Abstract
Reportermuizen zijn op grote schaal gebruikt voor de lokalisatie van de expressie van gerichte genen observeren. Dit protocol richt zich op een strategie om een nieuwe transgene reporter muismodel vast te stellen. We kozen te visualiseren interleukine (IL) 22 genexpressie omdat cytokine heeft belangrijke activiteiten in de darm, waar het bijdraagt aan weefsel beschadigd door ontsteking herstellen. Reportersystemen bieden grote voordelen boven andere werkwijzen voor het identificeren producten in vivo. In het geval van IL-22, had andere studies eerste geïsoleerde cellen uit weefsels en vervolgens opnieuw gestimuleerde cellen in vitro. IL-22, die normaal wordt uitgescheiden, werd opgesloten in cellen met een geneesmiddel, en intracellulaire kleuring werd gebruikt voor het visualiseren. Deze werkwijze identificeert cellen die in staat is IL-22, maar niet bepalen of ze dat deden in vivo. De reporter ontwerp omvat het inbrengen van een gen voor een fluorescerend eiwit (tdTomato) in de IL-22-gen in dergelijke way dat het fluorescerende eiwit kan worden uitgescheiden en derhalve blijft opgesloten in de cellen in vivo. Fluorescerende producenten kunnen vervolgens worden gevisualiseerd in weefselcoupes of door ex vivo analyse door middel van stromingscytometrie. De eigenlijke bouwproces voor de reporter opgenomen recombineering een bacterieel kunstmatig chromosoom dat de IL-22-gen bevatte. Deze gemanipuleerde chromosoom werd vervolgens in het muis genoom. Homeostatische IL-22 reporter expressie werd waargenomen in verschillende muizenweefsels, waaronder de milt, thymus, lymfeklieren, Peyer's patch en darmen, met stroomcytometrie analyse. Colitis werd geïnduceerd door T-cellen (CD4 + CD45RBhigh) overdracht en reporter expressie werd gevisualiseerd. Positieve T cellen werden eerst in de mesenterische lymfeklieren en vervolgens geaccumuleerd zij in de lamina propria van de distale dunne darm en colon weefsel. De strategie van het gebruik van BAC's gaf goede-fidelity reporter uitdrukking in vergelijking met IL-22 expressie en het is eenvoudiger dan knock-in procedures.
Introduction
Celtype-specifieke expressie van reportergenen nuttig om cellen actief expressie het doelwit weefsels onder homeostatische en verstoorde staten identificeren. Het staat ook voor de zuivering van deze cellen die levensvatbaar blijven hun andere eigenschappen te bestuderen. Reportermuizen zijn gebruikt in het ophelderen van het werkingsmechanisme van bepaalde cytokines, transcriptiefactoren en regulerende elementen. Previous strategieën 1, 2, 3 hebben grotendeels gebruikt kloppen de reporter in het doel-locus in de muis chromosoom, een tijdrovende en kostbare procedure. Dus een eenvoudiger werkwijze voor het genereren van reportermuizen gewenst.
Cytokinen zijn een brede klasse van kleine, uitgescheiden eiwitten / peptiden die immuunreacties door middel van intercellulaire signalering reguleren. Interleukine 22 (IL-22) is een cytokine met vele gerapporteerde activiteiten, zoals barrière functies, weefselherstel, en ontsteking 4. Alhoewel IL-22 werd oorspronkelijk ontdekt als een T-celproduct 5, vervolgrapporten toonde de expressie ervan in natural killer (NK) cellen bij de mens en muizen 6 7 en in andere klassen van lymfocyten aangeboren 8. Ondanks uitgebreid observatie van IL-22-producerende cellen visualisatie van IL-22 voorheen ex vivo stimulatie en permeabilisatie vlekken met antilichamen. Daarom zouden nieuwe IL-22 reportermuizen bijzonder nuttig om de functie van IL-22 in homeostatische en pathogene processen onderzoeken.
Hier hebben we een vereenvoudigde reporter transgene muismodel voor de IL-22-producerende cellen te observeren in vivo en in vitro. Met behulp van een BAC recombineering methode 9, we ingevoegd tdTomato de cDNA sequentie met poly A signaal fragmenten in de IL-22 locons en vervangen exon 1. De andere onvertaalde regio, exons en regulatoire elementen werden niet verstoord, want we willen de natuurlijke regulatie van IL-22 zo goed mogelijk na te bootsen. De plaats van insertie reporter verstoort de signaalsequentie, resulterend in de accumulatie van de reporter in de cellen, in tegenstelling tot IL-22 zelf, die snel wordt uitgescheiden. Deze nieuwe werkwijze kan ook worden toegepast voor het genereren van reportermuizen voor andere uitgescheiden eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dieren kregen de juiste zorg in overeenstemming met de in de Guide 2011 voor de zorg en het gebruik van het Laboratorium Comité Dieren van Frederick National Laboratory for Cancer Research experimentele procedures.
1. Generatie van IL-22-tdTomato Reporter muizen door BAC recombineering
OPMERKING: De muizen moeten onbewust en niet bewegen in reactie op een schadelijke prikkel. Steriliseer de chirurgische gebied met 70% ethanol en steriliseer alle chirurgische instrumenten met een glazen kraal sterilisator.
- Zuiver BAC DNA (RP23-401E11, lengte kloon 228.391 bps) met een alkalische extractiewerkwijze 10, 11. Kenmerkend zijn voor de BAC-kloon door Spel vertering van 5 ug van RP23-401E11 om de juiste omvang van de target-gen te bevestigen. LET OP: De BAC DNA werd verteerd in 14 fragmenten.
- Plaats de TdTomato reportergen in de NotI / SalI-plaats van de PLD53SC-A-GFP-B shuttlevector11 en vervang het GFP-gen in dezelfde plaats. Dan, met BAC RP23-401E11 als een matrijs, versterken de homologie boxen (A en B) aan de eerste vertaalde exon van IL-22 (exon 1) door PCR (95 ° C 2 min, 30 cycli van 95 ° C gedurende 30 sec, 55 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 30 sec, en een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 min). In een 50 gl PCR reactiesysteem, voeg 50 ng (1 ul) van BAC DNA, 0,5 pl van primers (10 pM), 40 pl PCR Supermix high fidelity en 8 pi H2O
OPMERKING: De primers voor de A- en B-boxen zijn: Een doos Forward: 5'-T GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG en omgekeerde: 5'- CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC; B box Forward: 5'-G TTAATTAA CTGCCCGTCAACA en Reverse: 5'-T GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10. Het plaatsen van de restrictie-enzymen (Asc I en Pac I) zijn onderstreept. - Ligeren 500 ng Ascl-digestie A en 500 ng PacI gedigereerd B Fragments in 50 ng PLD53SC-ATB (tdTomato) vector bij 16 ° C gedurende 1 uur.
- Transformeer de gezuiverde PLD53SC ATB-vector in BAC-competente cellen 11 en kweken ervan op Luria-Bertani (LB) agarplaten met chlooramfenicol (20 ug / ml) en ampicilline (30 ug / ml) bij 37 ° C. Pick 2-3 kolonies van co-integratie van de Ch / Amp meester-platen.
- Inoculeer elke kolonie in 1 ml LB aangevuld met 20 ug / ml chlooramfenicol en incubeer ze gedurende 1 uur bij 37 ° C en 225 rpm. Spread 100 ul van elk mengsel op een LB-agarplaat (10 g pepton 140, 5 g gistextract, 12 g agar en 1 L water, pH 7,5) aangevuld met chlooramfenicol en 4-4,5% sucrose. Incubeer de kweek gedurende de nacht bij 37 ° C.
- Pick zowel grote als kleine kolonies en replate ze op twee LB-agar platen met chlooramfenicol. Vervolgens blootstellen de platen al dan niet met UV licht gedurende 30 seconden en kies de UV-gevoelige kolonies voor verdere analyse.
- Identificeer de gewijzigde BAC DNA door PCR met behulp van tdTomato / IL-22 heterozygote primer (Forward: 5 'ACT TGT GCG ATC TCT Gat GGT; Keerzijde: 5' AAT TGT CGG BGA TGT CGG C). De thermocycler omstandigheden zijn: 95 ° C gedurende 2 min; 30 cycli van 95 ° C gedurende 30 sec, 56 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 30 seconden; en een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten.
- Bevestigt de sequentie van het gemodificeerde gebied van de BAC BAC door directe sequentiebepaling van grote prep BAC DNA 12.
- Verdoven een ontvanger muis met een dosering van 0,25% tribroomethanol in de peritoneale holte bij het implanteren van de micro-injectie zygoten in pseudo-zwangere C57BL / 6c muizen.
- Lineariseren de IL-22-tdTomato BAC construct (10 ug) door digestie met 5 ui restrictie endonucleasePi-Sce I in 100 gl van het reactiesysteem en microinject gelineariseerde BAC DNA in bevruchte eieren van C57BL / 6 vrouwtjes bij de pronucleaire stadium 13. screen de transgene muizen door Southern blot analyse van DNA geïsoleerd uit staartpuncties volgens standaardprocedures.
2. Single-cell Bereiden uit milt, thymus, lymfeklieren en Patch Peyer's
LET OP: IL-22-tdTomato reporter muizen werden bij het National Cancer Institute (NCI, Frederick, MD) gehandhaafd. De euthanasie methode voldoet aan de meest recente AVMA richtsnoeren inzake euthanasie. Alle muizen werden gedood met behulp CO 2 inhalatie 14.
- Euthanaseren een IL-22-tdTomato muis in een CO 2 kamer en zet het op een schone pad. Steriliseer de buik huid door het sproeien van 70% alcohol en snijd hem open. Verwijder de milt in de linker flank en de thymus achter het borstbeen.
- Om de mesentericlymph knooppunten (gelegen in het mesenteriale weefsel) en patches Peyer's (small lymphoidnodules de hele ileum gebied van de dunne darm) oogsten, neem de parelwitte mesenteriale knooppunten dicht bij tHij wand van de dunne darm met behulp ontleden pincet met fijne punt getande tips eerst en verwijder vervolgens de hele dunne darm en dikke darm uit het lichaam. Vind de verlengde ovalen vlekken (plaques van Peyer) langs de darm en snijd ze met een schaar. Stamp deze lymfoïde weefsels (lymfeklieren en plaques van Peyer) individueel tussen twee matte glijdt in een enkele-celsuspensie in PBS / 1% foetaal runderserum (FBS) buffer op ijs.
- Gehakt de milt of thymus weefsels met dezelfde werkwijze als in stap 2,2. Centrifugeer de milt suspensie gedurende 8 min bij 500 xg en 4 ° C. Voeg 1 ml ACK lysisbuffer per milt de celpellets.
- Meng goed en laat ze staan voor 1 min. Voeg 9 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) buffer aan elk monster. Spin door centrifugatie gedurende 8 minuten bij 500 xg en 4 ° C om de rode bloedcellen te verwijderen.
OPMERKING: ACK lyserende buffer niet toe te voegen aan de thymus cellen. - Resuspendeer de resulterende leukocyten in 5 ml PBS en pass de cellen door een 100 um zeef cel. Verzamel de celpellets door centrifugatie bij 500 xg gedurende 8 minuten.
- Resuspendeer de cellen in 5 ml RPMI media of FACS buffer en tel de levensvatbare cellen met behulp van 0,4% trypan blauwe kleurstof / PBS oplossing.
3. Isolatie van intra-epitheliale lymfocyten en Lamina Propria Cellen uit de darmen
- Open de buikhuid als in stap 2,1, snijd de dunne darm van duodenum (naast de maag) te ileum (nabij de appendix), en de hele dikke darm, recht boven de anus. Verwijder de extra vet- en mesenteriale weefsel met behulp van een tang. Zet de darmen onmiddellijk in ijskoude PBS.
- Zoeken plaques van Peyer (kleine ruwe knobbeltjes) langs het distale gebied van de dunne darm. Verwijder de massa behulp van een tang andopen de darm lengte met een schaar. Spoel de darm met 10 ml ijskoude PBS.
- Incubeer de weefsels in 20 ml pre-digestie buffer (5 mM EDTAen 1 mM dithiothreitol in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)) gedurende 30 min bij 37 ° C onder langzame rotatie (50 tpm) in een shaker. Na elk van 2 incubatie, verwijder de epitheliale cellaag, die het intra-epitheliale lymfocyten (IELs), door de intense vortex (30 sec bij 12.000 rpm) en passeren alle weefsels door een 100 um cel zeef.
- Voeg 20 ml EDTA nieuwe oplossing voor het weefsel voor de tweede incubatie gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Passeer de IEL fracties door een 100 um cel zeef en bundelen ze met de vorige fracties. Houd de overblijvende darm fragmenten op ijs in stap 3,9 te behandelen.
- Centrifugeer de samengevoegde fracties IEL bij 800 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Was de samengevoegde IEL fracties met 10 ml HBSS / 5% FBS en draaien ze neer gedurende 5 min bij 800 xg en 4 ° C.
- Resuspendeer de cellen in 8 ml 44% colloïdaal silica drager 15 en die met 5 ml van 67% colloïdaal silica medium. Centrifugeer de 44% / 670,5% celmengsel gradiënt gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en 1500 x g.
- Verzamel de IEL cellen van de band op het grensvlak. Verwijder eerst de bovenste laag van het supernatant (ongeveer 5 ml) onder toepassing van 1 ml pipet. Dan, oogst IELs op het grensvlak van de colloïdale silica medium verloop.
- Was de IELs door toevoeging van 10 ml van RPMI medium. Draai de cellen af gedurende 5 min bij 800 xg en 4 ° C. Resuspendeer de IELs in 5 ml RPMI voor stap 3.15.
- Voor de isolatie van de lamina propria lymfocyten (LPLs), gehakt het darmweefsel fragmenten uit stap 3.4 in kleine stukjes met een schaar (1 mm) en verteren de stukken met 10 ml digestiebuffer (0,05 g collagenase, 0,05 g DNaseI, en 0,3 g dispase II in RPMI / 5% FBS) gedurende 15-20 min bij 37 ° C.
- Filtreer het mengsel door een 70 um cel zeef. Het doorstroomkanaal supernatant bevat het LPL vrijgegeven.
- Volledig verteren de darm fragmenten door herhalen van de stappen 3,9-3,10 (normaal, moeten ze3 keer herhaald). Elke keer, zwembad de supernatanten die de LPLs.
- Verzamel de cellen door centrifugatie gedurende 5 minuten bij 1500 xg en kamertemperatuur en resuspendeer de pellets in RPMI / 5% FBS. Geef ze door een 40 um cel zeef.
- Resuspendeer de celpellets in 10 ml van de 40% fractie van een 40:80 colloïdale silica middelmatige niveauverschillen en deze wordt vervolgens op 5 ml van de fractie 80% in een 15 ml buis.
- Voer de dichtheidsgradiënt scheiding door centrifugatie gedurende 20 minuten bij 1500 xg en 15 kamertemperatuur.
- Verzamel de LPLs, zoals beschreven in stap 3.7. Was ze eenmaal met 10 ml PBS en resuspendeer de pellets in 1 ml PBS / 1% FBS buffer of RPMI medium.
- Tel het aantal levensvatbare cellen (zowel IELs en LPLs) met behulp van 0,4% trypan blauwe kleurstof / PBS-oplossing.
4. Expressie van IL-22-tdTomato in Colitis
- Bereid één miltcelsuspensies van IL-22-TdTomato muizen bij een concentratie van 1 x 10 <sup> 7 cellen / ml in steriel PBS, zoals beschreven in stap 2,1-2,4.
- Zuiver het CD4 + T-cellen met de muis CD4 Cell Negative Isolation methode 10. Labelen met anti-CD4-APC (kloon RM4-5, 0,5 gl / 1 x 10 6 cellen in PBS / 1% FBS buffer) en anti-CD45RB-FITC (kloon 16A, 0,5 gl / 1 x 10 6 cellen in PBS / 1% FBS buffer) door incubatie bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
- Draai de cellen af gedurende 5 min bij 500 xg en 4 ° C. Was de cellen met 2 ml PBS / 1% FBS buffer en resuspendeer ze in 1 ml PBS / 1% FBS vlekken buffer.
- Voer het gelabelde T-cellen op een flowcytometrie machine 16. Poort de cellen op een T-celpopulatie en sorteer CD4 + CD45RB high dubbel-positieve cellen (het gedetecteerd bij 488 nm en 633 nm lasers golflengte).
- Oogst de gesorteerde cellen door centrifugatie gedurende 5 minuten bij 500 xg en 4 ° C. Resuspendeer de celpellets in steriele PBS buffer met 1 x 10 6 6) in het peritoneum ofeach RAG1 - / - ontvanger muis.
- Offer de ontvangende muizen onder CO 2 op verschillende tijdstippen. Oogst de mesenterische lymfeklieren en de dunne en dikke darm, zoals beschreven in stappen 2,1 en 2,2. Zet elke mesenterische lymfeklieren en snijd open darm (papier / darm / paper sandwich) in 4% paraformaldehyde (PFA, behandelen onder een zuurkast) 's nachts naar de weefsels te repareren. Vervang de PFA met 18% sucrose voor 16-24 uur en dan bevriezen de weefsels voor het snijden.
- Gebruik de cryostaat machine om het weefsel 17, 18, 19 gesneden. Verwarm de weefselcoupes tot kamertemperatuur gedurende ongeveer 60 minuten en plaats ze in aceton gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Droog bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 5 minuten.
- Voeg FBS in overmaat, verwijderen met een pipet en voeg anti-RFP bij een 1: 200 verdunning in 0,1% BSA / 1x PBS. Incubeer het antilichaam bij 37 ° C gedurende 60 minuten.
- Spoel de secties in 1x PBS gedurende 10 min en de overeenkomstige secundaire antilichaam (geit anti-konijn 568) van toepassing op het weefsel, verdund 1: 300 in 1% BSA / 1x PBS, gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Spoel de dia's in 1x PBS gedurende 10 minuten, veeg ze droog en dekglaasjes toe te voegen.
- Visualiseer alle monsters met een fluorescentiemicroscoop onder consistente verlichting (RFP: excitatie filter 540-580 nm) met behulp van de 40x objectief.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een muis-IL-22 reporter transgen is gemaakt met recombineering een bacterieel kunstmatig chromosoom die het IL-22 locus wijzigen. Figuur 1 een schema van pBACe3.6 vector die het gen sacBII een positieve selectiemerker en chlooramfenicol antibioticumresistentiegen 11. Na de introductie tdTomato in exon 1, werd de signaalpeptidesequentie verstoord, zie figuur 2. Aldus werd de tdTomato reporter opgesloten in de IL-22 tot expressie brengende cellen, waardoor de detectie en isolatie van flowcytometrie. De homozygote muizen werden gefokt uit grondlegger lijnen en gescreend door PCR en ze niet terugkruising vereisen om nakomelingen met een genetische identiteit te bereiken, zoals vereist is in de gebruikelijke knock-strategie. Om de betrouwbaarheid van de IL-22 reporters testen in vitro -generated splenocyten werden gekweekt onder Th22 of neutrale omstandigheden.
Figuur 1: Overzicht van de website van de pBACe3.6 vector. pBACe3.6 wordt gekenmerkt door met chlooramfenicol resistentie en een sacBII gen als een positieve selectiemerker. Tijdens recombinatie, de gewenste klonen sucrose-resistente via hun expressie de sacBII gen en kunnen groeien op sucrose-bevattend medium, terwijl de negatieve BAC kolonies sucrose gevoelig.
Figuur 2: Schematische weergave van de gemodificeerde RP23-401E11 BAC kloon. Een tdTomato reportergen werd ingebracht in de Il-22 locus, die IL-22 en regulerende elementen in een murine bacterieel kunstmatig chromosoom (BAC RP23-401E11) omvat, met behulp recombineering technologie. Door homologe recombinatie, de sequentie van het signaalpeptide van IL-22 in de BAC werd verstoord en exon 1 van IL-22 werd vervangen door tdTomato reportergen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Identificatie van IL-22 reporters in splenocyten gekweekt in vitro. CD4 T-cellen werden gezuiverd uit de milt en vervolgens gestimuleerd met anti-CD28; anti-CD3 (neutrale conditie); of anti-CD3, anti-CD28, anti-IFNƳ, anti-IL4, IL-6, TGF-β, en 6-Formylindolo (3,2-b) carbazool (FICZ) gedurende 5 dagen. IL-22-tdTomato werd geanalyseerd door flow cytometrie (bovenste twee) en fluorescentiemicroscopie (onderste twee, schaalbalk: 100 pm). De getallen in de kwadranten geven het percentage van CD45 + cellen.target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Visualisatie van IL-22-producerende cellen in verschillende muizenweefsels. Enkelvoudige celsuspensies werden bereid uit de milt, thymus, lymfeklieren, darmen (IEL en LP) en Peyer's patch. Zij werden vervolgens oppervlak gekleurd met FITC-anti-CD3 en onderzocht op expressie tdTomato. MLN: mesenterische lymfeknopen, ALN: axillaire lymfeklieren, PP: Peyer's patch, IEL: intra- epitheliale cellen geisoleerd uit de dunne darm, LP: lamina propria cellen gezuiverd uit de dunne darm. De getallen in de kwadranten geven het percentage van CD45 + cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Lokalisatie van IL-22 reporters tijdens de ontwikkeling van T-celoverdracht colitis. CD4CD45RBHigh T-cellen van IL-22 reporter muizen werden overgebracht in RAG1 - / - muizen, en de tdTomato signalen werden beoordeeld door immunohistochemie in de verschillende weefsels op verschillende tijdstippen gedurende de ontwikkeling van colitis. De pijlen wijzen naar de IL-22-tdTomato signalen. Schaalbalken = 25 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IL-22 speelt een essentiële rol in de aangeboren afweer en weefsel remodeling. IL-22-producerende cellen zijn geïdentificeerd ex vivo door intracellulaire kleuring. Echter, het blijft moeilijk om IL-22 expressie volgen in situ, in de normale toestand of ontstekingsaandoeningen. Dit protocol beschrijft een nieuwe werkwijze voor een IL-22 reporter muismodel, waardoor we de reporter tot expressie brengen in vivo te lokaliseren ontwikkelen. Het reportergen codeert TdTomato werd in de IL-22 locus op een plaats die de signaalsequentie verstoort. Deze strategie leidt de reporter te raken in de producerende cel, in tegenstelling tot IL-22 die snel wordt uitgescheiden, waardoor visualisatie van de producerende cel. De gemodificeerde IL-22-reporter werd binnen een groot BAC, met als doel het behoud van de regulerende elementen, en daarmee in getrouwheid van expressie van het overeenkomende met die van IL-22. De intestinale weefsels van transgene mice weergegeven homeostatische reporter expressie in CD4 T-cellen en aangeboren lymfocyten in de lamina propria van de dunne darm. In geïnduceerde colitis, CD4 T-cellen tot expressie de reporter in de dikke darm.
De rol van IL-22 bij inflammatoire darmziekte is onduidelijk. De bij de intestinale mucosale afweer en weefselregeneratie, IL-22 in staat tot het opwekken van de productie van beschermend 20, 21, 22 en pro-inflammatoire mediatoren (bijvoorbeeld IL-8) 23, 24. Twee modellen van T-cel aangedreven colitis toonde een toename in IL-22 in het colon, waaronder TCR α - / - muizen 25, 26 en CD45RB hi overdrachtsmodel 27. Vergelijking ontstekingsdarmziekte modellen, IL-22 expressie in de darm is hoger bij een Crohn ziekte modelthan in een model van colitis ulcerosa 21, 24 .Hier transfer CD4CD45RBhi we T-cellen van de reporter muizen in RAG1 - / - ontvangers en bootsen de pathogene proces van de ziekte van Crohn. We vonden dat, voorafgaand aan colitis, werden IL-22 reporters gevisualiseerd in de darm drainerende lymfeklieren (MLN). De signalen vervolgens afgenomen in de MLN en verplaatst naar de darmen, in het bijzonder de distale dunne darm en dubbele punten, de ontwikkeling van colitis. Meest tdTomato reporters zijn gelokaliseerd binnen de lamina propria van de darm mucosa.
Een ander type reporter voor IL-22 is eerder beschreven, waarbij cellen blijvend zodat zij en hun dochters blijven de reporter tot expressie, ook indien transcriptie van IL-22 is verder 28 gekenmerkt. Zoals in onze studie, gut aangeboren lymfocyten werden gekenmerkt onder homeostatische omstandigheden, en in colitis, thij reporter werd gelokaliseerd in T-cellen uit de mesenteriale lymfeknopen het darmweefsel.
De in dit protocol beschreven procedures zouden uiteengezet voor de vaststelling van andere transgene reporter muizen, zoals IL-17, IL-25, en zo verder. Het is echter belangrijk om geschikte BAC-klonen dragen distale regulerende elementen om de betrouwbaarheid van reportergenexpressie verzekeren kiezen, aangezien de transgenen willekeurig geïntegreerd in het muis genoom. De reporter muis maakt de identificatie van cellen die in vivo, en voor de zuivering en karakterisering van levende cellen. We gebruikten tdTomato, een uitzonderlijk helder rood fluorescerend eiwit, zoals een fluorescerende reportergen de verslaggever die geschikt zijn voor levende dieren imaging studies te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
References
- Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).
- Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo. PLoS One. 7, e39750 (2012).
- Kamanaka, M., et al. Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse. Immunity. 25, 941-952 (2006).
- Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22. Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).
- Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9. J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).
- Cella, M., et al. A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity. Nature. 457, 722-725 (2009).
- Sanos, S. L., et al. RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells. Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).
- Spits, H., et al. Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature. Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).
- Mazzucchelli, R. I., et al. Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice. PLoS One. 4, e7637 (2009).
- Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice. Front Immunol. 6, 662 (2015).
- Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication. Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).
- Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments. Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).
- Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B.
- Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats. Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).
- Omata, Y., et al. Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation. Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).
- Kumar, N., Borth, N. Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories. Methods. 56, 366-374 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R.
- Hilbe, W., et al. Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120. Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).
- Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry. Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).
- Wolk, K., et al. IL-22 increases the innate immunity of tissues. Immunity. 21, 241-254 (2004).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).
- Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, de, R, Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells. Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Andoh, A., et al. Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts. Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75, 274-282 (1993).
- Powrie, F. Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).
- Ahlfors, H., et al. IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection. J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).
