Abstract
עכברי Reporter היו בשימוש נרחב כדי לבחון את הלוקליזציה של ביטוי של גנים ממוקדים. פרוטוקול זה מתמקד אסטרטגיה לבסס מודל עכבר כתב המהונדס חדש. בחרנו לדמיין interleukin (IL) ביטוי גנים 22 כי ציטוקינים זה יש פעילויות חשובות במעי, שם הוא תורם לתקן רקמות שנפגעו על ידי דלקת. מערכות Reporter להציע יתרונות משמעותיים על פני שיטות אחרות של זיהוי מוצרי in vivo. במקרה של IL-22, מחקרים אחרים בודדים לראשונה תאים מרקמות ולאחר מכן מחדש עוררו את התאים במבחנה. IL-22, אשר מופרש בדרך כלל, היה לכוד בתוך התאים באמצעות תרופה, והכתים תאיים שימש לדמיין את הדברים. שיטה זו מזהה תאים מסוגלים לייצר IL-22, אבל זה לא לקבוע אם הם עושים כל כך in vivo. עיצוב הכתב כולל החדרת גן חלבון פלואורסצנטי (tdTomato) לתוך גן IL-22 בתוך wa כזהy כי חלבון פלואורסצנטי לא יכול להיות מופרשים ולכן נשארה לכודה בתוך התאים המייצרים in vivo. המפיקים פלורסנט ניתן דמיינו מכן בסעיפים רקמות או על ידי ניתוח vivo לשעבר באמצעות cytometry הזרימה. תהליך הבנייה בפועל עבור הכתב כלולים recombineering כרומוזום בקטריאלי מלאכותי שהכיל את הגן IL-22. כרומוזום מהונדס זה אז הוכנס גנום העכבר. ביטוי כתב ההומיאוסטטית IL-22 נצפה ברקמות עכבר שונות, כולל הטחול, התימוס, בלוטות הלימפה, התיקון של Peyer ומעי, על ידי ניתוח תזרים cytometry. קוליטיס הושר על ידי תאי T (CD4 + CD45RBhigh) העברה, וביטוי כתב היה דמיין. T תאים חיוביים נוכחים ראשונים הבלוטות לימפה mesenteric, ולאחר מכן הם שהצטברו בתוך שכבת הרירית המיוחדת של רקמות מעי גסות הדיסטלי הקטנות. האסטרטגיה באמצעות BACS נתנה ביטוי כתב-נאמנות טובה לעומת IL-22 הבעהשיאון, וזה פשוט יותר מאשר נהלים עקומים.
Introduction
סוג ספציפי ביטוי נייד של גני כתב שימושי כדי לזהות תאים פעילים המבטאים את היעד ברקמות תחת מדינות ההומיאוסטטית ומודאגות. זה גם מאפשר הטיהור של תאים אלה, אשר נשארים קיימא, ללמוד נכסים הנוספים שלהם. עכברי כתב כבר נוצלו הבהרת מנגנון הפעולה עבור ציטוקינים ספציפיים, גורמי שעתוק, ואלמנטים רגולטוריים. אסטרטגיות קודמות 1, 2, 3 הסתמכו בעיקר על דפיקות הכתב לתוך מוקד יעד כרומוזום העכבר, הליך זמן רב ויקר. לפיכך, שיטה פשוטה עבור הדור של עכברי כתב רצויה.
ציטוקינים הם מעמד רחב של חלבונים קטנים, מופרש / פפטידים המווסתים את התגובה החיסונית באמצעות איתות אינטר. Interleukin 22 (IL-22) הוא ציטוקין עם רבים דיווחו פעילויות, כולל מחסום פוnction, תיקון רקמות, ודלקת 4. למרות IL-22 התגלה בתחילה כמוצר T-cell 5, דוחות שלאחר מכן הפגינו ביטויו הרג טבעיים (NK) תאים בבני אדם 6 ועכברים 7 ו בסוגים אחרים של לימפוציטים מולד 8. למרות תצפית נרחבת של תאי-22-ייצור IL, ויזואליזציה של IL-22 בעבר נדרש vivo לשעבר גירוי permeabilization בפני כתמים עם נוגדנים. לכן, רומן IL-22 עכברים הכתב יהיה כלי מאוד שימושי כדי לחקור את הפונקציה של IL-22 בתהליכים ההומיאוסטטית ו פתוגניים.
הנה, פתחנו מודל עכבר כתב מהונדס פשוט לשמור על IL-22-ייצור תאי in vivo ו במבחנה. באמצעות שיטה BAC recombineering 9, הכנסנו את רצף cDNA tdTomato עם פולי שברי אות לתוך loc IL-22לנו והחלפתי אקסון 1. האזורים המתורגמים האחרים, אקסונים, והאלמנטים רגולטוריים לא היו מוטרדים, מאז שהיינו רוצים לחקות את הוויסות הטבעית של IL-22 ככל האפשר. האתר של החדרת הכתב משבש את רצף האות, וכתוצאה מכך הצטברות של הכתב בתוך התאים המייצרים, בניגוד IL-22 עצמו, אשר מופרש במהירות. שיטה חדשה זו יכולה לחול גם על הדור של עכברי כתב חלבונים מופרשים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל החיות קבלו טיפול נאה בהתאם הפרוצדורות המפורטות במדריך 2011 לטיפול ושימוש ועדה בחיות מעבדה של המעבדה הלאומית פרדריק לחקר הסרטן.
הדור 1. של IL-22-tdTomato עכברים Reporter ידי BAC Recombineering
הערה: העכברים צריכים להיות מודעים ואל תזוזו בתגובה לגירוי מזיק. לעקר את אזור הניתוח עם אתנול 70% לעקר את כל כלים כירורגיים באמצעות מעקר חרוז זכוכית.
- לטהר BAC DNA (RP23-401E11, שיבוט באורך 228,391 bps) באמצעות שיטת החילוץ אלקליין 10, 11. לאפיין את שיבוט BAC ידי עיכול SpeI של 5 מיקרוגרם של RP23-401E11 כדי לאשר את הגודל הנכון של גן המטרה. הערה: BAC DNA היה מתעכל ל -14 קטעים.
- הכנס את הגן המדווח tdTomato לתוך האתר לא אני / סאל א 'של וקטור הסעות PLD53SC-A-GFP-B11 ולהחליף את הגן GFP באותו אתר. לאחר מכן, באמצעות BAC RP23-401E11 כתבנית, להגביר את תיבות הומולוגיה (A ו- B) כדי אקסון תורגם לראשונה של Il-22 (אקסון 1) על ידי ה- PCR (95 מעלות צלזיוס 2 דקות; 30 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 ° C למשך 30 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות; ותוסף סופי על 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות). במערכת התגובה 50 μl PCR, להוסיף 50 ng (1 μl) של ה- DNA BAC, 0.5 μl של פריימרים (10 מיקרומטר), 40 μl של איכות גבוהה PCR Supermix, ו -8 μl של H 2 O.
הערה: פריימרים עבור תיבות A ו- B הן כדלקמן: תיבת קדימה: 5'- T GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG הפוך: 5'- CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC; B תיבת קדימה: 5'- G TTAATTAA CTGCCCGTCAACA הפוך: 5'- T GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT catc 10. האתרים של אנזימי הגבלה (עולה לי ואני Pac) מודגשים. - ולקשור 500 ננוגרם של עולה I-מתעכל A ו- 500 ng של Pac I-מתעכל B fragmהמציג לתוך 50 ng של PLD53SC-ATB (tdTomato) וקטור ב 16 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
- Transform וקטור PLD53SC-ATB מטוהרים לתאי BAC-המוסמכות 11 והתרבות אותם על לוריא- Bertani (LB) צלחות אגר עם chloramphenicol (20 מיקרוגרם / מ"ל) ו אמפיצילין (30 מיקרוגרם / מ"ל) בשעה 37 ° C. בחרו שניים כדי שלוש מושבות של שיתוף לשלב מהצלחות מאסטר Ch / אמפר.
- לחסן כל המושבה לתוך 1 מ"ל של LB בתוספת chloramphenicol 20 מיקרוגרם / מ"ל ו דגירה אותם במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס, 225 סל"ד. מורחים 100 μl של כל התערובת על צלחת LB-אגר (10 גר 'Peptone 140, 5 גרם של תמצית שמרים, 12 גרם של אגר, ו 1 ליטר של מים; pH 7.5) בתוספת chloramphenicol ו 4-4.5% של סוכרוז. דגירה התרבות לילה בשעה 37 ° C.
- פיק הוא מושבות גדולות וקטנות replate אותם על שתי צלחות LB-אגר עם chloramphenicol. לאחר מכן, לחשוף את הצלחות עם או בלי אור UV למשך 30 שניות לבחור את המושבות רגישות-UV לניתוח נוסף.
- זהה את הדנ"א BAC שונה על ידי PCR באמצעות tdTomato / IL-22 פריימר הטרוזיגוטיים (קדימה: 5 'ACT TGT מהפקולטה לרוקחות אוכלים ATC TCT גת GGT; גב: 5' TGT AAT CGG GGA TGT CGG C). תנאי thermocycler הם כדלקמן: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 30 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 56 ° C למשך 30 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות; ותוסף סופי על 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- אשר את הרצף של האזור השונה של BAC ידי רצף BAC הישיר של דנ"א BAC-prep הגדול 12.
- להרדים עכבר הנמען עם מנה של tribromoethanol 0.25% לתוך חלל הצפק כאשר להשתיל את zygotes microinjected לעכברים פסאודו בהריון C57BL / 6 ג.
- Linearize את בחינות הבגרות IL-22-tdTomato לבנות (10 מיקרוגרם) על ידי עיכול עם 5 μl של הגבלה endonucleasePi-SCEI ב 100 μl של מערכת התגובה microinject הדנ"א BAC לינארית לביצים מופרות של נקבות C57BL / 6 בשלב pronuclear 13. screen העכברים המהונדסים ידי ניתוח כתם דרום של DNA שבודד ביופסיות זנב באמצעות נהלים סטנדרטיים.
2. הכנת תא בודד מתוך טחול, קורנית, בלוטות הלימפה, או תיקון של Peyer
הערה: IL-22-tdTomato עכברי כתב היו מתוחזקים במכון הלאומי לסרטן (NCI, פרדריק, MD). שיטת המתת החסד תואמת את הנחיות AVMA האחרונות המתת חסד. כל העכברים היו מורדמים באמצעות שאיפת CO 2 14.
- להרדים עכבר IL-22-tdTomato בתא CO 2 והניח אותו על משטח נקי. לעקר את העור בבטן ידי ריסוס 70% אלכוהול ופצע אותו פתוח. הסר את הטחול ב בכנף שמאל ואת התימוס מאחורי עצם החזה.
- כדי לקצור את בלוטות mesentericlymph (הממוקם בתוך רקמת mesenteric) והטלאים של Peyer (lymphoidnodules הקטן ברחבי אזור המעי של המעי הדק), לקחת את mesenteric הלבן פנינה הצמתים קרובה tהוא הקיר של המעי הדק באמצעות לנתח מלקחיים עם עצות משונן עדין הנקודה הראשונה ולאחר מכן להסיר את המעי הדק והמעי הגס כולו אל מחוץ לגוף. מצא את התיקונים סגלגלים המורחבים (הכתמים של Peyer) לאורך המעי לגזור אותם במספריים. טוחן רקמות הלימפה אלה (בלוטות הלימפה והטלאים של Peyer) בנפרד בין שתי שקופיות חלביות לתוך השעית תא בודד ב PBS / 1% בסרום שור עוברי (FBS) חיץ על קרח.
- לרכך את הטחול או רקמות התימוס תוך שימוש באותה השיטה כמו בשלב 2.2. צנטריפוגה ההשעיה הטחול עבור 8 דקות ב XG 500 ו -4 מעלות צלזיוס. הוסף 1 מ"ל של חיץ lysing ACK לכל הטחול את כדורי התא.
- מערבבים היטב ולתת להם לעמוד במשך דקות 1. הוסף 9 מ"ל של בופר פוספט סטרילית (PBS) חיץ מדגם זה. ספין למטה על ידי צנטריפוגה במשך 8 דקות ב XG 500 ו 4 ° C כדי להסיר את תאי הדם האדומים.
הערה: אין להוסיף למאגר ACK lysing אל תאי התימוס. - Resuspend לויקוציטים וכתוצאה מכך 5 מ"ל של PBS ו pass התאים דרך מסננת תא 100 מיקרומטר. אסוף את כדורי התא על ידי צנטריפוגה XG ב 500 במשך 8 דקות.
- Resuspend התאים 5 מ"ל של התקשורת RPMI או חיץ FACS לספור את התאים קיימא באמצעות הצבע הכחול 0.4% trypan / פתרון PBS.
3. בידוד של אינטרה-אפיתל לימפוציטים ו Lamina propria תאים מהמעיים
- פתח את עור הבטן כמו בשלב 2.1, לחתוך את המעי הדק, מן התריסריון (ליד הקיבה) כדי מעי (קרוב בנספח), ואת המעי הגס כולו, ממש מעל פי הטבעת. הסר את השומן נוסף מלקחיים באמצעות רקמות mesenteric. שים את המעיים מיד קר כקרח PBS.
- חפשו חלקות של Peyer (קטן, גושים גס) יחד באזור הדיסטלי של המעי הדק. הסר את ההמונים באמצעות מלקחיים andopen המעי לאורכו בעזרת מספריים. ביסודיות לשטוף את המעי עם 10 מ"ל של קר כקרח PBS.
- דגירה הרקמות ב 20 מ"ל של חיץ מראש העיכול (EDTA מ"מ 5ו 1 מ"מ dithiothreitol תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS)) במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם סיבוב איטי (50 סל"ד) שייקר. לאחר כל 2 incubations, להסיר את שכבת תאי אפיתל, המכיל לימפוציטים intraepithelial (IELs), על ידי vortexing האינטנסיבי (30 שניות ב 12,000 סל"ד) ולהעביר את כל הרקמות דרך מסננת תא 100 מיקרומטר.
- הוסף 20 מ"ל של תמיסת EDTA חדש לרקמה לאינקובטורים השני למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לעבור את שברי IEL דרך מסננת תא 100 מיקרומטר וברכה אותם עם השברים הקודמים. שמור את שברי המעי הנותרים על הקרח שיתייחסו בשלב 3.9.
- צנטריפוגה שברים IEL ונקווה ב 800 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. לשטוף את השברים IEL ונקווה עם 10 מ"ל של FBS HBSS / 5% ו ספין אותם במשך 5 דקות ב 800 XG ו -4 מעלות צלזיוס.
- Resuspend התאים 8 מ"ל של מדיום סיליקה colloidal 44% 15 ולהצליב אותם עם 5 מ"ל של מדיום סיליקה colloidal 67%. צנטריפוגה 44% / 67.5% תערובת תאים שיפוע במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ו -1,500 גרם x.
- אוספים את התאים IEL מהלהקה על הממשק. ראשית, להסיר את השכבה העליונה של supernatant (כ -5 מ"ל) באמצעות 1 פיפטה מ"ל. לאחר מכן, הקציר IELs על שלבי הביניים של שיפוע בינוני סיליקה colloidal.
- שטפו את IELs על ידי הוספת 10 מ"ל של מדיום RPMI. ספין התאים למשך 5 דקות ב 800 XG ו -4 מעלות צלזיוס. Resuspend את IELs ב 5 מ"ל של RPMI עבור צעד 3.15.
- עבור בידוד של לימפוציטים שכבת הרירית המיוחדת (LPLs), לרכך את שברי רקמות המעי משלב 3.4 לחתיכות קטנות באמצעות מספריים (1 מ"מ) ולעכל את החלקים עם 10 מ"ל של חיץ העיכול (0.05 גרם של collagenase, 0.05 גרם של DNaseI, ו -0.3 גרם של dispase II ב RPMI / 5% FBS) במשך 15-20 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
- סנן את התערובת דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. את supernatant הזרימה דרך מכיל את LPL שוחרר.
- לגמרי לעכל את שברי המעי על ידי חזרה על שלבים 3.9-3.10 (בדרך כלל, הם חייבים להיותחזר 3 פעמים). בכל פעם, לרכז את supernatants המכיל את LPLs.
- אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1500 XG טמפרטורה והחדר ו resuspend את הכדורים ב RPMI / 5% FBS. להעביר אותם דרך מסננת תא 40 מיקרומטר.
- Resuspend את כדורי תא 10 מ"ל של שבריר 40% שיפוע בינוני סיליקה 40:80 קולואידים ולהצליב אותם על 5 מ"ל של שבריר 80% בתוך שפופרת 15 מ"ל.
- בצע את הפרדת שיפוע צפיפות על ידי צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 1500 XG טמפרטורה וחדר 15.
- אסוף את LPLs, כמתואר בשלב 3.7. לשטוף אותם פעם אחת עם 10 מ"ל של PBS ו resuspend את כדורי ב 1 מ"ל של% PBS / 1 FBS חיץ או בינוני RPMI.
- ספירת תאי הקיימא (הן IELs ו LPLs) באמצעות צבע כחול 0.4% trypan / פתרון PBS.
הביטוי 4. של IL-22-tdTomato ב קוליטיס
- כן השעיות תא טחול יחידות מעכברי IL-22-tdTomato בריכוז של 1 x 10 <sup> 7 תאים / מ"ל ב PBS סטרילית, כמתואר בשלבים 2.1-2.4.
- לטהר את תאי CD4 + T בשיטת הבידוד שלילי הסלולרית העכבר CD4 10. לייבל אותם עם אנטי CD4-APC (שיבוט RM4-5, 0.5 μl / 1 x 10 6 תאים PBS / 1% חיץ FBS) ואנטי-CD45RB-FITC (16A שיבוט, 0.5 μl / 1 x 10 6 תאים PBS / 1% חיץ FBS) על ידי דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- ספין התאים למשך 5 דקות ב 500 XG ו -4 מעלות צלזיוס. שוטפים את התאים עם 2 מ"ל של חיץ PBS / 1% FBS resuspend אותם 1 מ"ל של חיץ מכתים FBS PBS / 1%.
- הפעל את תאי ה- T שכותרתו על זרימה cytometry מכונת 16. שער תאים על אוכלוסייה תא T מסוג CD4 + ו CD45RB גבוה תאי פעמים חיוביות (אורך הגל זוהה ב 488 ננומטר ו 633 nm לייזרים).
- קציר התאים מסודרים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 500 XG ו -4 מעלות צלזיוס. Resuspend את כדורי תא חיץ סטרילי PBS ב 1 x 10 6 6) לתוך הצפק שבין אלה לאלה Rag1 - / - עכבר הנמען.
- להקריב את העכברים הנמען תחת CO 2 בנקודות זמן שונות. קציר את בלוטות לימפה mesenteric ואת המעיים קטנים וגדולים, כמתואר בשלבים 2.1 ו -2.2. שים כל צומת הלימפה mesenteric ופצע פתוח המעי (כריך נייר / המעי / נייר) paraformaldehyde 4% (PFA; להתמודד תחת במנדף) לילה לתקן רקמות. החזר את PFA עם 18% סוכרוז במשך 16-24 שעות ואז להקפיא את רקמות עבור חתך.
- השתמש מכונת cryostat לחתוך את הרקמה 17, 18, 19. מומלץ לחמם את הסעיפים רקמות לטמפרטורת החדר במשך כ 60 דקות ומניחים אותם אצטון במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לייבש אותם בטמפרטורת החדר למשך כ 5 דקות.
- להוסיף העולה FBS, להסיר אותו על ידי פיפטה, ומוסיפים-RFP אנטי ביחס של 1: BSA 200 דילול ב -0.1% / 1x PBS. דגירת הנוגדנים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות.
- יש לשטוף את הסעיפים 1x PBS במשך 10 דקות ולהחיל את נוגדנים משני המתאים (568 נגד ארנב עז) לרקמה, מדולל 1: 300 ב 1% BSA / 1x PBS, במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- יש לשטוף שקופיות 1x PBS במשך 10 דקות, לנגב אותם יבש, ולהוסיף coverslips.
- דמיינו כל הדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תחת תאורה עקבית (RFP: עירור מסנן 540-580 ננומטר) באמצעות המטרה 40X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transgene כתב murine IL-22 נוצר באמצעות recombineering לשנות כרומוזום בקטריאלי מלאכותי נושא את לוקוס IL-22. איור 1 מציג דיאגרמה של וקטור pBACe3.6 המכיל את הגן sacBII, סמן חיובי-הבחירה, גן עמידות לאנטיביוטיקה chloramphenicol 11. אחרי שהצגתי את tdTomato לתוך אקסון 1, רצף הפפטיד האות שובש, כפי שמוצג באיור 2. לפיכך, כתב tdTomato היה לכוד בתוך התאים IL-22-להביע, מה שמאפשר זיהוי והבידוד שלהם על ידי cytometry זרימה. העכברים הומוזיגוטים גדלו מקווי מייסד הוקרנו על ידי PCR, והם לא דורשים backcrossing על מנת להשיג צאצאים עם זהות גנטית, כפי שנדרש באסטרטגית הרגילה העקומה. כדי לבדוק את הנאמנות של הכתבים IL-22, במבחנה splenocytes -generated היו בתרבית תחת Th22 או תנאי נייטרלי.
בתוך-page = "1"> 
איור 1: מפת האתר של וקטור pBACe3.6. pBACe3.6 מאופיין המכיל התנגדות chloramphenicol אנטיביוטיקה גן sacBII כסמן חיובי-הבחירה. במהלך רקומבינציה, השיבוטים הרצויים הם סוכרוז עמידים דרך שלהם לבטא את גן sacBII והם מותר לגדל על תקשורת סוכרוז המכיל, ואילו מושבות BAC השליליות הן סוכרוז רגיש.
איור 2: מבט סכמטי של שיבוט RP23-401E11 BAC השונה. גן כתב tdTomato הוכנס מוקד Il-22, אשר כולל IL-22 ואלמנטים תקנוניים (RP23-401E11 BAC) בעכברים בקטריאלי מלאכותי כרומוזום, באמצעות טכנולוגיית recombineering. על ידי רקומבינציה הומולוגי, הרצף של הפפטיד האות של Il-22 ב BAC הופרע אקסון 1 של Il-22 הוחלף גן כתב tdTomato. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: זיהוי של IL-22 לכתבים splenocytes מתורבת במבחנה. תאי CD4 T היו מטוהרים מן הטחול ואז מגורה עם-CD28 אנטי; אנטי CD3 (מצב נייטרלי); או אנטי CD3, אנטי CD28, אנטי IFNƳ, אנטי IL4, IL-6, TGF-β, ו -6 Formylindolo (3,2-ב) carbazole (FICZ) במשך 5 ימים. IL-22-tdTomato נותח על ידי cytometry זרימה (שני למעלה) מיקרוסקופ פלואורסצנטי (למטה שני, סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר). מספרי הרביעים לציין את אחוז תאי CD45 +. Target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: ויזואליזציה של IL-22-בייצור תאים ברקמות עכבר שונים. תא בודד השעיות הוכנו מן הטחול, התימוס, בלוטות הלימפה, מעיים (IEL ו LP), ואת התיקון של Peyer. הם היו אז משטח מוכתם FITC-אנטי CD3 ובחן לביטוי tdTomato. MLN: בלוטה לימפה mesenteric, ALN: הקשרים לימפה בבית השחי, PP: התיקון של Peyer, IEL: תאי intraepithelial המבודדים מן המעי הדק, LP: תאי שכבת רירית מיוחדים מטוהר מן המעי הדק. מספרי הרביעים לציין את אחוז תאי CD45 +. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ין-page = "1"> 
איור 5: לוקליזציה של IL-22 לכתבים במהלך הפיתוח של קוליטיס העברת תאי T. CD4CD45RBHigh T תאים מעכברי כתב IL-22 הועברו לתוך Rag1 - / - עכברים, ואת אותות tdTomato הוערכו על ידי אימונוהיסטוכימיה ברקמות השונות בנקודות זמן שונות במהלך הפיתוח של קוליטיס. החצים מצביעים על אותות IL-22-tdTomato. ברי סולם = 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IL-22 ממלאים תפקיד חיוני שיפוץ רקמות הגנת מארחת מולד. תאי IL-מייצר 22 זוהו לשעבר vivo על ידי מכתים תאי. עם זאת, זה עדיין נשאר קשה לעקוב IL-22 ביטוי באתרם, או במצב הרגיל או מצבים דלקתיים. פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה לפתח מודל עכבר כתב IL-22, אשר מאפשר לנו למקם את התאים לבטא כתב in vivo. TdTomato גן מקודד הכתב היה מוכנס לתוך מוקד IL-22 באתר המשבש את רצף האות. תוצאות אסטרטגיה זו ב כתב להיות לכודה בתוך התא לייצר, בניגוד IL-22 אשר מופרש במהירות, המאפשרות הדמיה של תא הייצור. כתב IL-22-המהונדס ניתן בתוך BAC גדול, במטרה לשמר את הגורמים רגולטוריים, ובכך מקנות נאמנות ביטוי של העיתונאי תואם לזה של IL-22. רקמות המעיים של מ 'המהונדסקרח מוצג ביטוי הכתב ההומיאוסטטית ב CD4 T תאים לימפוציטים מולדים שכבת הרירית המיוחדת של המעי הדק. קוליטיס המושרה, תאי CD4 T הביע הכתב במעי הגס.
תפקידיו של IL-22 במחלת מעי דלקתית אינם ברורים. על ידי השתתפות התחדשות הביטחון הרקמה הרירית של המעי, IL-22 הוא מסוגל לעורר את הייצור של שני 20 מגן, 21, 22 ומגשרים מעודדי דלקת (למשל, IL-8) 23, 24. שני מודלים של קוליטיס תא מונחה T הראו עליות IL-22 במעי הגס, כולל α TCR - / - עכברים 25, 26 ו המודל להעברה CD45RB 27. השוואת מודלים מחלות מעי דלקתיות, ביטוי-22 IL במעי היה גבוה יותר משמעו Crmodelthan מחלת האון במודל של קוליטיס כיבתה 21, 24 .הנה, אנו להעביר תאי CD4CD45RBhi T מן העכברים כתב לתוך Rag1 - / - מקבלים לחקות את התהליך פתוגניים של מחלת קרוהן. מצאנו כי, שקודם קוליטיס, IL-22 כתבים היו דמיינו בבלוטות הלימפה ניקוז מעיים (MLN). האותות מכן פחתה MLN ועבר את המעיים, במיוחד במעי הדק הדיסטלי ו נקודתיים, עם התפתחות קוליטיס. רוב עיתונאי tdTomato היו נקודות בתוך רירית שכבת רירית המיוחדת של המעי.
סוג אחר של כתב IL-22 תוארה בעבר, שבו תאים מסומנים לצמיתות כזה שהם ובנותיהם ממשיכים להביע הכתב, אם לא תעתיק של IL-22 המשיך 28. כמו לימפוציטים המולד המחקר, הבטן שלנו סומנו בתנאים ההומיאוסטטית, ובשנת קוליטיס, tהכתב הוא היה מקומי בתאי T מן בלוטות הלימפה mesenteric אל רקמת המעי.
הנהלים המתוארים בפרוטוקול זה יהיו ישימים להקמת עכברי כתב transgene אחרים, כגון IL-17, IL-25, וכן הלאה. עם זאת, חשוב לבחור שיבוטי BAC מתאימים נושאת גורמי רגולטוריים דיסטלי להבטיח את הנאמנות של ביטוי גני כתב, מאז transgenes משולב באופן אקראי לתוך גנום העכבר. העכבר הכתב מאפשרת זיהוי של תאים המבטאים in vivo, כמו גם עבור טיהור ואפיון של תאים חיים. השתמשנו tdTomato, חלבון פלואורסצנטי אדום בהיר במיוחד, כמו גן כתב ניאון כדי להפוך את הכתב מתאים בדיקות הדמיה חיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
References
- Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).
- Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo. PLoS One. 7, e39750 (2012).
- Kamanaka, M., et al. Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse. Immunity. 25, 941-952 (2006).
- Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22. Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).
- Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9. J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).
- Cella, M., et al. A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity. Nature. 457, 722-725 (2009).
- Sanos, S. L., et al. RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells. Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).
- Spits, H., et al. Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature. Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).
- Mazzucchelli, R. I., et al. Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice. PLoS One. 4, e7637 (2009).
- Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice. Front Immunol. 6, 662 (2015).
- Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication. Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).
- Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments. Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).
- Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of transgenic mice. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. Chapter 19, Unit 19 11 (2009).
- Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats. Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).
- Omata, Y., et al. Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation. Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).
- Kumar, N., Borth, N. Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories. Methods. 56, 366-374 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb.prot4991 (2008).
- Hilbe, W., et al. Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120. Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).
- Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry. Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).
- Wolk, K., et al. IL-22 increases the innate immunity of tissues. Immunity. 21, 241-254 (2004).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).
- Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, de, R, Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells. Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Andoh, A., et al. Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts. Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75, 274-282 (1993).
- Powrie, F. Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).
- Ahlfors, H., et al. IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection. J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).
