Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Mechano-Node-Pore Sensing: En snabb, etikettfri plattform för encells viskoelastiska mätningar med flera parametrar

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64665
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 1,3, 1,2
1Graduate Program in Bioengineering, University of California, Berkeley and University of California, San Francisco, 2Department of Mechanical Engineering, University of California, Berkeley, 3Department of Electrical Engineering and Computer Sciences, University of California, Berkeley
* These authors contributed equally

Summary

Här presenteras en metod för att mekaniskt fenotypa enstaka celler med hjälp av en elektronikbaserad mikrofluidisk plattform som kallas mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). Denna plattform upprätthåller måttlig genomströmning av 1-10 celler / s samtidigt som man mäter både de elastiska och viskösa biofysiska egenskaperna hos celler.

Abstract

Cellulära mekaniska egenskaper är involverade i en mängd olika biologiska processer och sjukdomar, allt från stamcellsdifferentiering till cancermetastaser. Konventionella metoder för att mäta dessa egenskaper, såsom atomkraftsmikroskopi (AFM) och mikropipettaspiration (MA), fångar rik information, vilket återspeglar en cells fullständiga viskoelastiska svar; Dessa metoder begränsas dock av mycket låg genomströmning. Metoder med hög genomströmning, till exempel RT-DC (Deformerability Cytometry i realtid), kan bara mäta begränsad mekanisk information, eftersom de ofta är begränsade till avläsningar med en parameter som bara återspeglar en cells elastiska egenskaper. I motsats till dessa metoder är mekano-nod-poravkänning (mekano-NPS) en flexibel, etikettfri mikrofluidisk plattform som överbryggar klyftan för att uppnå viskoelastiska mätningar med flera parametrar av en cell med måttlig genomströmning. En likströmsmätning (DC) används för att övervaka celler när de passerar en mikrofluidisk kanal och spårar deras storlek och hastighet före, under och efter att de tvingas genom en smal förträngning. Denna information (dvs. storlek och hastighet) används för att kvantifiera varje cells tvärgående deformation, motståndskraft mot deformation och återhämtning från deformation. I allmänhet ger denna elektronikbaserade mikrofluidiska plattform flera viskoelastiska cellegenskaper och därmed en mer komplett bild av en cells mekaniska tillstånd. Eftersom det kräver minimal provberedning, använder en enkel elektronisk mätning (i motsats till en höghastighetskamera) och utnyttjar standard mjuklitografitillverkning, är implementeringen av denna plattform enkel, tillgänglig och anpassningsbar till nedströmsanalys. Denna plattforms flexibilitet, användbarhet och känslighet har gett unik mekanisk information om ett brett spektrum av celler, med potential för många fler applikationer inom grundvetenskap och klinisk diagnostik.

Introduction

Enstaka celler är dynamiska, viskoelastiska material1. En mängd interna och externa processer (t.ex. mitos eller ombyggnad av den extracellulära matrisen [ECM]), påverkar deras struktur och sammansättning 2,3,4, vilket ofta resulterar i distinkta biofysiska egenskaper som kompletterar deras nuvarande tillstånd. I synnerhet har mekaniska egenskaper visat sig vara viktiga biomarkörer för cellulär utveckling, fysiologi och patologi, vilket ger värdefull kvantitativ information som kan komplettera kanoniska molekylära och genetiska tillvägagångssätt 5,6,7. beskrev till exempel nyligen de mekaniska skillnaderna mellan läkemedelsresistenta och läkemedelsresponsiva akuta promyelocytiska leukemiceller, samtidigt som de använde RNA-seq för att avslöja differentiellt uttryckta cytoskelettassocierade gener8. Genom att förstå det komplexa samspelet mellan encellsmekanik och cellulär funktion har mekanofenotypning bredare tillämpningar för att omvandla grundvetenskap och klinisk diagnostik9.

Det mest använda verktyget för att mäta encellsmekanik är atomkraftmikroskopi (AFM). Medan AFM möjliggör en högupplöst, lokaliserad mätning av cellulära mekaniska egenskaper, förblir den begränsad till en genomströmning på <0,01 celler / s10. Alternativt är optiska bårar, som använder två divergerande laserstrålar för att fånga och deformera suspenderade enstaka celler11, begränsade till marginellt högre genomströmningar av <1 cell / s12. De senaste framstegen inom mikrofluidisk teknik har möjliggjort en ny generation enheter för snabb, encellig, mekanisk bedömning12,13. Dessa tekniker använder smala förträngningskanaler 14,15, skjuvflöde16 eller hydrodynamisk sträckning17 för att deformera celler snabbt vid genomströmningar av 10-1 000 celler / s18. Även om mäthastigheten för dessa metoder är betydligt snabbare än konventionella tekniker, handlar de ofta med hög genomströmningskapacitet för begränsade mekaniska avläsningar (tilläggstabell 1). Alla ovannämnda snabba mikrofluidiska metoder fokuserar på grundläggande mätvärden med en parameter, såsom transittid eller deformerbarhetsförhållanden, som endast återspeglar en cells elastiska egenskaper. Med tanke på den inneboende viskoelastiska naturen hos enskilda celler kräver emellertid en robust och grundlig mekanisk karakterisering av celler att man inte bara överväger elastiska komponenter utan också viskösa svar.

Mechano-node-pore sensing (mechano-NPS)2,8 (figur 1A) är en mikrofluidisk plattform som hanterar befintliga begränsningar med encells mekanofenotypning. Denna metod möjliggör mätning av flera biofysiska parametrar samtidigt, inklusive celldiameter, relativ deformerbarhet och återhämtningstid från deformation, med en måttlig genomströmning på 1-10 celler / s. Denna teknik är baserad på nod-poravkänning (NPS)19,20,21,22,23,24, vilket innebär att man använder en fyrpunktssondmätning för att mäta den modulerade strömpulsen som produceras av en cell som passerar en mikrofluidisk kanal som har segmenterats av bredare regioner, kallade "noder". Den modulerade strömpulsen är ett resultat av att cellen delvis blockerar strömflödet i segmenten (dvs "porer") och noder, med mer ström blockerad i den förra än i den senare. I mekano-NPS är ett segment, "sammandragningskanalen", smalare än en celldiameter; Följaktligen måste en cell deformeras för att passera hela kanalen (figur 1B). Celldiametern kan bestämmas av storleken på den subpuls som produceras när cellen passerar nodporerna före sammandragningskanalen (figur 1B,C). Här, |ΔInp|, det aktuella fallet när cellen är i poren, är proportionellt mot cellens volymförhållande till poren, V-cellen / V-poren 2,8,19. Cellstyvhet kan bestämmas av ΔTc, varaktigheten av den dramatiskt större subpuls som produceras när cellen passerar sammandragningskanalen (figur 1B,C). En styvare cell tar längre tid att passera kanalen än en mjukare 2,8. Slutligen kan cellens "återhämtning", cellens förmåga att återgå till sin ursprungliga storlek och form efter deformation, bestämmas av serien av subpulser som produceras när cellen passerar nodporerna efter sammandragningskanalen (figur 1B, C). Återhämtningstiden, ΔTr, är den tid det tar för de aktuella subpulserna att återgå till storleken på de tidigare subpulserna, innan cellen pressas. Sammantaget registreras och analyseras de modulerade strömpulser som produceras som en cell som passerar den mikrofluidiska kanalen för att extrahera de relevanta encelliga mekaniska parametrarna (figur 1D)2,8.

Reproducerbarheten och användarvänligheten av denna elektronikbaserade mikrofluidiska plattform har tidigare visats25. Dessutom presenterar plattformen en låg barriär för inträde för encells mekanofenotypning. Standard mjuk litografi används för att tillverka mikrofluidiska enheter. Mäthårdvaran består av billiga komponenter, inklusive ett enkelt kretskort (PCB), strömförsörjning, förförstärkare, datainsamlingskort (DAQ) och dator. Slutligen finns användarvänlig kod tillgänglig för datainsamling och analys, vilket möjliggör enkel implementering. Denna mekanofenotypningsteknik kan skilja populationer av icke-maligna och maligna bröst- och lungepitelcellinjer, skilja mellan underlinjer i primära humana bröstepitelceller och karakterisera effekterna av cytoskeletala störningar och andra farmakologiska medel 2,8. Sammantaget är denna plattform ett effektivt tillvägagångssätt för mekanofenotypning av enskilda celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Designa enhetens geometri

  1. Välj bredden på storleks- och återhämtningssegmenten så att den är bredare än diametern på de största cellerna som ska mätas men också upprätthåller ett tillräckligt signal-brusförhållande (SNR). Se tilläggstabell 2 för exempel på olika storleks- och återvinningssegmentbredder för olika cellinjer.
  2. Välj kontraktionssegmentets bredd för att tillämpa en 30% -40% belastning på den genomsnittliga storleken på cellerna som ska genomgå mekanofenotypning. Töjning definieras som Equation 1, där d är celldiameter och wc är sammandragningskanalbredden 2,8. Se tilläggstabell 2 för olika kontraktionssegmentbredder för olika cellinjer.
    OBS: Om man vill jämföra celltyper eller förhållanden med väsentligt olika diametrar, bör separata enhetskonstruktioner användas med sammandragningssegmentbredder som är specifika för varje celltyp / tillstånd.
  3. Designa en referensenhet för varje unik enhetsgeometri. Detta är nödvändigt för att bestämma De, den effektiva diametern för dimensioneringsporsegmentet i den mikrofluidiska kanalen.
    OBS: Referensenheten använder samma geometri som den primära enheten. Den enda modifieringen är att sammandragningssegmentet ska vara lika brett som dimensioneringsporsegmentet för att möjliggöra kalibrering med polystyrenpärlor av känd storlek. Breddning av sammandragningen förhindrar att polystyrenpärlorna täpper till sammandragningskanalen under kalibrering. Kalibreringsprocessen beskrivs närmare i steg 4.1 och 5.3.1. Kalibrering kan också uppnås med hjälp av en kommersiellt tillgänglig cellräknare, i vilket fall ingen referensanordning behövs. Denna process beskrivs i steg 4.2.
  4. Välj kanalhöjden så att de största cellerna av intresse kan förlängas helt utan begränsning inom kontraktionssegmentet2. Se till att kanalhöjden är större än hmin Equation 2 (detta förutsätter att cellen är sfärisk fördeformation och att isometrisk deformation uppstår längs kanallängden och höjden under deformation).
    OBS: Med tanke på storleken på en strömunderpuls, ju större hmin är, Equation 3desto lägre blir den totala SNR.
  5. Designa och skapa en fotomask med hjälp av datorstödd designprogramvara med de valda kanalbredderna. En exempelfil finns i tilläggsfil 1. Skala den mikrofluidiska maskdesignen med 1,5% för att ta hänsyn till krympning av polydimetylsiloxan (PDMS) efter skalning från den negativa mastern.
    OBS: En matris av enheter kan inkluderas på en enda mask så länge den totala matrisen inte överstiger skivans storlek (kompletterande figur 1A).
  6. Designa och skapa en fotomask med elektroder som kommer att användas för att utföra en fyrpunktssondmätning av den mikrofluidiska enhetens ström (figur 1D). En exempelfil finns i tilläggsfil 1.
    OBS: En uppsättning elektroder kan inkluderas på en enda mask så länge matrisen inte överstiger storleken på glasskivan (kompletterande figur 1B).

2. Tillverka enheter (figur 2)

  1. Förbered elektrodmönster på ett glassubstrat.
    1. Snurra beläggning, mönster och bearbeta en positiv fotoresist på en vanlig glasskiva enligt produktdatabladet. Ett exempel på detta förfarande beskrivs i tilläggsfil 2.
    2. Utför metallavlagring, lyftning och guldetsning.
      1. Utför tunnfilmsdeposition av 75 Å Ti, 250 Å Pt och 250 Å Au på rutschkanan. Ett exempel på denna procedur med användning av elektronpistolindunstning beskrivs i tilläggsfil 3.
      2. Sänk ner rutschkanan i aceton i 15 minuter för att utföra en lyftning av överflödig metall.
      3. Använd i en dragskåp en engångspipett för att släppa gjutet guldetsting på området av elektroder som kommer att exponeras för den mikrofluidiska kanalen, som visas i kompletterande figur 2. Var försiktig så att du inte tappar etsning någon annanstans på bilden.
        VARNING: Guldetsning kan orsaka hud- och ögonirritation. Andas inte in ångor och inta inte. Hantera med försiktighet, använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) och kassera avfall enligt lokala avfallshanteringsbestämmelser.
      4. Skölj bilden med avjoniserat (DI) vatten och torka det med torrt kväve (N2).
    3. Om flera elektroder är tryckta på samma glasskiva, tärna bilden i enskilda marker.
      1. Använd ett glasskärverktyg för att göra bilden längs de mönstrade elektrodgränserna.
      2. Bryt glaset längs poängen för att dela upp bilden i enskilda marker.
    4. Inspektera elektroderna visuellt under ett mikroskop. Se till att enskilda elektroder inte är elektriskt öppna eller att elektroderna inte kortsluts tillsammans.
  2. Tillverka en negativ huvudform för kanaler.
    1. Snurra beläggning, mönster och bearbeta ett SU-8 epoximotstånd på en polerad kiselskiva enligt produktdatabladet. Ett exempel på detta förfarande beskrivs i tilläggsfil 2.
    2. Mät funktionshöjder med hjälp av en profilometer och inspektera funktionerna visuellt i mikroskop (kompletterande figur 3). Se till att de önskade geometrierna är väldefinierade.
  3. Mögel PDMS-kanaler med mjuk litografi.
    1. Förbered PDMS genom att väga en elastomer och en tvärbindare med ett massförhållande på 10: 1 i en engångskopp.
      OBS: För en skiva med en diameter på 3 är 30 g PDMS tillräckligt.
    2. Blanda PDMS kraftigt i 30 s med en engångsgaffel tills PDMS är ogenomskinligt med bubblor.
    3. De-gasa PDMS i en vakuumkammare i cirka 30-90 minuter, eller tills PDMS är transparent utan synliga bubblor.
    4. Placera skivan med SU-8-huvudformen i en engångsskål och häll PDMS över mitten av skivan.
    5. Placera petriskålen som innehåller PDMS och skivan i en vakuumkammare och avgasa i cirka 30 minuter, eller tills inga bubblor finns kvar i PDMS.
    6. Grädda PDMS vid 80 °C i 2 timmar i ugn eller på en varm tallrik.
    7. Skär och ta bort PDMS från SU-8 negativa master med ett skarpt blad.
    8. Tärna den gjutna PDMS-plattan i enskilda formar med ett vasst blad
    9. Kärna inlopps- och utloppshålen med en engångsbiopsistans. För bästa resultat bör du använda en ny stans för varje PDMS-platta. En skarpare stans ger hål med släta kanter, vilket minimerar partiklar som kan hindra sammandragningskanalen.
      OBS: Diametern på åtkomsthålen bör vara något mindre än slangens ytterdiameter. Till exempel, om du använder polytetrafluoretylen (PTFE) slangar med en ytterdiameter på 1/32 tum, bör ett 1,5 mm hål stansas.
  4. Bind ett glas/elektrodsubstrat till PDMS-kanalerna.
    1. Rengör elektrodglasskivorna med metanol (≥99,8%). Torka med torr N2.
    2. Rengör PDMS-enheten med tejp, följt av sköljning med isopropylalkohol (IPA) och avjoniserat vatten (DI; 18 MΩ/cm2). Torka med torr N2. Rengör sedan med tejp en gång till.
    3. Placera glassubstratet med prefabricerade elektroder och den förberedda PDMS-formen (funktionssidan uppåt) i en plasmarengörare.
    4. Utsätt båda för syreplasma i 2 min (100-300 mTorr, 30 W).
    5. Rikta in och placera PDMS-formen med funktionssidan nedåt på glassubstratet med prefabricerade elektroder.
      OBS: Bindningen är omedelbar när det plasmabehandlade PDMS och glaset kommer i kontakt; Följaktligen kommer ytterligare anpassningsändringar inte att vara möjliga. För att underlätta inriktningen kan 20 μl av en 2:1-utspädning av metanol i DI-vatten pipetteras på den plasmabehandlade glasytan. Metanollösningen fungerar som en fysisk barriär mellan det behandlade glaset och PDMS, vilket möjliggör justeringsjusteringar. Om du använder metanol, baka den inriktade och parade anordningen vid 50 °C i 2 timmar för att avdunsta lösningen och slutföra bindningsprocessen.
    6. Visuellt inspektera den bundna enheten under ett mikroskop. Se till att elektroderna och kanalgeometrierna är korrekt inriktade.

3. Mät celler (figur 1D)

  1. Förbered tryckkällan, kretskortet, bänkhårdvara, och datainsamlingsprogramvara.
    1. Anslut den mikrofluidiska enheten till kretskortet med klämman. Ett exempel på PCB finns i Supplementary File 4 (GERBER-filer) och Supplementary File 5 (schematiska, kort, och PCB-delar listfiler).
      1. Rikta in klämmans fjäderbelastade stift med elektrodkontaktkuddarna på mikrofluidikanordningen och rikta in klämmans huvudstift mot hålen på kretskortet.
      2. Sätt in klämmans huvudstift ordentligt i PCB-hålen, se till att de fjäderbelastade stiften håller sig i linje med elektrodkontaktkuddarna.
    2. Konfigurera och anslut den elektroniska hårdvaran.
      1. Anslut två av strömförsörjningens utgångsportar till kretskortets matningsportsport med en dubbel bananplugg-till-Bajonett Neill-Concelman (BNC) honadapter och en BNC-kabel.
      2. Slå på strömförsörjningen. Ställ in utgången ansluten till BNC: s inre ledare till +15 V och ställ in den andra utgången på -15 V. Aktivera båda utgångarna för att driva kretsen.
      3. Anslut den tredje av strömförsörjningens utgångsportar till ingångsspänningsporten på kretskortet med en BNC-kabel. Ställ in utgången till önskad applicerad spänning, men aktivera den inte förrän experimentet startas.
      4. Anslut kretskortets utgångsströmport till ingången till den aktuella förförstärkaren med en BNC-kabel.
      5. Anslut utgången från den aktuella förförstärkaren till en analog ingång på BNC-terminalblocket i datainsamlingssystemet med en BNC-kabel. Anslut eventuellt ett analogt lågpassfilter i linje med BNC-kabeln för att filtrera bort högfrekventa störningar.
        OBS: För att förbättra SNR, kretskortet och enheten kan vara inrymda i ett tjockt metallhölje. Alla BNC-kablar och vätskeslangar kan ledas genom hål som borras in i höljet.
    3. Installera och konfigurera nödvändig programvara på persondatorn (PC)
      1. Slå på och anslut tryckregulatorn till datorn. Installera all nödvändig tryckkontrollprogramvara enligt tillverkarens instruktioner.
      2. Installera MATLAB och Data Acquisition Toolbox på datorn. Se till att de nödvändiga drivrutinerna för datainsamlingssystemet är installerade så att MATLAB Data Acquisition Toolbox-gränssnittet kan upptäcka det.
      3. Ladda ned det medföljande datainsamlingsskriptet "NPS.m" från https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public.
    4. Öppna och konfigurera datainsamlingsskriptet.
      1. Ange rätt värden för att initiera datainsamlingssessionen, som inkluderar leverantörs-ID, DAQ:s enhets-ID och det analoga indatakanalnumret (raderna 34–36 i det inkluderade skriptet).
        OBS: Enhets-ID kan hittas med funktionen "daq.getDevices" eller "daqlist".
      2. Ställ in önskad samplingsfrekvens för förvärvet (rad 23 i det medföljande skriptet). För optimala resultat bör den ställas in på minst 10 kHz.
  2. Förbered cellsuspensionen.
    1. Förbered en lösning av 2% fetalt bovint serum (FBS) i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och filtrera med ett 0,22 μm filter.
    2. Odla och förbered cellerna enligt lämpligt cellodlingsprotokoll för den valda cellinjen. Suspendera cellerna i den beredda lösningen av 2% FBS i 1x PBS i en koncentration av 1-5 x 105 celler / ml. Håll cellerna på is under experimentens varaktighet.
  3. Mät cellernas fysikaliska egenskaper.
    1. Ladda cellprovet i slangen och anslut det till enhetens inlopp.
      1. Skär 30 cm PTFE-slang med ett rakblad eller vass kniv.
      2. Fäst ena änden av slangen på en luerlåsspruta. Använd sprutan för att dra upp cellprovet i den andra änden av slangen.
      3. Sätt försiktigt in slangen i enhetens inlopp.
      4. Anslut den motsatta änden av slangen till den mikrofluidiska tryckregulatorn.
        OBS: Ett filter kan läggas till mellan den mikrofluidiska tryckregulatorn och slangen för att förhindra vätskeåterflöde i tryckregulatorn.
    2. Kör experimentet.
      1. Ställ in önskat konstant drivtryck på tryckregulatorprogramvaran och låt provet fylla enheten.
        OBS: Trycket är vanligtvis 2-21 kPa. Flödeshastigheten måste vara tillräckligt långsam för att möjliggöra tydligt definierade pulser men tillräckligt snabb för att möjliggöra tillräcklig genomströmning.
        1. Om bubblor bildas i de mikrofluidiska kanalerna, använd återvändsgrändsfyllning: anslut enhetens utlopp och applicera ett lågt tryck på inloppet för att tvinga ut luft genom det gasgenomsläppliga PDMS. Att lämna bubblor i kanalen leder till en instabil strömbaslinje och förhindrar noggranna mätningar.
        2. Om skräp täpper till den mikrofluidiska kanalen, lossa den genom att lätt trycka på toppen av PDMS-enheten medan du applicerar drivtrycket, "pulserar" ett högre tryck genom att slå på och av trycket eller ta bort slangen och sätta tillbaka den. Om skräpet kvarstår kan det vara nödvändigt att byta till en ny enhet.
      2. Ställ in önskad spänning genom att rotera spänningsknappen på strömförsörjningen och aktivera spänningen genom att trycka på On-knappen .
        OBS: Spänningen är vanligtvis 1-5 V. Välj den lägsta spänningen som krävs för en adekvat SNR. Samma spänning bör användas under alla förhållanden som ska jämföras.
      3. Slå på den aktuella förförstärkaren och ställ in känsligheten (A / V) så lågt som möjligt; alternativt kan du ställa in förstärkningen (V / A) så högt som möjligt utan att överbelasta förförstärkaren eller överskrida den maximala analoga ingångsspänningen för DAQ. I denna studie sattes känsligheten till 10-7 A/V.
        OBS: Rätt känslighet / förstärkningsvärde beror på både den applicerade spänningen och baslinjemotståndet hos den mikrofluidiska kanalen.
      4. Tryck på den gröna knappen Kör i menyfliksområdet MATLAB för att starta datainsamlingsskriptet NPS.m och börja sampla och spara data.
      5. Om du vill avsluta experimentet trycker du på stoppknappen i det nedre vänstra hörnet av figurfönstret för att stoppa datainsamlingsskriptet. Inaktivera strömförsörjningsutgången genom att trycka på On-knappen . Ställ in tryckkällan på nolltryck i tryckregulatorprogramvaran.
      6. Nu kan experimentet pausas för att göra något av följande:
        1. Byt ut den nuvarande enheten med en ny.
        2. Ladda om slangen med fler cellprover.
          OBS: För att undvika korskontaminering av prov, använd nya enheter för att mäta celler av olika typer eller förhållanden.
        3. Lossa enheten från kretskortet och undersök kanalens tillstånd under ett mikroskop. För att starta om experimentet med samma enhet måste man se till att inte införa luftbubblor. Det kan vara nödvändigt att applicera försiktigt tryck på sprutkolven för att hålla cellprovet i slutet av slangen medan det förs in i enhetens inlopp.

4. Kalibrera mikrofluidikanordningen

  1. Alternativ 1: Mät polystyrenpärlorna i referensanordningar.
    1. Välj en polystyrenpärlstorlek som är mindre än storlekskanalen.
    2. Tillsätt 1,5% tween- och polystyrenpärlor till den filtrerade PBS- och FBS-lösningen som användes under cellexperimenten, i en koncentration av 1-3 x 105 pärlor / ml.
    3. Fortsätt med experimentet enligt beskrivningen i avsnitt 3 med hjälp av referensenheten som beskrivs i steg 1.3 och applicera samma spänning som användes under experimentet. Använd den genomsnittliga storleken på den strömdroppe som produceras när pärlor passerar storleksporerna och den kända diametern på pärlorna för att beräkna De, enligt beskrivningen i avsnitt 5.
  2. Alternativ 2: Mät cellstorleken oberoende med en separat mätanordning.
    1. Istället för att följa protokollet i steg 4.1, använd ett kommersiellt tillgängligt cellstorleksmätningsinstrument för att mäta den genomsnittliga storleken på cellerna i provet. I det här fallet behövs ingen referensanordning. Använd det genomsnittliga strömfallet som produceras när celler passerar storleksporen och den uppmätta genomsnittliga celldiametern för att beräkna De enligt beskrivningen i avsnitt 5.

5. Analysera data för att extrahera cellfenotyper

OBS: Databehandling kan utföras med hjälp av MATLAB-kommandoradsgränssnittsprogramfilen mNPS_procJOVE.m vid https://github.com/sohnlab/NPS-analysis-JOVE. Se tilläggsfil 6 för mer instruktioner.

  1. Förbehandla data (figur 3A).
    1. Beräkna den uppmätta elektriska strömmen genom att tillämpa förstärkningsvärdet som används i ström-till-spänningsförförstärkaren på rådata som erhållits av DAQ.
    2. Ta bort högfrekvent brus genom att använda en rektangulär utjämningsfunktion och/eller ett lågpassfilter på råströmsmätningen. Sampla sedan om filtrerade data till en lägre samplingsfrekvens. Beräkna även motsvarande tidsstämpeldata med den här lägre samplingsfrekvensen.
    3. Beräkna en anpassad baslinjeströmsignal genom att tillämpa en metod som asymmetriska minsta kvadrater som utjämnar26.
    4. Beräkna den ungefärliga första derivatan (skillnadssignalen) av förbehandlade aktuella data genom att ta skillnaden mellan efterföljande datapunkter.
  2. Identifiera cellhändelser och extrahera subpulsdata (figur 3B).
    1. Sök efter kandidatcellshändelser genom att undersöka förbehandlade data. Avvisa cellhändelser som överlappar andra cellhändelser (dvs. slumphändelser) (kompletterande figur 4), uppvisar en dålig baslinjepassning eller har en oväntad eller felaktig pulsform (t.ex. där en igensättning kan ha funnits i kanalen).
    2. Extrahera subpulsdata för varje cellhändelse.
      1. Varje nodporsegment visas som en motsvarande subpuls inom den totala signalpulsen (figur 1B, C). Identifiera starten för varje subpuls genom att beräkna tidpunkten när skillnadssignalen når ett lokalt minimivärde. Identifiera slutet på varje subpuls genom att beräkna tidpunkten när skillnadssignalen når ett lokalt maxvärde.
      2. Bestäm bredden på varje delpuls som förfluten tid mellan start- och sluttidpunkten. Bestäm amplituden för varje subpuls genom att beräkna medelvärdet av skillnaden mellan den uppmätta strömmen och baslinjeströmmen för alla datapunkter mellan start- och sluttidpunkterna.
  3. Bestäm cellmekanofenotypen för varje cellhändelse baserat på subpulsdata.
    1. Bestäm celldiametern d baserat på ekvationen definierad av Deblois och Bean24:
      Equation 4
      där ΔI/I är medelförhållandet mellan subpulsamplitud och baslinjeström i dimensioneringsunderpulserna, De är kanalens effektiva diameter (mätt i steg 4) och L är den totala längden på nod-porkanalen.
      1. D e bestäms genom att beräkna medelvärdet av ΔI/I som produceras av en uppsättning partiklar med känd diameter (antingen celler eller pärlor, se steg 4), med användning av den kända diametern som d, och genom att lösa Eq. 1 för De.
    2. Kvantifiera cellens motståndskraft mot deformation.
      1. Bestäm vätskehastigheten U-flödet genom att beräkna den genomsnittliga cellhastigheten i dimensioneringsunderpulserna med hjälp av de kända segmentlängderna och den uppmätta varaktigheten för varje subpuls.
      2. Bestäm helcellsdeformerbarhetsindexet (wCDI), definierat av Kim et al.2 som:
        Equation 5
        där L c är längden på kontraktionssegmentet, h-kanalen är kanalhöjden och ΔTc är varaktigheten för kontraktionsunderpulsen.
    3. Identifiera cellens återhämtningstid från deformation, definierad som den första återhämtningsunderpulsen med en amplitud inom 8% av medelamplituden från storlekssubpulsen2.
    4. Beräkna cellens tvärgående deformation inom kontraktionssegmentet.
      1. Beräkna den effektiva diametern för kontraktionssegmentet (De,c) enligt definitionen av Kim et al.2:Equation 6 , där w c är sammandragningssegmentets bredd och wnp är bredden på alla andra segment.
      2. Beräkna cellens ekvivalenta sfäriska diameter dc inom sammandragningen genom att återigen använda ekvationen definierad av Deblois och Bean24:
        Equation 7
        där ΔI c/I c är förhållandet mellan subpulsamplitud och baslinjeström i kontraktionssubpulsen och Lc är längden på kontraktionssegmentet.
      3. Beräkna cellens töjningslängd L-deformeras enligt beskrivningen av Kim et al.2:
        Equation 8
      4. Slutligen beräkna cellens tvärgående deformation δdeformeras, vilket definieras av Kim et al.2 som . Equation 9

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den mekanofenotypningsplattform som presenteras här är ett enkelt och mångsidigt tillvägagångssätt för att mäta de biofysiska egenskaperna hos enskilda celler med måttlig genomströmning. Celler flödas genom den mikrofluidiska kanalen (figur 1A) med konstant tryckdrivet flöde. När cellerna passerar registreras längden på den mikrofluidiska kanalen och de producerade strömpulserna med hjälp av datainsamlingshårdvaran. Den förvärvade signalen (figur 1B,C) bearbetas sedan med hjälp av anpassad programvara på MATLAB för att extrahera relevanta encelliga mekaniska egenskaper. Figur 1D visar en grafisk översikt över experimentprotokollet.

För att tillverka enheter skapas ursprungligen en negativ huvudform och används för att gjuta PDMS (figur 2). Framgångsrika huvudformar, som visas i kompletterande figur 3, innehåller släta, vertikala sidoväggar och inga defekter i mikrofluidikkanalen (figur 4Ai). Försiktighet bör iakttas vid tillverkning av denna ursprungliga huvudform eftersom, i dåligt tillverkade skivor (kompletterande figur 3), kommer eventuella defekter att överföras till alla efterföljande PDMS-gjutningar (figur 4Aii), vilket gör dem oanvändbara. Framgångsrika PDMS-avgjutningar plasmabinds sedan till glasskivor med mönstrade elektroder (figur 1A).

För experiment, en enhets elektrodkuddar är anslutna till kretskortet (figur 1D) för att möjliggöra strömmätning. Slangar, som innehåller ett cellprov, sätts sedan in i enhetens inlopp och ansluts till en mikrofluidisk flödesregulator, vilket möjliggör ett tryckdrivet flöde av celler genom den mikrofluidiska kanalen. Det är viktigt att en liveavläsning av den aktuella mätningen visas under ett experiment. Detta gör det möjligt för användare att se till att deras enhet fungerar som avsett. Lyckade celltransiteringshändelser består av lätt urskiljbara subpulser (figur 4Bi). Komplikationer, såsom igensättning, kan uppstå under experimentering och kan identifieras genom liveavläsning av händelser med onormala pulsformer (figur 4Bii).

För dataanalys beskrivs de kritiska signalparametrar som måste extraheras för varje celltransiteringshändelse i figur 1B och beskrivs i steg 5.2.2. Den råa signalen bör ha en tillräcklig SNR för att filtrera bort bruset och extrahera de betydande komponenterna (figur 3A). Kritiskt bör den aktuella signalhöjningen från varje nod vara tillräckligt robust så att subpulser lätt kan identifieras från skillnadssignalen ∂ I/∂t (figur 3B).

De uppmätta wCDI - och återhämtningstiderna kan användas för att göra direkta jämförelser mellan celler eller förhållanden. Specifikt är wCDI en relativ indikator på cellstyvhet som är omvänt proportionell mot den elastiska modulen (kompletterande figur 5); således motsvarar ett större värde av wCDI en mjukare mekanisk fenotyp. Till exempel, i figur 5A, har maligna MCF-7-celler en större wCDI-fördelning än icke-maligna MCF-10A-celler, vilket indikerar att de maligna MCF-7-cellerna är mjukare än deras icke-maligna MCF-10A-motsvarigheter. Detta överensstämmer med många empiriska studier som har visat att cancerceller är mjukare än deras icke-maligna motsvarigheter27. På samma sätt, i figur 5B, visar MCF-10A- och MCF-7-celler behandlade med latrunkulin en ökning av wCDI. Latrunkulin är ett potent farmakologiskt medel som stör aktincytoskelettet28. Följaktligen är det konsekvent att observera en större wCDI , och därmed en mjukare fenotyp, i celler som behandlas med detta läkemedel. Slutligen, i figur 5C, jämförs wCDI mellan två mänskliga bröstepitelceller, luminal epitelial (LEP) och myoepitelial (MEP). I denna jämförelse finns det återigen en distinkt wCDI-fördelning som skiljer de två primära celltyperna, vilket indikerar att LEP-celler är mjukare än MEP-celler. Utöver wCDI kan återhämtningstider också kvantifieras för att ge en relativ indikator på cellviskositet. En längre återhämtningstid indikerar en mer viskös fenotyp. I figur 5D visas återhämtningstiderna, indelade i tre olika kategorier, för vart och ett av villkoren i figurerna 5A-C. Obehandlade MCF-10A och MCF-7s har en större andel celler som återhämtar sig omedelbart (ΔTr = 0), vilket indikerar en lägre viskositet än deras latrunkulinbehandlade motsvarighet.

wCDI och återhämtningstid är relativa mått på encellselasticitet och viskositet. Därför är metoden som presenteras här bäst lämpad för att karakterisera det differentiella svaret mellan flera prover av intresse. I sin nuvarande form ger protokollet som presenteras här inte absoluta kvantifieringar av definierade mekaniska parametrar, såsom Youngs modul.

Figure 1
Bild 1: Översikt över plattformen för mekanofenotypning. (A) Bild av den mikrofluidiska anordningen. (B) Kanalgeometri, med en representativ strömpuls från en enda celltransithändelse. Δ Inp representerar den aktuella droppen från cellen som kommer in i poren, och ΔIc representerar den aktuella droppen från cellen som kommer in i sammandragningen. Δ T p representerar den tid som krävs för att cellen ska passera poren, Δ Tc representerar den tid som krävs för att cellen ska passera sammandragningskanalen och ΔTr representerar den tid som krävs för att cellen ska återhämta sig. (C) Verklig strömpuls från en celltransiteringshändelse. (D) Experimentellt arbetsflöde: (1) celler suspenderas i PBS och (2) drivs genom mikrofluidikanordningen med konstant tryck. När cellerna passerar den mikrofluidiska kanalen mäts (3) strömpulser med hjälp av datainsamlingshårdvara. (4) Strömpulserna analyseras för att extrahera flera encelliga mekaniska egenskaper. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Bild 2: Översikt över enhetstillverkning . (A) Negativa huvudformar är (1) tillverkade med fotolitografi. (2) PDMS gjuts sedan på de negativa huvudformarna. (3) De gjutna enheterna är tärnade, med inlopps- och utloppshål stansade. (B) Samtidigt är glasskivor (1) mönstrade för att tillverka metallelektroder. (2) E-strålavdunstning används för att deponera metall på bilden, följt av en (3) lyftprocess för att avlägsna överskott av metall och lämna efter sig de önskade metallelektroderna. (C) PDMS-anordningen och glas med metallelektroder binds sedan samman med hjälp av syreplasma för att slutföra tillverkningsprocessen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Databehandling och analys . (A) Råströmsdata (vänster) förbearbetas (höger) genom att använda en rektangulär utjämningsfunktion och lågpassfilter, följt av omsampling till en lägre samplingsfrekvens. Baslinjeströmsignalen är därefter försedd med asymmetriska minsta kvadrater som utjämnar26. (B) Tidpunkterna i början och slutet av varje subpuls identifieras som lokala minimi- respektive maximivärden i differenssignalen ∂ I/∂t (vänster). För varje subpuls bestäms bredden Δt av den förflutna tiden mellan start och slut, och amplituden ΔI bestäms av medelskillnaden mellan den uppmätta strömmen och baslinjeströmmen. De extraherade subpulsdata kan representeras som en rektangulariserad signal (höger); Varje subpuls motsvarar ett segment i enhetens geometri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Exempel på framgångsrika och bristfälliga resultat under tillverkning och experiment . (A) Bilder av PDMS-avgjutningar av sammandragningssegment tagna från två olika negativa huvudformar. (i) är ett exempel på en vältillverkad kanal med släta sidoväggar, väldefinierad geometri och inga märkbara defekter. (ii) är ett exempel på en dåligt tillverkad kanal med betydande defekter i sammandragningskanalen (skisserad i röda rektanglar), som antingen helt eller delvis skulle hindra partikelflödet (skalstänger = 150 μm). (B) Exempel på filtrerade strömpulser som genereras av "NPS.m" under datainsamlingen. i) Exempel på en lyckad cellhändelse, där en cell passerar kanalen som avsett. ii) Exempel på strömpulser som produceras när enheten är "igensatt". I detta fall hindrar skräp cellflödet i kanalens andra por. Detta leder till cellhändelser som visas "avskurna" (indikeras av den röda linjen) halvvägs genom den andra storlekspulsen. Minskningarna i strömmen (indikeras av de blå linjerna) efter "avskärningen" orsakas av partiklar (skräp eller celler) som byggs upp runt blockeringen och därför blockerar en större del av strömflödet. En skarp nedåtgående spik i strömmen (indikerad av den gröna rektangeln) återspeglar en partikel som kan passera runt blockeringen och därför bara tillfälligt blockera en större del av strömmen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Exempel på wCDI och cellåtervinning mellan olika tillstånd. (A) wCDI-fördelning mellan två bröstepitelcellinjer, icke-maligna MCF-10A och maligna MCF-7. B) wCDI av MCF-10A eller MCF-7, där varje celltyp var obehandlad, behandlad med Lat-A och behandlad med Lat-B. (C) WCTI-fördelning mellan två primära humana bröstepiteliala underlinjer: myoepitelceller (MEP) och luminala epitelceller (LEP). (D) Återställningstider som motsvarar de fyra villkoren mellan A, B och C. Återställningstiderna var inslagna för att underlätta visningen. Alla förhållanden hade en provstorlek på n = 99 celler. Denna siffra återges med tillstånd från Kim et al.2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 1: Exempel på enhetsmatriser för både mikrofluidiska kanaler och elektroder. Båda bilderna, representerade som transparensmaskerna, bör utformas med vitt (som representerar transparent) i de regioner där fotoresisten kommer att utsättas för UV och svart i de regioner där den kommer att blockeras från UV-exponering. (A) En uppsättning mikrofluidiska kanaler, med två parallella kanaler per "enhet" (rektangel), anordnade på en 3 i Si-skiva. Enheten längst till höger är märkt som "ref" och är konstruerad, enligt beskrivningen i steg 1.3, för användning vid kalibrering. (B) En uppsättning elektroder, med två elektroder per anordning, så att båda kanalerna i en anordning från (A) kommer att rikta sig över varje elektrodkonstruktion från (B). Denna matris arrangerades för en 2 i x 3 i glasskiva. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Scheman som illustrerar regioner i elektrodkonstruktionen och hur man etsar bort guld korrekt (steg 2.1.2.3). Det översta lagret av guld måste tas bort från mätelektroderna, annars kommer biofouling och elektrolys att inträffa under mätningen. Guld bör dock förbli på kontaktdynorna, eftersom det mjuka guldet ger en överlägsen elektrisk anslutning till stiften på pogo-stiftkontakten. (A) Schematisk som visar hur den mikrofluidiska kanalen (i blått) skär med den mönstrade metallen (svart). Som indikerat är metallen vinkelrätt mot den mikrofluidiska kanalen och direkt under den mätelektroderna, där guld måste etsas, medan de stora metallrektanglarna på sidan av kanalen är kontaktdynorna, där guld måste förbli. (B) Schematisk som visar var guldetsning ska appliceras på den mönstrade metallen, liksom var den inte ska. Den gröna regionen indikerar var etsning är nödvändig, den gula regionen indikerar var etsning kan inträffa och kommer inte att påverka enhetens effektivitet, och det röda området indikerar var guld inte får etsas. (C) Schema som visar en typisk, framgångsrikt etsad enhet. Gult indikerar regioner där guld fortfarande finns, och grått indikerar regioner där platinaskiktet har exponerats. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: Bilder av framgångsrikt och dåligt tillverkade sammandragningskanaler. (A) Bilder av sammandragningskanaler på negativa huvudformar från två enskilda Si-skivor. (i) Ett exempel på en vältillverkad huvudform som skulle producera en idealisk PDMS-kanal som den som visas i figur 4Ai. (ii) Ett exempel på en dåligt tillverkad huvudform, som användes för att skapa PDMS-kanalen som visas i figur 4Aii. De regioner som beskrivs i röda rektanglar motsvarar de defekter som anges i figur 4Aii, vilket visar överföringen av defekter från huvudformen till PDMS-mikrokanalerna (skalstänger = 150 μm). (B) Bilder av tvärsnittet av PDMS-sammandragningskanaler, som visar höjden och bredden på olika formar. Dessa tvärsnitt förvärvades genom att skära PDMS-sammandragningskanalen vinkelrätt mot flödesriktningen. (i) Ett exempel på en vältillverkad PDMS-form skapad med hjälp av skivan som visas i (Ai), som visar släta vertikala sidoväggar. (ii) Ett exempel på en dåligt tillverkad PDMS-form skapad med hjälp av skivan som visas i (Aii) som visar snedställda sidoväggar (skalstänger = 20 μm). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 4: Exempel på en sammanfallande cellhändelse (producerad när mer än en cell passerar kanalen samtidigt). Signalen behandlades enligt steg 5.1.1-5.1.3 i avsnitt 5 i protokollet. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 5: Förhållandet mellan wCDI och den elastiska modulen 20,29,30,31,32,33,34,35. (A) Jämförelse av Jurkat-, MCF7- och MCF10A-celler uppmätta med denna teknik jämfört med mikropipettaspiration. wCDI är omvänt proportionellt mot kortikal spänning. (B) Jämförelse av MCF7- och MCF10A-celler uppmätta med denna teknik jämfört med publicerade AFM-data. (C) Jämförelse av A549- och BEAS-2B-celler uppmätta med denna teknik jämfört med publicerade AFM-data. Över flera celltyper är wCDI omvänt proportionellt mot elastisk modul. Denna siffra har reproducerats med tillstånd från Kim et al.2. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell 1: Exempel på encelliga mekanofenotypningstekniker och hur de jämförs med mekano-NPS. Tekniker listas i ordning efter ökad genomströmning 12,2,36,37. Mekanisk information avser huruvida anordningen kan mäta både de elastiska och viskösa mekaniska egenskaperna hos varje cell. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tilläggstabell 2: Exempel på storleks-, kontraktions- och återställningssegmentbredder för olika cellinjer. MEP och LEP hänvisar till två linjer av primära humana bröstepitelceller, där MEP hänvisar till myoepitelceller och LEP hänvisar till luminala epitelceller 2,8. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tilläggsfil 1: Exempel på AutoCAD-design. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 2: Exempelprotokoll för fotolitografibehandling. Två exempelprotokoll beskrivs för mönstring och bearbetning av fotoresist eller SU-8 epoxi. Den första beskriver tillämpningen av positiv fotoresist på en glasskiva för att fungera som ett offerskikt för elektrodtillverkning. Den andra beskriver appliceringen av SU-8-epoxi på en kiselskiva för att skapa lättnadsstrukturer för gjutning av PDMS-mikrofluidiska kanaler. Dessa protokoll anpassades från MF-321 och SU8 3000 datablad från tillverkaren. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 3: Exempelprotokoll för tunnfilmsdeponering av 75 Å Ti, 250 Å Pt och 250 Å Au med elektronstråleindunstning. Ett exempelprotokoll för att utföra tunnfilmsdeponering av 75 Å Ti, 250 Å Pt och 250 Å Au med hjälp av en elektronstråleindunstare beskrivs. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 4: GERBER-filer Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 5: Schematiska, kort, och PCB-delar listfiler Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 6: MATLAB-kommandoradsgränssnitt. Den här filen innehåller detaljerade instruktioner för databehandling med hjälp av MATLAB-kommandoradsgränssnittet26. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mätning av de mekaniska egenskaperna hos enskilda celler med hjälp av denna mekanofenotypningsteknik består av tre steg: tillverkning av enheter, datainsamling och dataanalys. Inom varje steg finns det anmärkningsvärda aspekter som kan påverka de experimentella resultaten avsevärt. Under enhetstillverkningen är konsekventa kanalgeometrier och enhetlighet mellan enheter avgörande för exakta och repeterbara resultat. Mer specifikt bör sidoväggarna på varje enhet vara relativt släta (bild 4Ai) och kanalhöjderna över replikerade enheter bör vara jämförbara. Alla anordningar med defekter som delvis hindrar cellflödet, särskilt i sammandragningskanalen (figur 4Aii) ska kasseras. Användning av enheter med märkbara defekter i kanalgeometrin kommer att resultera i felaktiga och oreproducerbara resultat. Under datainsamlingen är det viktigt att användaren kan känna igen närvaron av en igensättning i kanalen under datainsamlingen. Ett exempelskript, "NPS.m" (tillgängligt på https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public), visar aktuella mätningar, vilket gör det möjligt för användaren att övervaka kanaltillståndet och celltransiteringshändelser i realtid. Pulser som är karakteristiska för en igensättning visas i figur 4B. En igensättning i sammandragningskanalen som fortfarande tillåter vissa celler att flöda är särskilt viktigt att ta itu med, eftersom celler kommer att uppleva ökad belastning vid obstruktionsplatsen, vilket resulterar i felaktiga wCDI-s. Slutligen, under dataanalys, bör användarna vara noggranna med att välja exakta trösklar som indata för analysalgoritmen. Om tröskelvärdena är för höga kommer programmet inte att identifiera händelser som produceras av mindre celler, vilket snedvrider resultaten och förvränger den uppmätta cellpopulationen.

Utöver dessa kritiska steg finns det ytterligare aspekter av protokollet som kan kräva justering när man studerar olika celltyper eller förhållanden. Till exempel kräver tillämpning av denna teknik på prover som är signifikant mindre än de som tidigare studerats smalare sammandragningskanaler. Tillverkning av smalare kanaler kan kräva dyrare tillverkningsmetoder, såsom elektronstrålelitografi38. Dessutom, eftersom Δ I /I ~ Δ V cell / Δ V-sammandragning (därV-cell ochV-sammandragning är volymerna för den deformerade cellen respektive kanalen), resulterar smalare kanaler i större baslinjemotstånd och minskad SNR19. Slutligen kan smala kanaler öka risken för igensättning, vilket gör experimentellt utförande mer utmanande. Det här problemet kan potentiellt mildras genom att använda fler inloppsfilter.

En begränsning av denna teknik är den statiska sammandragningskanalen, som endast kan tillämpa en enda genomsnittlig stam på en population av celler. För att jämföra deformerbarheten hos celler med olika storlekar, eller för att undersöka en enda cellpopulation vid olika applicerade stammar, måste flera enheter med varierande sammandragningskanalbredder användas. Plattformen är också begränsad av sina PDMS-väggar, vilket begränsar utbudet av styvheter den kan mäta. Till exempel är vissa mycket styva växtceller styvare än PDMS-väggarna som förväntas deformera dem39,40. Dessutom kan det tryck som krävs för att trycka sådana styva partiklar genom sammandragningskanalen övervinna styrkan hos bindningen mellan PDMS och glasskivan, vilket leder till delaminering. Man kan dock tillverka mikrofluidiska kanaler till styvare material som glas eller kisel, för att på så sätt övervinna dessa begränsningar. Trots dessa mindre begränsningar är denna plattform fortfarande idealisk för mekanisk mätning av celler med måttlig genomströmning. I jämförelse med andra metoder, såsom optiska bårar eller AFM, möjliggör denna teknik högre genomströmning. Jämfört med andra mikrofluidiska tekniker med måttlig till hög kapacitet, såsom RT-DC, kan denna teknik undersöka mer biofysiska egenskaper genom att mäta både de viskösa och elastiska egenskaperna hos enskilda celler. Slutligen gör den enkla experimentella installationen, som använder billig elektronik i motsats till komplex optik, denna teknik till en mycket tillgänglig teknik.

Sammantaget har denna mekanofenotypningsteknik ett enormt löfte som ett verktyg för många potentiella studier och applikationer. Det har tidigare applicerats på en mängd olika celltyper, inklusive primära prover, och har visat sin effektivitet vid mätning av effekten av cytoskelett- och kärnkomponenter på cellulära viskoelastiska egenskaper 2,8. Dessutom, eftersom celler förblir livskraftiga efter screening med denna plattform2, har forskare möjlighet att utföra nedströmsanalys. Denna plattform är också idealisk för koppling med uppströms mikrofluidisk cellsortering, vilket lånar sig till applikationer som mätning av cirkulerande tumörceller. Ser vi framåt är denna plattform fortfarande ett konkurrenskraftigt och mångsidigt verktyg för multivariabla mekaniska mätningar av enstaka celler, med tillämpningar för att förstå cellbeteende41, bestämma sjukdomsprogression 42 och övervaka läkemedelssvar43. Utöver grundläggande vetenskaplig forskning har denna teknik också ett stort löfte som ett kliniskt verktyg, särskilt en billig bänkplattform för snabb diagnostisk screening. Dessutom, med tanke på de låga effektkraven och det minimala behovet av provberedning före mätning, är denna teknik särskilt väl lämpad för miljöer med låg resurs, där tillgängliga diagnostiska instrument verkligen behövs44.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

L. L. S innehar amerikanskt patent nr 11,383,241: "Mechano-node-pore sensing", J. Kim, S. Han och L. L. Sohn, utfärdat 12 juli 2022.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av anslag från NIBIB 1R01EB024989-01 och NCI 1R01CA190843-01. A. L. och R. R. stöddes av ett H2H8 Association Graduate Research Fellowship. K. L. C. stöddes av ett National Science Foundation Graduate Research Fellowship och ett Siebel Scholar Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone J.T. Baker 5356-05 Purity (GC)  ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker)
Aluminum Foil n/a n/a
Analog Low-Pass Filter ThorLabs EF504 ≤240 kHz Passband, Coaxial BNC Feedthrough (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0)
Biopsy Punch Integra Miltex 33-31AA-P/25 1mm, Disposable, with Plunger (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25)
Blade n/a n/a
BNC Cable Pomona Electronics 2249-C-12 https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_
medium=cpc&utm_campaign=
Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&utm_term=
&utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ
pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx
mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs
w-EALw_wcB
Cleanroom Polyester Swab Thermo Fisher Scientific 18383 https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383
Current Preamplifier DL Instruments 1211 https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_
id=1419
Custom PCB (w/ components) n/a n/a see Supplemental files 4 and 5
DAQ Terminal Block National Instruments BNC-2120 https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html
DAQ to BNC-2110 cable  National Instruments SHC68-68-EPM https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html
Data Acquisition Board (DAQ) National Instruments PCI-6251 https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html
Dessicator Thermo Fisher Scientific 5311-0250 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250
Female BNC To Banana Plug Adapter Pomona Electronics 72909 https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 89510-186 https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs
Glass Cutter Chemglass CG-1179-21 https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips
Gold Etchant TFA Transene NC0977944 https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944
Hot Plate Thermo Fisher Scientific SP131825 
Isopropyl Alcohol Spectrum Chemical I1056-4LTPL Purity (GC)  ≥99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056)
Metal Hardware Enclosure Hammond Manufacturing EJ12126 https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Purity (GC)  ≥99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561)
MF-321 Developer Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/mf-321/
MICROPOSIT S1813 Positive Photoresist DuPont n/a https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049
Photomask Fineline Imaging n/a Photomask are custom ordered from our CAD designs (https://www.fineline-imaging.com/)
Plain Glass Microscope Slide Fisher Scientific 12-553-5B Material: Soda Lime, L75 x W50 mm, Thickness: 0.90–1.10 mm 
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001 https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/
Plastic Petri Dish Thermo Fisher Scientific FB0875712 100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712)
Pressure Controller Fluigent MFCS-EZ https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/
Pressure Controller Software Fluigent MAESFLO
Programming & Computation Software MATLAB R2021b for data acquisition and analysis (https://www.mathworks.com/products/matlab.html)
PTFE Tubing Cole Parmer 06417-31 0.032" ID x 0.056" (https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731)
Scepter 2.0 Handheld Automatic Cell Counter Millapore Sigma PHCC20060 https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060
Silicon Wafer Wafer World 2885 76.2 mm, Single Side Polished (https://www.waferworld.com/product/2885)
Spin Coater n/a n/a
SU-8 3025 Negative Photoresist Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/su-8-2000/
SU8 Developer Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/su-8-developer/
Sygard 184 Polydimethlysiloxane Dow Chemical 4019862 https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Tape Scotch 810-341296 https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid=
Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO
2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm
vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH
VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB
Titanium, Platinum, Gold n/a n/a
Triple Output Power Supply Keysight E36311A https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653
UV Mask Aligner Karl Suss America MJB3 Mask Aligner 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pegoraro, A. F., Janmey, P., Weitz, D. A. Mechanical properties of the cytoskeleton and cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (11), 022038 (2017).
  2. Kim, J., et al. Characterizing cellular mechanical phenotypes with mechano-node-pore sensing. Microsystems & Nanoengineering. 4, 17091 (2018).
  3. Mierke, C. T. Bidirectional mechanical response between cells and their microenvironment. Frontiers in Physics. 9, 619 (2021).
  4. Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, and metastasis: The force journey of a tumor cell. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1), 113-127 (2009).
  5. Nia, H. T., Munn, L. L., Jain, R. K. Physical traits of cancer. Science. 370 (6516), (2020).
  6. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  7. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: The role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  8. Li, B., et al. Mechanical phenotyping reveals unique biomechanical responses in retinoic acid-resistant acute promyelocytic leukemia. iScience. 25 (2), 103772 (2022).
  9. Kozminsky, M., Sohn, L. L. The promise of single-cell mechanophenotyping for clinical applications. Biomicrofluidics. 14 (3), 031301 (2020).
  10. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic force microscopy in characterizing cell mechanics for biomedical applications: A review. IEEE Transactions on Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  11. Wottawah, F., et al. Optical rheology of biological cells. Physical Review Letters. 94 (9), 1-4 (2005).
  12. Darling, E. M., Di Carlo, D. High-throughput assessment of cellular mechanical properties. Annual Review of Biomedical Engineering. 17 (1), 35-62 (2015).
  13. Carey, T. R., Cotner, K. L., Li, B., Sohn, L. L. Developments in label-free microfluidic methods for single-cell analysis and sorting. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 11 (1), 1529 (2019).
  14. Bagnall, J. S., et al. Deformability of tumor cells versus blood cells. Scientific Reports. 5, 18542 (2015).
  15. Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
  16. Otto, O., et al. Real-time deformability cytometry: On-the-fly cell mechanical phenotyping. Nature Methods. 12 (3), 199-202 (2015).
  17. Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (20), 7630-7635 (2012).
  18. Guck, J., Chilvers, E. R. Mechanics meets medicine. Science Translational Medicine. 5 (212), 3-6 (2013).
  19. Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing: A robust, high-dynamic range method for detecting biological species. Lab on a Chip. 13 (7), 1302-1307 (2013).
  20. Carbonaro, A., Sohn, L. L. A resistive-pulse sensor chip for multianalyte immunoassays. Lab on a Chip. 5 (10), 1155-1160 (2005).
  21. Saleh, O. A., Sohn, L. L. Direct detection of antibody-antigen binding using an on-chip artificial pore. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (3), 820-824 (2003).
  22. Saleh, O. A., Sohn, L. L. An artificial nanopore for molecular sensing. Nano Letters. 3 (1), 37-38 (2003).
  23. Saleh, O. A., Sohn, L. L. Quantitative sensing of nanoscale colloids using a microchip Coulter counter. Review of Scientific Instruments. 72 (12), 4449-4451 (2001).
  24. DeBlois, R. W., Bean, C. P. Counting and sizing of submicron particles by the resistive pulse technique. Review of Scientific Instruments. 41 (7), 909-916 (1970).
  25. Li, B., et al. Evaluating sources of technical variability in the mechano-node-pore sensing pipeline and their effect on the reproducibility of single-cell mechanical phenotyping. PLoS ONE. 16 (10), 0258982 (2021).
  26. Zhang, Z. M., Chen, S., Liang, Y. Z. Baseline correction using adaptive iteratively reweighted penalized least squares. Analyst. 135 (5), 1138-1146 (2010).
  27. Alibert, C., Goud, B., Manneville, J. B. Are cancer cells really softer than normal cells. Biology of the Cell. 109 (5), 167-189 (2017).
  28. Fujiwara, I., Zweifel, M. E., Courtemanche, N., Pollard, T. D. Latrunculin A accelerates actin filament depolymerization in addition to sequestering actin monomers. Current Biology. 28 (19), 3183-3192 (2018).
  29. Saleh, O. A. A novel resistive pulse sensor for biological measurements. , Princeton University. Princeton. PhD Thesis (2003).
  30. Dokukin, M. E., Guz, N. V., Sokolov, I. Quantitative study of the elastic modulus of loosely attached cells in AFM indentation experiments. Biophysical Journal. 104 (10), 2123-2131 (2013).
  31. Li, Q., et al. Probing the elasticity of breast cancer cells using AFM. 13th International Conference on Biomedical Engineering. IFMBE Proceedings. Lim, C. T., Goh, J. C. H. 23, Springer. Berlin, Heidelberg. 2122-2125 (2009).
  32. Rother, J., et al. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open Biology. 4 (5), 140046 (2014).
  33. Li, Q., et al. AFM indentation study of breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (4), 609-613 (2008).
  34. Xu, C., et al. Elasticity measurement of breast cancer cells by atomic force microscopy. Proc. SPIE 9230. Twelfth International Conference on Photonics and Imaging in Biology and Medicine. (PIBM 2014). 92300, (2014).
  35. Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 84 (3), 2071-2079 (2003).
  36. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic force microscopy in characterizing cell mechanics for biomedical applications: A review. IEEE Transactions on Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  37. Urbanska, M., et al. A comparison of microfluidic methods for high-throughput cell deformability measurements. Nature Methods. 17, 587-593 (2020).
  38. Hill, R. T., Chilkoti, A. Surface Patterning. Biomaterials Science: An Introduction to Materials: Third Edition. , Elsevier Academic Press. NY. 276-301 (2013).
  39. Wang, Z., Volinsky, A. A., Gallant, N. D. Crosslinking effect on polydimethylsiloxane elastic modulus measured by custom-built compression instrument. Journal of Applied Polymer Science. 131 (22), 41050 (2014).
  40. Gibson, L. J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).
  41. Stephens, A. D., Banigan, E. J., Adam, S. A., Goldman, R. D., Marko, J. F. Chromatin and lamin a determine two different mechanical response regimes of the cell nucleus. Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1984-1996 (2017).
  42. Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force microscopy of nonadherent cells: A comparison of leukemia cell deformability. Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
  43. Evers, T. M. J., Holt, L. J., Alberti, S., Mashaghi, A. Reciprocal regulation of cellular mechanics and metabolism. Nature Metabolism. 3 (4), 456-468 (2021).
  44. Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing enables label-free surface-marker profiling of single cells. Analytical Chemistry. 87 (5), 2988-2995 (2015).

Tags

Bioengineering utgåva 190
Mechano-Node-Pore Sensing: En snabb, etikettfri plattform för encells viskoelastiska mätningar med flera parametrar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lai, A., Rex, R., Cotner, K. L.,… More

Lai, A., Rex, R., Cotner, K. L., Dong, A., Lustig, M., Sohn, L. L. Mechano-Node-Pore Sensing: A Rapid, Label-Free Platform for Multi-Parameter Single-Cell Viscoelastic Measurements. J. Vis. Exp. (190), e64665, doi:10.3791/64665 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter