kleiner is dan dat van de monsters, waardoor vloeistof kan doorstromen met behoud van de embryo's. Door deze aanpak worden de embryo's geconcentreerd binnen de compressiekanalen. Na de introductie van de embryo's wordt het vacuüm in de gasinlaat verwijderd en keren de zijwanden van het microkanaal terug naar hun oorspronkelijke positie en immobiliseren de opgestelde embryo's van beide kanten. Compressie kan worden bereikt door positieve druk uit te oefenen op de gasinlaat, die de vervormbare zijwanden naar binnen afbuigt en de effectieve microkanaalbreedte vermindert. De hoeveelheid compressie die op embryo's wordt toegepast, kan nauwkeurig worden geregeld door de afmetingen van het microkanaal, de dikte van de vervormbare zijwanden, de Young's Modulus van het PDMS en de uitgeoefende druk aan te passen. Na het compressie-experiment kunnen de embryo's worden verzameld voor downstream-analyse door een vacuüm op de gasinlaat aan te brengen en het microfluïdische apparaat in een andere richting te kantelen.
Dit microfluïdische apparaat werd vervaardigd met behulp van zachte lithografie18. Het fabriceren van dikke structuren met functies met een hoge beeldverhouding met behulp van ultraduick fotoresist vereist echter grote afwijkingen van protocollen die zijn gedefinieerd voor de standaardfabricage (figuur 3). Samen met hexamethyldisilazane (HDMS) coating, werden de silicium wafers gereinigd vóór spin coating om organische resten te verwijderen en gebakken om oppervlaktevocht te verwijderen. Deze extra stappen verbeterden de hechting van de dikke fotoresistlaag op de siliciumwafer. De fotoresist werd ook verwarmd voor het gieten om de viscositeit te verminderen, wat cruciaal was voor het bedekken van het hele waferoppervlak. De beoogde fotoresistlaagdikte werd bereikt door middel van drie draaiende stappen, waarbij elke draaiende stap geleidelijk overtollige fotoresist verwijderde zonder het waferoppervlak te vervuilen. Geïnspireerd door eerder gepubliceerde methoden19, werd aceton, een van de oplosmiddelen van de fotoresist, op de siliciumwafer gespoten om fotoresist-onvolkomenheden te elimineren en de uniformiteit van de coating te vergroten. Tijdens de opeenvolgende bakstappen werd de temperatuur langzaam gewijzigd om thermische stress te minimaliseren, wat zou kunnen leiden tot delaminatie van de fotoresist van de siliciumwafer. Vanwege soortgelijke zorgen werd de baktemperatuur verlaagd terwijl de duur ervan werd verlengd. Een van de meest uitdagende stappen in de fotolithografische fabricage van loopgraven met een hoge beeldverhouding was het verwijderen van de niet-uitgeharde fotoresist na UV-blootstelling. Om de penetratie van de ontwikkelaarsoplossing in de loopgraven te maximaliseren, werd de siliciumwafer ondersteboven gedraaid en continu gemengd met de ontwikkelaarsoplossing met een roerder. Op deze manier kon de nieuwe ontwikkelaarsoplossing reageren met en de niet-uitgeharde fotoresist verwijderen. Deze stap werd gevolgd door een ultrasoon bad waar de resterende fotoresist werd verwijderd. Nadat de siliciumwafervorm met succes was gegenereerd, bestond het standaard replica-gietproces uit het mengen, ontgassen, gieten, uitharden, pellen, ponsen en plasmabinding voor de fabricage van het uiteindelijke microfluïdische apparaat20.
De functionaliteit van het microfluïdische apparaat werd experimenteel bepaald door Drosophila-embryo's in de compressiekanalen te laden en positieve druk uit te oefenen op de gaskanalen. Metingen van de afnemende breedte van de embryo's onder een microscoop (figuur 5A) laten zien hoe gasdruk kan worden gebruikt om een doelcompressieniveau te verkrijgen (figuur 5B). Time-lapse beelden van uitgelijnde embryo's die compressie ondergaan, tonen ook de compatibiliteit van dit systeem met confocale microscopie.
Figuur 1: Het ontwerp en de functie van het microfluïdische apparaat. Het microfluïdische apparaat bestaat uit zeven parallelle compressiemicrokanalen die tot 300 hele Drosophila-embryo's tegelijkertijd kunnen testen. (A) Embryo's werden via de hoofdinlaat van het embryo in het apparaat gebracht en ze werden automatisch uitgelijnd langs de achterste-voorste as toen ze de microkanalen binnendrongen. (B) Embryo's bewogen vrij wanneer negatieve druk werd uitgeoefend door de gasinlaat, omdat dit de vervormbare zijwanden van microkanalen naar buiten afbuigde. Dit maakte het mogelijk om zowel hun laden als lossen als een enkele rijstrook mogelijk te maken. Wanneer de onderdruk werd verwijderd, werden de embryo's geïmmobiliseerd in de microkanalen. Wanneer positieve druk werd uitgeoefend, drukten de zijwanden van het microkanaal de embryo's samen door naar binnen af te buigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Processtroom van microfluïdische compressie-experimenten voor mechanobiologische studies. (A) Het microfluïdische mechanostimulatieapparaat met hoge doorvoer is gemaakt van PDMS en een glazen dia om honderden meercellige biologische monsters te verwerken. (B) Het apparaat is op maat gemaakt om te werken met verschillende meercellige systemen zoals Drosophila-eikamers , Drosophila-embryo's of hersenorganoïden. Dit apparaat kan stabiele of dynamische compressiepatronen toepassen op de biosystemen. (C) De systemen kunnen in de loop van de tijd worden afgebeeld met een confocale microscoop terwijl ze worden gecomprimeerd. De expressieniveaus en lokalisatie van fluorescerend gelabelde eiwitten als reactie op compressie kunnen worden geanalyseerd. Na verzameling kunnen de systemen worden geanalyseerd voor testen en beeldvorming na stimulatie. De verwerkingscapaciteit met hoge doorvoer van het microfluïdische apparaat maakt het ook mogelijk om de systemen te laten lyseren en te gebruiken in op omics gebaseerde biologische testen die een groot aantal monsters vereisen, zoals weergegeven in de figuur met een 2-dimensionaal voorbeeld van differentiële gel-elektroforese. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Fabricageproces van de siliciumwafervorm met dikke fotoresist en hoge beeldverhouding sleuven. (A,B) Het algehele fabricageproces begon met het voorbereiden van de siliciumwafer voor fotoresistcoating. (C-G) Een dikke fotoresistente coating werd uniform aangebracht op de silicium wafer. (H,I) De fotoresist was voorzien van uv-belichting via het fotomasker. (J-L) Ongeharde fotoresist werd verwijderd uit de silicium wafer. (M-P) Het PDMS-deel werd vervaardigd door middel van zachte lithografie. (Q,R) Het apparaat was verzegeld aan de glazen glijbaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De werking van het microfluïdische apparaat. (A) Eerst werden embryo's gepipetteerd in de belangrijkste embryo-inlaat. (B) Ten tweede werd negatieve druk uitgeoefend op de gasinlaat en werd het microfluïdische apparaat naar beneden gekanteld zodat de embryo's konden uitlijnen en in de microkanalen konden worden geladen. (C) Ten derde werd de negatieve druk verwijderd om de embryo's te immobiliseren. (D) Ten vierde werd positieve druk uitgeoefend op de gaskanalen om de embryo's samen te persen. (E) Ten slotte werden de embryo's uit het microfluïdische apparaat verzameld door terug te schakelen naar negatieve druk en het microfluïdische apparaat naar boven te kantelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Experimentele meting van het compressieniveau van het embryo. (A) Representatieve embryo's in het microfluïdische apparaat onder verschillende gasdrukniveaus. Hoewel de embryo's geen significante compressie ervaren onder vacuüm of in neurale druktoestanden, worden ze gecomprimeerd wanneer positieve druk wordt uitgeoefend. (B) De hoeveelheid uniaxiale drukstam die op de embryo's wordt uitgeoefend bij verschillende gasdrukniveaus (foutstaven vertegenwoordigen de standaarddeviatie). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Compressie van hersenorganoïden in een microfluïdisch apparaat dat volgens dezelfde strategie is ontworpen en vervaardigd. (A) De compressie van de hersenorganoïden op toenemende niveaus naarmate de gasdruk wordt verhoogd. (B) De breedte van de hersenorganoïden in de microkanalen bij verschillende drukniveaus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Bovenaanzicht van het fotomasker dat is gebruikt bij de fotolithografische fabricage van de siliciumwafermal. Er zijn vijf identieke microfluïdische apparaatgeometrieën binnen het gebied met een diameter van 4. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Bovenaanzicht van het in dit onderzoek gebruikte microfluïdische apparaat met de relevante afmetingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het artikel beschrijft de ontwikkeling van een microfluïdisch apparaat om automatisch uit te lijnen, te immobiliseren en nauwkeurig mechanische stimulatie toe te passen op honderden hele Drosophila-embryo's . De integratie van het microfluïdische systeem met een dunne glazen afdekplaat maakte het mogelijk om embryo's met hoge resolutie confocale microscopie tijdens de stimulatie in beeld te brengen. Het microfluïdische apparaat maakte ook de verzameling van de embryo's direct na de stimulatie mogelijk voor het uitvoeren van downstream biologische testen. De ontwerpoverwegingen, fabricagemethode en karakterisering van dit apparaat werden in detail beschreven. Het silicium wafer mold fabricageprotocol maakte de uniforme dikke coating van de fotoresist met hoge beeldverhouding sleuven mogelijk.
Om deze fabricagebenadering succesvol te laten zijn, is het belangrijk om de temperatuur van de bakstappen te verlagen en de verwarmings- en koelsnelheden van de siliciumwafer te minimaliseren nadat deze is bedekt met fotoresist. Als dit niet goed wordt gedaan, kan de fotoresistcoating gemakkelijk delamineren en de matrijsgeometrie veranderen. Zodra de siliciumwafervorm met succes is vervaardigd, kan deze worden gekopieerd naar duurzamere materialen om te voorkomen dat de originele mal wordt beschadigd tijdens opeenvolgende PDMS-replica-gietstappen, die ook verwarmings- en koelcycli bevatten21. De fabricage van het PDMS microfluïdische apparaat door middel van replica molding is afhankelijk van het succesvol pellen van zijwandstructuren met een hoge beeldverhouding uit de mal. Om deze fabricagestap betrouwbaar te maken, is het van cruciaal belang om het oppervlak van de siliciumwafer goed te coaten met een silanisatiemiddel om het pellen te vergemakkelijken. De coating moet ook worden vernieuwd na het vervaardigen van ongeveer 20 PDMS-apparaten om de gedeeltelijke verwijdering van de silaanlaag tijdens elke peelingstap te compenseren. Anders kunnen de zijwanden vast komen te zitten in het fotoresistente patroon, waardoor de mal onbruikbaar wordt. Aangezien het compressieniveau dat op de monsters wordt toegepast een functie is van de mechanische eigenschappen van de zijwanden, is het belangrijk om de PDMS-replica-gietprocesparameters consistent te houden. De verhouding, temperatuur en duur van het uithardingsmiddel moeten tijdens de fabricage nauwlettend in de gaten worden gehouden. Bovendien, aangezien deze apparaatstrategie is voor het gelijktijdig toepassen van mechanische stimulatie op een groot aantal meercellige organismen, kan hun aggregatie in de microkanalen leiden tot verstopping. Hoewel dit probleem niet werd ervaren met de organismen die hierin worden gebruikt, zijn er, als dit wel gebeurt, mogelijke oplossingen uit de literatuur om dit probleem te overwinnen, zoals het gebruik van drageroplossingen tijdens de introductie van de monsters22.
Hoewel Drosophila-embryo's in dit werk als een heel meercellig organisme werden gebruikt, kan de hier gepresenteerde ontwerp- en fabricagestrategie worden toegepast op de mechanische stimulatie van andere meercellige systemen door de afmetingen van het apparaat dienovereenkomstig te wijzigen (figuur 2). Dit kan worden bereikt door de breedte en hoogte van het centrale microkanaal uit te breiden om overeen te komen met die van de meercellige systemen. Door deze aanpak kunnen monsters de microkanalen binnendringen en op dezelfde manier worden gecomprimeerd door de vervormbare zijwanden af te buigen met positieve pneumatische druk. Om deze aanpak aan te tonen, werden vergelijkbare apparaten gefabriceerd voor Drosophila-eikamers , evenals hersenorganoïden. Deze systemen maakten de nauwkeurige mechanische compressie van deze biologische systemen mogelijk, vergelijkbaar met de Drosophila-embryo-experimenten (figuur 6). Omdat deze aanpak de aanvulling van de media rond de geïmmobiliseerde monsters mogelijk maakt, kan het ook zeer nuttig zijn voor chemische stimulatie-experimenten die snelle media-uitwisseling vereisen zonder de monsters te verstoren. Over het algemeen combineert deze veelzijdige aanpak de precisie en high-throughput automatiseringsmogelijkheden van microfluïdische systemen en maakt het nieuwe mechanobiologische studies mogelijk op verschillende meercellige systemen zoals kleine weefselmonsters, organoïden, embryo's en eicellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen financiële belangen in de producten die in dit manuscript worden beschreven en hebben verder niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation (CMMI-1946456), het Air Force Office of Scientific Research (FA9550-18-1-0262) en het National Institute of Health (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
References
- Wang, J. H. -C., Thampatty, B. P. An introductory review of cell mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).
- Ingber, D.
- Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering. Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).
- Bellin, R. M., et al. Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).
- Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).
- Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).
- Maurer, M., Lammerding, J. The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).
- Jennings, B. H. Drosophila-A versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Konno, M., et al. State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine. Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).
- Morgan, T. H.
- Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly. Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).
- Jayamohan, H., et al. Chapter 11 - Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies. Molecular Diagnostics. Patrinos, G., et al. , Academic Press. Cambridge, MA. 197-217 (2017).
- Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology. Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).
- Mohammed, D., et al. Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).
- Shorr, A. Z., Sönmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics. Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).
- Kim, Y. T., et al. Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).
- Ashburner, M. Drosophila. A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (1989).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro-and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).
- Lee, H., et al. A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M.
- Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. Polycarbonate heat molding for soft lithography. Small. 16 (16), 2000241 (2020).
- Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos. Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).
