Summary
Den nåværende protokollen beskriver design, fabrikasjon og karakterisering av et mikrofluidisk system som er i stand til å justere, immobilisere og nøyaktig komprimere hundrevis av Drosophila melanogasterembryoer med minimal brukerintervensjon. Dette systemet muliggjør høyoppløselig avbildning og gjenoppretting av prøver for poststimuleringsanalyse og kan skaleres for å imøtekomme andre flercellede biologiske systemer.
Abstract
Under embryogenese genererer koordinert cellebevegelse mekaniske krefter som regulerer genuttrykk og aktivitet. For å studere denne prosessen har verktøy som aspirasjon eller dekkslipkompresjon blitt brukt til å mekanisk stimulere hele embryoer. Disse tilnærmingene begrenser eksperimentell design da de er upresise, krever manuell håndtering og kan behandle bare et par embryoer samtidig. Mikrofluidiske systemer har stort potensial for å automatisere slike eksperimentelle oppgaver samtidig som gjennomstrømning og presisjon økes. Denne artikkelen beskriver et mikrofluidisk system utviklet for å nøyaktig komprimere hele Drosophila melanogaster (fruktflue) embryoer. Dette systemet har mikrokanaler med pneumatisk aktiverte deformerbare sidevegger og muliggjør embryojustering, immobilisering, kompresjon og innsamling etter stimulering. Ved å parallellisere disse mikrokanalene i syv baner, kan stabile eller dynamiske kompresjonsmønstre påføres hundrevis av Drosophila-embryoer samtidig. Fremstilling av dette systemet på et glassdeksel letter samtidig mekanisk stimulering og avbildning av prøver med høyoppløselige mikroskoper. Videre gjør bruken av biokompatible materialer, som PDMS, og evnen til å strømme væske gjennom systemet denne enheten i stand til langsiktige eksperimenter med medieavhengige prøver. Denne tilnærmingen eliminerer også kravet til manuell montering som mekanisk stresser prøver. Videre muliggjør muligheten til raskt å samle prøver fra mikrokanalene poststimuleringsanalyser, inkludert -omics-analyser som krever store prøvetall som er uoppnåelige ved hjelp av tradisjonelle mekaniske stimuleringsmetoder. Geometrien til dette systemet er lett skalerbar til forskjellige biologiske systemer, slik at mange felt kan dra nytte av de funksjonelle funksjonene som er beskrevet her, inkludert høy prøvegjennomstrømning, mekanisk stimulering eller immobilisering og automatisert justering.
Introduction
Levende systemer opplever og reagerer kontinuerlig på ulike mekaniske innganger gjennom hele levetiden1. Mekanotransduksjon har vært knyttet til mange sykdommer, inkludert utviklingsforstyrrelser, muskel- og bentap og nevropatologier gjennom signalveier direkte eller indirekte påvirket av det mekaniske miljøet2. Imidlertid forblir gener og proteiner som reguleres av mekanisk stimulering3 i de mekanosensitive signalveiene4 stort sett ukjente5, og forhindrer belysning av de mekaniske reguleringsmekanismene og identifisering av molekylære mål for sykdommer forbundet med patologisk mekanotransduksjon 6,7 . En begrensende faktor i å projisere mekanobiologistudier på de relaterte fysiologiske prosessene er å bruke individuelle celler med konvensjonelle kulturretter i stedet for intakte flercellede organismer. Modellorganismer, som Drosophila melanogaster (bananflue), har bidratt sterkt til å forstå gener, signalveier og proteiner involvert i dyreutvikling 8,9,10. Likevel har bruk av Drosophila og andre flercellede modellorganismer i mekanobiologiforskning blitt hindret av utfordringer med eksperimentelle verktøy. Konvensjonelle teknikker for å forberede, sortere, avbildning eller anvende ulike stimuli krever for det meste manuell manipulasjon; Disse tilnærmingene er tidkrevende, krever ekspertise, introduserer variabilitet og begrenser eksperimentell design og utvalgsstørrelse11. Nylige mikroteknologiske fremskritt er en stor ressurs for å muliggjøre nye biologiske analyser med svært høy gjennomstrømning og høyt kontrollerte eksperimentelle parametere12,13,14.
Denne artikkelen beskriver utviklingen av en forbedret mikrofluidisk enhet for å justere, immobilisere og nøyaktig anvende mekanisk stimulering i form av uniaxial kompresjon til hundrevis av hele Drosophila-embryoer 15 (figur 1). Integrering av det mikrofluidiske systemet med et glassdeksel tillot høyoppløselig konfokal avbildning av prøvene under stimuleringen. Den mikrofluidiske enheten muliggjorde også rask innsamling av embryoene etter stimuleringen for å kjøre -omics-analyser (figur 2). Forklaringer av designhensynene til denne enheten, samt fabrikasjonen ved hjelp av myk litografi og eksperimentell karakterisering, er beskrevet her. Siden det å lage en silisiumskiveform av en slik anordning krever et jevnt belegg av tykk fotoresist (tykkelse >200 μm) over store områder med AR-grøfter (AR >5), endret denne metoden betydelig den tradisjonelle fotolitografiske formfabrikasjonsprotokollen. På denne måten lettet denne metoden håndtering, vedheft, belegg, mønster og utvikling av fotoresisten. I tillegg diskuteres potensielle fallgruver og deres løsninger. Til slutt ble allsidigheten til denne design- og fabrikasjonsstrategien demonstrert ved hjelp av andre flercellede systemer som Drosophila eggkamre og hjerneorganoider16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av silisiumskiveformen
- Rengjør silisiumskiven (se materialtabell) først med aceton og deretter med isopropylalkohol (IPA).
- Legg silisiumskiven på en 250 °C kokeplate i 30 minutter for dehydrering (figur 3A).
- Belegg silisiumskiven med heksametyldisilazan (HDMS) i en dampprimovn (se materialtabell) (prosesstemperatur: 150 °C, prosesstrykk: 2 Torr, prosesstid: 5 min, HDMS-volum: 5 μL) (figur 3B).
- Plasser en flaske SU-8 2100 fotoresist (se materialtabell) i en ovn på 60 °C i 15 minutter for å redusere viskositeten.
NOTAT: Ved oppvarming i ovnen reduseres viskositeten til fotoresisten. Fotoresister med senket viskositet kan håndteres lettere og kan helles mer nøyaktig på toppen av waferen. - Plasser silisiumskiven på en 60 °C kokeplate og hell 1 ml av den oppvarmede fotoresisten for hver tomme av waferen til fotoresisten dekker det meste av overflaten (figur 3C).
- Overfør den fotoresistbelagte silisiumskiven til en spinnbelegger (se Materialtabell).
- Påfør pre-spin først ved 250 rpm i 30 s og deretter ved 350 rpm for ytterligere 30 s, begge med 100 rpm / s akselerasjon (figur 3D).
- Fjern overflødig fotoresist fra kantene på silisiumskiven ved hjelp av en renromspinne.
- Påfør et spinn først ved 500 o / min for 15 s med 100 o / s akselerasjon og deretter ved 1450 o / min for 30 s med 300 o / s akselerasjon (figur 3E).
- Fjern kantperlen med en renromspinne.
- Plasser silisiumskiven på en 50 °C kokeplate og spray aceton på waferen for å fjerne ufullkommenheter og fremme jevnt belegg (figur 3F).
- Skru temperaturen på kokeplaten sakte opp til 95 °C med en hastighet på 2 °C/min.
- Bløtstek silisiumskiven ved 95 °C i 50 minutter (figur 3G).
- Avkjøl kokeplaten sakte til romtemperatur med en hastighet på 2 °C/min.
- Plasser silikonskiven på en maskejustering (se materialtabell) og plasser fotomasken oppå den (se supplerende figur 1 for fotomaskegeometrien).
- Utsett silisiumplaten for 350 mJ / cm 2 UV-lys (35 mW / cm2 i 10 s) gjennom fotomasken ved hjelp av kontaktmaskejusteringen (figur 3H).
- Påfør påfølgende ettereksponeringsbakst på silisiumskiven ved å plassere waferen på en kokeplate ved 50 °C i 5 minutter, ved 65 °C i ytterligere 5 minutter og til slutt ved 80 °C i ytterligere 20 minutter (figur 3I).
- Avkjøl silisiumskiven sakte til romtemperatur med en hastighet på 2 °C/min.
- Plasser en magnetisk omrører med litt mindre diameter enn silisiumskiven i et beger. Snu silikonskiven opp-ned og legg den på toppen av begeret.
- Plasser begeret inne i et annet større beger og fyll det større begeret med en ny utviklerløsning (se Materialtabell). La silisiumskiven være nedsenket i utvikleren i 30 minutter med omrøreren slått på (figur 3J).
- Overfør silisiumskiven til en ultralydbad sonikator fylt med den friske utvikleren i 1 time ved 40 kHz (figur 3K).
- Vask silisiumskiven grundig med en IPA-løsning for å oppnå den endelige silisiumskiveformen (figur 3L).
2. Fabrikasjon av mikrofluidisk chip
- Plasser silisiumskiveformen i en tørkemaskin sammen med 10 dråper (~ 500 μL) Triklor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl) silan (PFOCTS, se materialtabell) i en liten veiebåt i nærheten.
- Koble tørkeapparatet til en vakuumpumpe på ca. 200 Torr i 30 min.
- Slå av tørkeventilen og koble fra vakuumpumpen over natten for PFOCTS-belegg.
- Klargjør den pre-herdede polydimetylsiloksan (PDMS) løsningen ved å blande PDMS-basen med herdemiddelet (se materialtabell) i forholdet 10:1.
- Avsett blandingen ved å plassere den i en sentrifuge (500 x g i 5 minutter ved romtemperatur).
MERK: Denne sentrifugeringen gjør det mulig for bobler å migrere til toppoverflaten og følgelig fjernes på kort tid. - Hell den avgassede PDMS-løsningen på silisiumskiveformen.
- Degas det igjen for å fjerne luftboblene fanget på formoverflaten.
- Herd PDMS i en ovn på 60 °C i 1 time og 50 minutter (figur 3M).
- Bruk en skalpell for å kutte grensene til det herdede PDMS-området som tilsvarer mikrofluidisk chipgeometri (figur 3N).
- Skrell PDMS-delen og legg den opp-ned på en skjærematte.
- Bruk en barberhøvel til å kutte PDMS-delen i sin endelige form (figur 3O).
- Stans innløps- og utløpshullene på PDMS ved hjelp av et biopsislag (se materialtabell) eller en nål med en stump spiss (figur 3P).
- For embryoinnløpshullet, bruk en 4 mm diameter punch.
- For embryoutløpshullene, bruk en 1,3 mm diameter punch.
- For gassinnløpshullet, bruk et 2 mm slag.
- Bruk et stykke scotch tape for å fjerne partikler som kan forbli på den mønstrede overflaten av PDMS.
- Rengjør et 24 mm x 60 mm rektangulært glassglass først med aceton og deretter med IPA.
- Tørk glassoverflaten med en luftpistol koblet til en filtrert luftkilde.
- Påfør en dehydreringsbake på glassglasset ved å plassere den på en 250 °C kokeplate i 2 timer (figur 3Q).
- Dekk glassglasset med et beger for å forhindre overflatekontaminering.
- Plasser PDMS, med den mønstrede siden opp, og det dehydrerte glasset glir inn i en plasmarenser (se materialtabell).
- Behandle PDMS og glassglasset med oksygenplasma ved 18 W i 30 s.
- Plasser PDMS på glassglasset med den mønstrede overflaten vendt mot glassglasset for å forsegle mikrokanalene via kovalent binding (figur 3R).
- Bruk pinsett til å skyve PDMS-delen forsiktig mot glassglasset for å sikre full konformasjonskontakt.
- Oppbevar den ferdige mikrofluidiske brikken ved romtemperatur over natten for å la bindingen nå sin endelige styrke.
3. Forberedelse av fruktflueembryoene
- Tillat Oregon-R voksne fluer å legge egg på eplejuice agar plater (1,5% agar, 25% eplejuice, 2,5% sukrose) og samle platene på ønsket utviklingstid etter egglegging for det gitte eksperimentet.
MERK: For de nåværende forsøkene ble platene samlet på 140 minutter for å forberede og sortere for embryoer på cellulariseringstrinn17. - Oversvømme agar med embryo egg vask (0,12 M NaCl, 0,04% Triton-X 100) og forsiktig agitere embryoene med en pensel for å løsne dem fra agar.
- Overfør embryoene til en 50% blekemiddelløsning i 90 s, rør av og til. Sil embryoene gjennom en vevssil og vask blekemiddeloppløsningen grundig med vann.
- Overfør embryoene til en 90 mm glass petriskål med nok embryo egg vask for å dekke embryoene fullt ut.
- Undersøk embryoene med transilluminering på et dissekeringsmikroskop og velg embryoer av ønsket utviklingsstadium for lasting i mikrofluidisk enhet.
MERK: I denne applikasjonen ble embryoer på cellulariseringsstadiet valgt. De detaljerte beskrivelsene av hvordan man sikrer riktig valg av utviklingsstadium finnes i laboratoriehåndboken for Drosophila17.
4. Påføring av mekanisk stimulering på bananflueembryoer ved hjelp av mikrofluidikkbrikken
- Prime alle syv embryomikrokanalene ved å fylle dem med 0,4 μm filtrert IPA gjennom hovedembryoinnløpsporten.
- Erstatt IPA med 0,4 μm filtrert avionisert (DI) vann.
- Bytt ut DI-vannet med embryo eggvaskløsning.
- Samle ca. 100 forhåndsvalgte embryoer fra petriskålen i glass ved hjelp av en glasspipette.
- Pipetter embryoene inn i embryoinnløpsporten (figur 4A).
- Påfør et negativt trykk på ca. 3 PSI (dvs. vakuum) på gassinntaket ved hjelp av en bærbar vakuumpumpe for å åpne embryomikrokanalene.
- Vipp mikrofluidikkbrikken nedover slik at embryoene automatisk justerer seg og setter seg inn i embryomikrokanalene (figur 4B).
- Hvis embryomikrokanalinntakene blir tilstoppet av flere embryoer som kommer inn samtidig, vipper du mikrofluidikkbrikken oppover og deretter nedover igjen for å fjerne tilstoppingen.
- Basert på den nødvendige gjennomstrømningen, introduser så mange som 300 embryoer i embryomikrokanalene.
- Når embryobelastningen er fullført, fjern vakuumet for å immobilisere embryoene.
- Vipp mikrofluidikkbrikken tilbake til horisontal posisjon (figur 4C).
- Koble en bærbar overtrykkskilde (se materialtabell) med en trykkmåler til gassinntaket for å bruke 3 PSI-kompresjon (figur 4D).
- Kontroller kontinuerlig trykkmåleren for å sikre at et konsistent kompresjonsnivå påføres.
- Hvis levende bildebehandlingseksperimenter vil bli utført på de mekanisk stimulerte embryoene, plasser mikrofluidikkbrikken på en standard mikroskop trinnvis glassbeholder med gassinntaket koblet til trykkkilden.
- Når kompresjonseksperimentet er fullført, kan embryoene samles inn for nedstrømsanalyse. For å gjøre dette, bruk først vakuumet på gassinnløpet for å frigjøre embryoene.
- Deretter vipper du mikrofluidikkbrikken oppover for at embryoene skal bevege seg mot embryointroduksjonsporten (figur 4E).
- Samle embryoene fra mikrofluidikkbrikken ved hjelp av en glasspipette.
MERK: Ved innsamling kan effekten av kompresjon på embryonal utvikling og levedyktighet undersøkes ved å dyrke fruktfluene i voksen alder. Den mikrofluidiske enhetens prosesseringsevne med høy gjennomstrømning gjør det også mulig å bruke embryoer i nedstrøms omics-baserte analyser som krever et stort antall prøver (figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det mikrofluidiske systemet er delt inn i to underrom adskilt av deformerbare PDMS-sidevegger. Det første rommet er væskesystemet der Drosophila-embryoer blir introdusert, automatisk justert, stilt opp og komprimert. Det andre rommet er et gassystem der gasstrykket på hver side av kompresjonskanalene styres via blindvei mikrokanaler for nøyaktig å kontrollere kompresjonskanalenes effektive bredde. Den mikrofluidiske enheten er forseglet med et glassglass nederst, noe som muliggjør høyoppløselig levende avbildning av prøvene (supplerende figur 2) for de relevante dimensjonene til den mikrofluidiske enheten.
Multicellulære organismer som Drosophila-embryoer velges på ønsket embryonalt utviklingsstadium. Når det gjelder Drosophila-embryoene , er alle utviklingsstadiene like kompatible med denne tilnærmingen, siden embryostørrelsen ikke endres før de klekkes. Utvalgte prøver blir introdusert i mikrofluidisk enhet gjennom det store innløpet (dvs. 4 mm diameter) ved hjelp av en glassmikropipette. Enheten blir deretter vippet nedover for å tillate embryoene å strømme inn i de syv kompresjonskanalene organisert på en parallell måte. Innsnevringsatriet som forbinder embryoinnløpet til kompresjonskanalen, sikrer automatisk justering av embryoene før de når inngangen til kompresjonskanalene. Vakuumet som påføres gassinnløpet avbøyer de deformerbare sideveggene utover, øker den effektive mikrokanalbredden og lar embryoene komme inn i kompresjonskanalene sekvensielt. De syv kompresjonskanalene er 22 mm lange og kan parallelt huse opptil 300 Drosophila-embryoer i en enkelt kjøring. Kompresjonskanaler avsluttes i en flaskehals hvor bredden på mikrokanalen reduseres til et nivå som er mye mindre enn prøvene, noe som gjør at væske kan strømme gjennom samtidig som embryoene beholdes. Gjennom denne tilnærmingen konsentreres embryoene i kompresjonskanalene. Etter introduksjonen av embryoene fjernes vakuumet i gassinnløpet, og mikrokanalsideveggene går tilbake til sin opprinnelige posisjon og immobiliserer de oppôrede embryoene fra hver side. Kompresjon kan oppnås ved å påføre positivt trykk på gassinnløpet, som avleder de deformerbare sideveggene innover og reduserer den effektive mikrokanalbredden. Mengden kompresjon som påføres embryoer kan reguleres nøyaktig ved å skreddersy mikrokanaldimensjonene, tykkelsen på de deformerbare sideveggene, Youngs modul av PDMS og det påførte trykket. Etter kompresjonseksperimentet kan embryoene samles inn for nedstrømsanalyse ved å påføre vakuum på gassinnløpet og vippe mikrofluidanordningen i en annen retning.
Denne mikrofluidiske enheten ble fremstilt ved hjelp av myk litografi18. Fremstilling av tykke strukturer med funksjoner med høyt sideforhold ved bruk av ultratykk fotoresist krever imidlertid store avvik fra protokoller definert for standardfabrikasjon (figur 3). Sammen med heksametyldisilazan (HDMS) belegg ble silisiumskivene rengjort før spinnbelegg for å fjerne organiske rester og bakt for å fjerne overflatefuktighet. Disse ekstra trinnene forbedret bindingen av det tykke fotoresistlaget til silisiumskiven. Fotoresisten ble også oppvarmet før helling for å redusere viskositeten, noe som var avgjørende for å dekke hele waferoverflaten. Tykkelsen på målfotoresistbelegget ble oppnådd gjennom tre spinnende trinn, hvor hvert spinntrinn gradvis fjernet overflødig fotoresist uten å forurense waferoverflaten. Inspirert av tidligere publiserte metoder19 ble aceton sprayet, som er et av løsningsmidlene til fotoresisten, på silisiumskiven for å eliminere fotoresist ufullkommenheter og øke beleggets ensartethet. Under de påfølgende baketrinnene ble temperaturen endret sakte for å minimere termisk stress, noe som kunne føre til delaminering av fotoresisten fra silisiumskiven. På grunn av lignende bekymringer ble baketemperaturen redusert mens den økte varigheten. Et av de mest utfordrende trinnene i den fotolitografiske fremstillingen av grøfter med høyt sideforhold var fjerningen av den uherdede fotoresisten etter UV-eksponering. For å maksimere utviklerløsningens penetrasjon i grøftene, ble silisiumskiven snudd opp ned og kontinuerlig blandet med utviklerløsningen med en omrører. På denne måten kan den ferske utviklerløsningen reagere med og fjerne den ukurante fotoresisten. Dette trinnet ble fulgt av et ultralydbad hvor den gjenværende fotoresisten ble fjernet. Når silisiumskiveformen ble generert, besto standard replikastøpeprosessen av herdemiddelblanding, avgassing, helling, herding, peeling, stansing og plasmabinding for fremstilling av den endelige mikrofluidiske enheten20.
Funksjonaliteten til den mikrofluidiske enheten ble eksperimentelt bestemt ved å laste Drosophila-embryoer inn i kompresjonskanalene og påføre positivt trykk på gasskanalene. Målinger av embryoenes synkende bredde under et mikroskop (figur 5A) viser hvordan gasstrykk kan brukes til å oppnå et målkompresjonsnivå (figur 5B). Time-lapse-bilder av justerte embryoer som gjennomgår kompresjon, viser også dette systemets kompatibilitet med konfokalmikroskopi.
Figur 1: Utformingen og funksjonen til den mikrofluidiske enheten. Den mikrofluidiske enheten består av syv parallelle kompresjonsmikrokanaler som kan teste opptil 300 hele Drosophila-embryoer samtidig. (A) Embryoer ble introdusert i enheten via hovedembryoinnløpet, og de justerte seg automatisk langs bakre fremre akse når de kom inn i mikrokanalene. (B) Embryoer beveget seg fritt når negativt trykk ble påført gjennom gassinnløpet, da dette avbøyde de deformerbare mikrokanalsideveggene utover. Dette tillot lasting så vel som lossing som et enkelt kjørefelt. Når undertrykket ble fjernet, ble embryoene immobilisert i mikrokanalene. Når positivt trykk ble påført, komprimerte mikrokanalens sidevegger embryoene ved å avlede innover. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Prosessflyt av mikrofluidiske kompresjonseksperimenter for mekanobiologistudier. (A) Den mikrofluidiske mekanostimuleringsanordningen med høy gjennomstrømning er laget av PDMS og et glassglass for å behandle hundrevis av flercellede biologiske prøver. (B) Enheten er skreddersydd for å fungere med forskjellige flercellede systemer som Drosophila eggkamre, Drosophila-embryoer eller hjerneorganoider. Denne enheten kan bruke stabile eller dynamiske kompresjonsmønstre til biosystemene. (C) Systemene kan avbildes med et konfokalt mikroskop over tid når de komprimeres. Ekspresjonsnivåene og lokaliseringen av fluorescerende merkede proteiner som respons på kompresjon kan analyseres. Ved innsamling kan systemene analyseres for testing og avbildning etter stimulering. Den mikrofluidiske enhetens prosesseringsevne med høy gjennomstrømning gjør det også mulig å lyse systemene og brukes i omics-baserte biologiske analyser som krever et stort antall prøver, som vist i figuren med et 2-dimensjonalt differensialgelelektroforesebildeeksempel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fabrikasjonsprosessen av silisiumskiveformen med tykk fotoresist og grøfter med høyt sideforhold. (A, B) Den generelle fabrikasjonsprosessen begynte med å forberede silisiumskiven for fotoresistbelegg. (C-G) Et tykt fotoresistbelegg ble jevnt påført silisiumskiven. (H,I) Fotoresisten ble mønstret med UV-eksponering gjennom fotomasken. (J-L) Ukurert fotoresist ble fjernet fra silisiumskiven. (M-P) PDMS-delen ble fremstilt gjennom mykt litografi. (Q,R) Enheten ble forseglet til glassglasset. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Driften av den mikrofluidiske enheten . (A) Først ble embryoer pipettert inn i hovedembryoinnløpet. (B) For det andre ble negativt trykk påført gassinnløpet, og den mikrofluidiske enheten ble vippet nedover for å tillate embryoene å justere og bli lastet inn i mikrokanalene. (C) For det tredje ble negativt trykk fjernet for å immobilisere embryoene. (D) For det fjerde ble positivt trykk påført gasskanalene for å komprimere embryoene. (E) Til slutt ble embryoene samlet inn fra mikrofluidisk enhet ved å bytte tilbake til undertrykk og vippe den mikrofluidiske enheten oppover. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Eksperimentell måling av embryokompresjonsnivå . (A) Representative embryoer inne i mikrofluidisk enhet under forskjellige gasstrykknivåer. Mens embryoene ikke opplever signifikant kompresjon under vakuum eller i nevrale trykktilstander, komprimeres de når positivt trykk påføres. (B) Mengden uniaksial trykkstamme påført embryoene ved forskjellige gasstrykknivåer (feilstenger representerer standardavvik). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Kompresjon av hjerneorganoider i en mikrofluidisk enhet designet og produsert etter samme strategi. (A) Kompresjonen av hjerneorganoider ved økende nivåer etter hvert som gasstrykket økes. (B) Bredden på hjerneorganoidene inne i mikrokanalene ved forskjellige trykknivåer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Toppvisning av fotomasken som brukes i den fotolitografiske fremstillingen av silisiumskiveformen. Det er fem identiske mikrofluidiske enhetsgeometrier plassert innenfor området 4 i diameter. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Toppvisning av mikrofluidisk enhet som brukes i denne studien med de relevante dimensjonene. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Artikkelen beskriver utviklingen av en mikrofluidisk enhet for automatisk å justere, immobilisere og nøyaktig anvende mekanisk stimulering på hundrevis av hele Drosophila-embryoer . Integrasjonen av det mikrofluidiske systemet med et tynt glassdeksel tillot avbildning av embryoer med høyoppløselig konfokal mikroskopi under stimuleringen. Den mikrofluidiske enheten gjorde det også mulig å samle embryoene rett etter stimuleringen for å kjøre nedstrøms biologiske analyser. Designhensynene, fabrikasjonsmetoden og karakteriseringen av denne enheten ble beskrevet i detalj. Silisiumskiveformfabrikasjonsprotokollen tillot det ensartede tykke belegget av fotoresisten med grøfter med høyt sideforhold.
For at denne fabrikasjonsmetoden skal lykkes, er det viktig å senke temperaturen på baketrinnene og minimere oppvarmings- og kjølehastigheten til silisiumskiven etter at den er belagt med fotoresist. Hvis dette ikke gjøres riktig, kan fotoresistbelegget enkelt delaminere og endre formgeometrien. Når silisiumskiveformen er vellykket produsert, kan den kopieres til mer holdbare materialer for å forhindre skade på den opprinnelige formen under påfølgende PDMS-replikastøpetrinn, som også inneholder oppvarmings- og kjølesykluser21. Fremstillingen av PDMS mikrofluidisk enhet gjennom replikastøping er avhengig av vellykket peeling av sideveggstrukturer med høyt sideforhold fra formen. For at dette fabrikasjonstrinnet skal være pålitelig, er det viktig å belegge overflaten av silisiumskiven riktig med et silaniseringsmiddel for å lette peelingen. Belegget bør også fornyes etter fremstilling av ca. 20 PDMS-enheter for å kompensere for delvis fjerning av silanlaget under hvert peelingtrinn. Ellers kan sideveggene sitte fast inne i fotoresistmønsteret, noe som gjør formen ubrukelig. Siden kompresjonsnivået som påføres prøvene er en funksjon av de mekaniske egenskapene til sideveggene, er det viktig å holde PDMS-replikaformingsprosessparametrene konsistente. Herdemiddelforholdet, temperaturen og varigheten må overvåkes nøye under fabrikasjon. I tillegg, siden denne enhetsstrategien er for å anvende mekanisk stimulering samtidig på et stort antall multicellulære organismer, kan deres aggregering inne i mikrokanalene føre til tilstopping. Selv om dette problemet ikke ble opplevd med organismene som brukes her, hvis dette skjer, er det potensielle løsninger fra litteraturen for å overvinne dette problemet, for eksempel å bruke bærerløsninger under introduksjonen av prøvene22.
Selv om Drosophila-embryoer ble brukt som en hel flercellet organisme i dette arbeidet, kan design- og fabrikasjonsstrategien som presenteres her, brukes på mekanisk stimulering av andre multicellulære systemer ved å endre enhetens dimensjoner tilsvarende (figur 2). Dette kan oppnås ved å utvide den sentrale mikrokanalbredden og høyden for å matche de multicellulære systemene. Gjennom denne tilnærmingen kan prøver komme inn i mikrokanalene og komprimeres på samme måte ved å avlede de deformerbare sideveggene med positivt pneumatisk trykk. For å demonstrere denne tilnærmingen ble lignende enheter produsert for Drosophila eggkamre, samt hjerneorganoider. Disse systemene muliggjorde den nøyaktige mekaniske kompresjonen av disse biologiske systemene som ligner på Drosophila-embryoeksperimentene (figur 6). Siden denne tilnærmingen muliggjør påfylling av media rundt de immobiliserte prøvene, kan den også være svært nyttig for kjemiske stimuleringseksperimenter som krever rask medieutveksling uten å forstyrre prøvene. Samlet sett kombinerer denne allsidige tilnærmingen presisjons- og høykapasitetsautomatiseringsfunksjonene til mikrofluidiske systemer, samtidig som det muliggjør nye mekanobiologistudier på ulike flercellede systemer som små vevsprøver, organoider, embryoer og oocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen økonomiske interesser i produktene som er beskrevet i dette manuskriptet og har ikke noe annet å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation (CMMI-1946456), Air Force Office of Scientific Research (FA9550-18-1-0262) og National Institute of Health (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
References
- Wang, J. H. -C., Thampatty, B. P. An introductory review of cell mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).
- Ingber, D.
- Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering. Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).
- Bellin, R. M., et al. Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).
- Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).
- Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).
- Maurer, M., Lammerding, J. The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).
- Jennings, B. H. Drosophila-A versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Konno, M., et al. State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine. Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).
- Morgan, T. H.
- Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly. Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).
- Jayamohan, H., et al. Chapter 11 - Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies. Molecular Diagnostics. Patrinos, G., et al. , Academic Press. Cambridge, MA. 197-217 (2017).
- Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology. Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).
- Mohammed, D., et al. Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).
- Shorr, A. Z., Sönmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics. Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).
- Kim, Y. T., et al. Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).
- Ashburner, M. Drosophila. A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (1989).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro-and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).
- Lee, H., et al. A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M.
- Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. Polycarbonate heat molding for soft lithography. Small. 16 (16), 2000241 (2020).
- Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos. Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).
