Abstract
Reporter mus er ofte blevet brugt til at observere lokalisering af ekspression af målrettede gener. Denne protokol fokuserer på en strategi for at etablere en ny transgen reporter musemodel. Vi valgte at visualisere interleukin (IL) 22-genekspression, fordi dette cytokin har betydelige aktiviteter i tarmen, hvor det bidrager til at reparere væv er beskadiget af inflammation. Reportersystemer giver betydelige fordele frem for andre metoder til at identificere produkter in vivo. I tilfældet med IL-22, havde andre undersøgelser først isoleret celler fra væv og derefter re-stimulerede celler in vitro. IL-22, der normalt secerneres, blev fanget inde celler under anvendelse af et lægemiddel, og intracellulær farvning blev anvendt til at visualisere den. Denne metode identificerer celler i stand til at producere IL-22, men det afgør ikke, om de gjorde det in vivo. Reporter design omfatter indsættelse af et gen for et fluorescerende protein (tdTomato) i IL-22-genet på en sådan way at det fluorescerende protein ikke kan secerneres og derfor forbliver fanget inde i producerende celler in vivo. Fluorescerende producenter kan derefter visualiseres i vævssnit eller ved ex vivo-analyse gennem flowcytometri. Selve byggeprocessen for reporteren inkluderet recombineering en bakteriel kunstigt kromosom, som indeholdt IL-22-genet. Denne manipuleret kromosom blev derefter indført i musegenomet. Homøostatiske IL-22 reporter ekspression blev observeret i forskellige musevæv, herunder milt, thymus, lymfeknuder, Peyerske plak, og tarm, ved hjælp af flowcytometri-analyse. Colitis blev induceret af T-celle (CD4 + CD45RBhigh) overførsel, og reporter udtryk blev visualiseret. Positive T-celler blev første stede i de mesenteriske lymfeknuder og derefter de ophobes inden i lamina propria af de distale tyndtarm og tyktarm væv. Strategien hjælp AKB gav gode-fidelity reporter udtryk i forhold til IL-22 expresnen, og det er enklere end knock-in procedurer.
Introduction
Celletype-specifik ekspression af reportergener er nyttigt at identificere celler aktivt udtrykker målet i væv under homeostatiske og perturberede stater. Det giver også mulighed for oprensning af disse celler, som forbliver levedygtige, at studere deres andre egenskaber. Reporter mus er blevet anvendt til at belyse virkningsmekanismen for specifikke cytokiner, transkriptionsfaktorer og regulatoriske elementer. Tidligere strategier 1, 2, har tre stort set påberåbt sig banke reporter ind i målet locus i musen kromosomet, en tidskrævende og bekostelig procedure. Således er en enklere metode til generering af reporter mus er ønskelig.
Cytokiner er en bred klasse af små, secernerede proteiner / peptider, der regulerer immunresponser gennem intercellulære signalering. Interleukin 22 (IL-22) er et cytokin med mange rapporterede aktiviteter, herunder barriere function, væv reparation, og inflammation 4. Skønt IL-22 blev oprindeligt opdaget som en T-celle produkt 5, efterfølgende rapporter vist sin ekspression i naturlige dræberceller (NK) celler hos mennesker 6 og mus 7 og i andre klasser af medfødte lymfocytter 8. Trods omfattende observation af IL-22-celler, visualisering af IL-22 tidligere krævede ex vivo-stimulering og permeabilisering for pletter med antistoffer. Derfor ville hidtil ukendte IL-22 reporter mus være et meget nyttigt værktøj til at undersøge funktionen af IL-22 i homeostatiske og patogene processer.
Her har vi udviklet et forenklet transgen reporter musemodel at observere IL-22-producerende celler in vivo og in vitro. Ved hjælp af en BAC recombineering metode 9, vi indsat tdTomato cDNA sekvensen med Poly et signal fragmenter i IL-22 locos og erstattet exon 1. De andre utranslaterede regioner, exoner og regulerende elementer blev ikke forstyrres, da vi gerne vil efterligne den naturlige regulering af IL-22 så meget som muligt. Stedet for reporter insertion forstyrrer signalsekvensen, hvilket resulterer i akkumulering af reporteren inde i producerende celler, i modsætning til IL-22 selv, som hurtigt udskilles. Denne nye metode kan også anvendes til generering af reporter-mus for andre secernerede proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr fik ordentlig pleje i overensstemmelse med de eksperimentelle procedurerne i Guide 2011 for pleje og anvendelse af forsøgsdyr Komité Frederick Nationallaboratoriet for Cancer Research.
1. Dannelse af IL-22-tdTomato Reporter mus ved BAC Recombineering
BEMÆRK: Musene bør være bevidstløs og ikke bevæger som reaktion på en skadelig stimulus. Sterilisere kirurgiske område med 70% ethanol, og der steriliseres alle kirurgiske værktøjer ved hjælp af en glaskugle sterilisator.
- Der renses BAC DNA (RP23-401E11, klon længde 228391 bps) under anvendelse af en alkalisk ekstraktionsmetode 10, 11. Karakterisere BAC klon af Spel fordøjelse af 5 pg RP23-401E11 at bekræfte den korrekte størrelse af målgenet. BEMÆRK: BAC DNA blev fordøjet i 14 fragmenter.
- Sæt TdTomato reporter gen i Not I / Sal I-stedet i PLD53SC-A-GFP-B shuttlevektor11 og erstatte GFP-genet i samme sted. Derefter, ved hjælp BAC RP23-401E11 som skabelon, forstærke homologiboxene (A og B) til den første oversatte exon af IL-22 (exon 1) ved PCR (95 ° C 2 minutter; 30 cykler ved 95 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sek og 72 ° C i 30 sekunder, og en endelig forlængelse ved 72 ° C i 10 min). I en 50 pl PCR-reaktionssystemet, tilsættes 50 ng (1 pi) af BAC DNA, 0,5 pi primere (10 uM), 40 pi PCR Supermix high fidelity og 8 pi H 2 O.
BEMÆRK: primere for A- og B-bokse er som følger: En kasse Fremad: 5'T GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG og Reverse: 5'CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC; B box Fremad: 5'G TTAATTAA CTGCCCGTCAACA og Reverse: 5'T GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10. De steder i restriktionsenzymer (Asc I og Pac I) er understreget. - Ligere 500 ng Ascl-spaltet A og 500 ng Pacl-fordøjet B Fragmenser i 50 ng PLD53SC-ATB (tdTomato) vektor ved 16 ° C i 1 time.
- Omdanne den oprensede PLD53SC-ATB vektor i BAC-kompetente celler 11 og kultur dem på Luria-Bertani (LB) agarplader med chloramphenicol (20 ug / ml) og ampicillin (30 ug / ml) ved 37 ° C. Pluk to til tre kolonier af co-integreres fra Ch / Amp master-plader.
- Inokulering hver koloni i 1 ml LB suppleret med 20 ug / ml chloramphenicol og inkuber dem i 1 time ved 37 ° C og 225 rpm. Spred 100 pi af hver blanding på en LB-agarplade (10 g pepton 140, 5 g gærekstrakt, 12 g agar, og 1 I vand; pH 7,5) suppleret med chloramphenicol og 4-4,5% saccharose. Inkuber kulturen natten over ved 37 ° C.
- Pluk både store og små kolonier og replate dem på to LB-agarplader med chloramphenicol. Derefter udsættes pladerne enten med eller uden UV-lys i 30 sekunder og samle UV-følsomme kolonier til yderligere analyse.
- Identificer det modificerede BAC DNA ved PCR ved hjælp tdTomato / IL-22 heterozygot primer (Fremad: 5 'ACT TGT GCG ATC TCT Gat GGT, Reverse: 5' TGT AAT CGG GGA TGT CGG C). Termocyklusapparatet er som følger: 95 ° C i 2 min; 30 cykler ved 95 ° C i 30 sek, 56 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sek; og en endelig forlængelse ved 72 ° C i 10 min.
- Bekræft sekvensen af det modificerede område af BAC ved direkte BAC sekvensering af store prep BAC DNA 12.
- Bedøver en modtager mus med en dosis på 0,25% tribromethanol ind i bughulen, når implantation af mikroinjicerede zygoter i pseudo-gravide C57BL / 6c mus.
- Linearisere IL-22-tdTomato BAC konstruktion (10 ug) ved fordøjelse med 5 pi restriktion endonucleasePi-Scel i 100 pi af reaktionssystemet og microinject det lineariserede BAC DNA i befrugtede æg fra C57BL / 6 tæver på pronucleær stadium 13. SCREOr de transgene mus ved Southern blot-analyse af DNA isoleret fra halebiopsier anvendelse af standardprocedurer.
2. Single-celle Forberedelse fra milt, thymus, lymfeknuder og Peyer Patch
BEMÆRK: IL-22-tdTomato reporter mus blev fastholdt på National Cancer Institute (NCI, Frederick, MD). Den dødshjælp metode i overensstemmelse med de seneste AVMA retningslinjer for eutanasi. Alle mus blev aflivet ved anvendelse af CO2 inhalation 14.
- Afliv en IL-22-tdTomato mus i en CO 2 kammer og sætte det på en ren pad. Steriliser maven hud ved at sprøjte 70% alkohol og klippe det åbne. Fjern milten i den venstre flanke og brissel bag brystbenet.
- For at høste mesentericlymph noder (beliggende i den mesenteriske væv) og Peyerske plaques (små lymphoidnodules hele ileum region af tyndtarmen), tage perlehvide mesenteriale-noder tæt til than væg af tyndtarmen ved hjælp dissekere pincet med fin-punkt savtakkede tips først og derefter fjerne hele tyndtarmen og colon ud af kroppen. Find de udvidede ovale patches (Peyerske plaques) langs tarmen og skær dem med en saks. Grind disse lymfoide væv (lymfeknuder og Peyerske plaques) individuelt mellem to matte objektglas i en enkelt-cellesuspension i PBS / 1% føtalt bovint serum (FBS) puffer på is.
- Hak milt eller thymus væv under anvendelse af samme fremgangsmåde som i trin 2.2. Centrifuger miltcentret suspension i 8 minutter ved 500 xg og 4 ° C. Der tilsættes 1 ml ACK lyseringsbuffer pr milt til cellepellets.
- Bland godt og lad dem stå i 1 min. Tilsættes 9 ml sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) buffer til hver prøve. Spin ned ved centrifugering i 8 minutter ved 500 xg og 4 ° C for at fjerne de røde blodlegemer.
BEMÆRK: Du må ikke tilføje ACK lyseringsbuffer til thymus celler. - Resuspender de resulterende leukocytter i 5 ml PBS og pass cellerne gennem en 100 um cellefilter. Indsamle cellepellets ved centrifugering ved 500 x g i 8 min.
- Resuspender cellerne i 5 ml RPMI-medium eller FACS buffer og tælle de levedygtige celler under anvendelse af 0,4% trypanblåt farvestof / PBS-opløsning.
3. Isolering af intraepitelial lymfocytter og lamina propria Celler fra tarmene
- Åbn abdominale hud som i trin 2.1, skære tyndtarmen, fra duodenum (ved siden af maven) til ileum (tæt på bilag), og hele colon, lige over anus. Fjern den ekstra fedt og mesenteriallymfeknuderne væv ved hjælp af pincet. Sætte tarmene straks i iskold PBS.
- Se efter Peyerske plaques (små, ru knuder) langs det distale område af tyndtarmen. Fjern masserne ved anvendelse af pincetter andopen tarmen på langs med en saks. Grundigt skylle tarmen med 10 ml iskold PBS.
- Inkubér væv i 20 ml præ-fordøjelse buffer (5 mM EDTAog 1 mM dithiothreitol i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)) i 30 minutter ved 37 ° C med langsom rotation (50 rpm) i en ryster. Efter hver af 2 inkubationer fjernes epithelcellelaget, der indeholder de intraepitel lymfocytter (IELs), ved intens hvirvelbehandling (30 sekunder ved 12.000 rpm) og overføre alle væv gennem en 100 um cellefilter.
- Der tilsættes 20 ml nye EDTA-opløsning til vævet for anden inkubering i 30 minutter ved 37 ° C. Pass IEL fraktioner gennem en 100 um celle si og samle dem med de tidligere fraktioner. Hold de resterende tarmen fragmenter på is, der skal behandles i trin 3.9.
- Centrifuger de puljede IEL fraktionerne ved 800 xg i 5 min ved 4 ° C. Vask de poolede IEL fraktioner med 10 ml HBSS / 5% FBS og spin dem ned i 5 minutter ved 800 xg og 4 ° C.
- Resuspender cellerne i 8 ml 44% kolloidt silica medium 15 og overtrække dem med 5 ml 67% kolloidt silica medium. Centrifugeres 44% / 67.5% Celleblanding gradient i 20 minutter ved stuetemperatur og 1.500 x g.
- Indsamle IEL celler fra båndet ved grænsefladen. Først fjerne det øverste lag af supernatanten (ca. 5 ml) under anvendelse af 1 ml pipette. Derefter høst IELs ved interfasen af kolloide silica medie gradient.
- Vask de IELs ved tilsætning af 10 ml RPMI-medium. Spin cellerne ned i 5 minutter ved 800 xg og 4 ° C. Resuspender IELs i 5 ml RPMI for trin 3.15.
- Til isolering af lamina propria-lymfocytter (LPLs), hakkekød tarmen vævsfragmenter fra trin 3.4 i små stykker med en saks (1 mm) og fordøje de stykker med 10 ml digestionspuffer (0,05 g collagenase, 0,05 g DNasel, og 0,3 g dispase II i RPMI / 5% FBS) i 15-20 min ved 37 ° C.
- Blandingen filtreres gennem en 70 um cellefilter. Gennemløbet supernatant indeholder den frigivne LPL.
- Fuldt fordøje tarmen fragmenter ved at gentage trin 3,9-3,10 (normalt, skal de væregentaget 3 gange). Hver gang, pool supernatanterne indeholdende LPLs.
- Indsamle cellerne ved centrifugering i 5 minutter ved 1.500 xg og stuetemperatur og resuspenderes pellets i RPMI / 5% FBS. Pass dem gennem en 40 um celle si.
- Resuspender cellepelletene i 10 ml af fraktionen 40% af en 40:80 kolloidt silica medium gradient og overlejre dem på 5 ml fraktion på 80% i et 15 ml rør.
- Udfør densitetsgradient separation ved centrifugering i 20 minutter ved 1.500 xg og stuetemperatur 15.
- Opsaml LPLs, som beskrevet i trin 3.7. Vaske dem én gang med 10 ml PBS og resuspenderes pellets i 1 ml PBS / 1% FBS buffer eller RPMI-medium.
- Tæl levedygtige celler (både IELs og LPLs) ved hjælp af 0,4% trypanblåt / PBS løsning.
4. Ekspression af IL-22-tdTomato i Colitis
- Forbered enkelt Miltcellesuspensioner fra IL-22-TdTomato mus i en koncentration på 1 x 10 <sup> 7 celler / ml i sterilt PBS, som beskrevet i trin 2.1-2.4.
- Rens de CD4 + T-celler ved hjælp af musen CD4 Cell Negativ Isolation metode 10. Mærke dem med anti-CD4-APC (klon RM4-5, 0,5 ul / 1 x 10 6 celler i PBS / 1% FBS-puffer) og anti-CD45RB-FITC (klon 16A, 0,5 ul / 1 x 10 6 celler i PBS / 1% FBS puffer) ved inkubering ved 4 ° C i 30 minutter.
- Spin cellerne ned i 5 minutter ved 500 xg og 4 ° C. Vask cellerne med 2 ml PBS / 1% FBS buffer og resuspender dem i 1 ml PBS / 1% FBS farvning puffer.
- Kør de mærkede T-celler på en flowcytometri maskine 16. Gate cellerne på en T-cellepopulation og sortere CD4 + CD45RB høje dobbelt-positive celler (bølgelængden detekteret ved 488 nm og 633 nm laser).
- Høste sorterede celler ved centrifugering i 5 minutter ved 500 xg og 4 ° C. Resuspender cellepellets i sterilt PBS buffer ved 1 x 10 6 6) i peritoneum ofeach RAG1 - / - modtager mus.
- Sacrifice de modtagende mus under CO 2 på forskellige tidspunkter. Høste mesenteriske lymfeknuder og de små og store tarme, som beskrevet i trin 2.1 og 2.2. Sætte hver mesenterisk lymfeknude og cut-åben tarmen (papir / tarm / papir sandwich) i 4% paraformaldehyd (PFA; håndtere under en emhætte) natten over for at fastsætte vævene. Udskift PFA med 18% sucrose for 16-24 timer og derefter fryse vævet for sektionering.
- Brug kryostat maskine til at skære vævet 17, 18, 19. Varm vævssnit til stuetemperatur i ca. 60 minutter og placere dem i acetone i 10 minutter ved stuetemperatur. Tør dem ved stuetemperatur i ca. 5 min.
- Tilføj FBS i overskud, fjerne det med pipette og tilføje anti-RFP ved en 1: 200 fortynding i 0,1% BSA / 1x PBS. Inkuber antistoffet ved 37 ° C i 60 min.
- Skyl afsnittene i 1x PBS i 10 minutter og anvende den tilsvarende sekundære antistof (gede-anti-kanin 568) til vævet, fortyndet 1: 300 i 1% BSA / 1 x PBS, i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Skyl dias i 1x PBS i 10 min, tørre dem tørre, og tilføje dækglas.
- Visualisere alle prøver med et fluorescerende mikroskop under konsistent belysning (RFP: excitationsfilter 540-580 nm) under anvendelse af 40X objektiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En murine IL-22 reporter transgen blev oprettet ved hjælp recombineering at ændre en bakteriel kunstigt kromosom bærer IL-22 locus. Figur 1 viser et diagram af pBACe3.6 vektor indeholdende sacBII gen, et positiv-selektionsmarkør, og chloramphenicol antibiotikumresistensgen 11. Efter indføring tdTomato i exon 1, blev signalpeptidsekvensen afbrudt som vist i figur 2. Således blev tdTomato reporter fanget inde i IL-22-udtrykkende celler, således at deres påvisning og isolering ved flowcytometri. De homozygote mus blev avlet fra stiftende linjer og screenet ved PCR, og de ikke kræver tilbagekrydsning for at opnå afkom med en genetisk identitet, som det kræves i den sædvanlige knock-strategi. For at teste troskab af IL-22 journalister, in vitro -generated splenocytter blev dyrket under Th22 eller neutrale betingelser.
Figur 1: Oversigt over den pBACe3.6 vektor. pBACe3.6 er karakteriseret ved at indeholde chloramphenicol antibiotikaresistens og en sacBII gen som en positiv udvælgelse markør. Under rekombination, de ønskede kloner er saccharose-resistente gennem deres udtrykker sacBII genet og får lov til at vokse på saccharose-holdige medier, mens de negative BAC kolonier er saccharose-følsomme.
Figur 2: Skematisk afbildning af den modificerede RP23-401E11 BAC klon. En tdTomato reportergenet blev indført i Il-22 locus, som omfatter IL-22 og regulatoriske elementer i en murin bakterielt kunstigt kromosom (BAC RP23-401E11) under anvendelse recombineering teknologi. Ved homolog rekombination, sekvensen af signalpeptidet af Il-22 i BAC blev afbrudt og exon 1 af Il-22 blev erstattet af tdTomato reporter genet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Identifikation af IL-22 reportere i splenocytter dyrket in vitro. CD4 T-celler blev oprenset fra milten og derefter stimuleret med anti-CD28; anti-CD3 (neutral tilstand); eller anti-CD3, anti-CD28, anti-IFNƳ, anti-IL4, IL-6, TGF-β, og 6-Formylindolo (3,2-b) carbazol (FICZ) i 5 dage. IL-22-tdTomato blev analyseret ved flowcytometri (top to) og fluorescensmikroskopi (bottom to, skala bar: 100 pm). Tallene i kvadranter angiver procenten af CD45 + celler.target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Visualisering af IL-22-celler i forskellige musevæv. Encellede suspensioner blev fremstillet fra milt, thymus, lymfeknuder, tarme (IEL og LP), og Peyerske plak. De blev derefter overfladebehandlet farvet med FITC-anti-CD3 og undersøgt for tdTomato ekspression. MLN: mesenterisk lymfeknude, ALN: axillær lymfekirtel, PP: Peyerske plak, IEL: intraepitel celler isoleret fra tyndtarmen, LP: lamina propria celler oprenset fra tyndtarmen. Tallene i kvadranter angiver procenten af CD45 + celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Lokalisering af IL-22 reportere under udviklingen af T-celle-overførsel colitis. CD4CD45RBHigh T-celler fra IL-22 reporter mus blev overført til RAG1 - / - mus, og tdTomato signaler blev vurderet ved immunohistokemi i de forskellige væv på forskellige tidspunkter under udviklingen af colitis. Pilene peger på de IL-22-tdTomato signaler. Scale barer = 25 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IL-22 spiller en vigtig rolle i medfødte værtsforsvar og vævsremodellering. IL-22-celler er blevet identificeret ex vivo ved intracellulær farvning. Dog stadig vanskeligt at spore IL-22-ekspression in situ, i normal tilstand eller i inflammatoriske tilstande. Denne protokol beskriver en hidtil ukendt fremgangsmåde til at udvikle en IL-22 reporter musemodel, hvilket gør det muligt at lokalisere reporter-udtrykkende celler in vivo. Reporter gen, der koder TdTomato blev indsat i IL-22 locus på et sted, der forstyrrer signalsekvensen. Denne strategi resulterer i reporteren blive fanget i den producerende celle, i modsætning IL-22, som er hurtigt udskilles, hvilket muliggør visualisering af den producerende celle. Den konstruerede IL-22-reporter blev indeholdt i et stort BAC, med det formål at bevare de regulatoriske elementer og således i fidelity af ekspression af reporteren svarende til den i IL-22. De intestinale væv i transgene mis vises homeostatisk reporter ekspression i CD4 T-celler og medfødte lymfocytter i lamina propria i tyndtarmen. I induceret colitis, CD4 T-celler udtrykte reporter i tyktarmen.
Rollen af IL-22 i inflammatorisk tarmsygdom har været uklar. Ved deltagelse i tarmslimhinde forsvar og vævsregenerering, IL-22 er stand til at fremkalde produktion af både beskyttende 20, 21, 22 og proinflammatoriske mediatorer (f.eks IL-8) 23, 24. To modeller for T-celle-drevne colitis viste stigninger i IL-22 i colon, herunder TCR α - / - mus 25, 26 og CD45RB hi transfer model 27. Sammenligning inflammatorisk tarmsygdom modeller, IL-22-ekspression i tarmen var højere i en CrOhn sygdom modelthan i en model for colitis ulcerosa 21, 24 .Her, overfører vi CD4CD45RBhi T-celler fra reporter mus i RAG1 - / - modtagere og efterligne den patogene proces med Crohns sygdom. Vi fandt, at, forud colitis, blev IL-22 reportere visualiseret i intestinale drænende lymfeknuder (MLN). Signalerne derefter formindsket i MLN og flyttede til tarmene, især de distale tyndtarm og koloner, med udviklingen af colitis. De fleste tdTomato reportere blev lokaliseret inde i lamina propria mucosa af tarmen.
En anden type reporter for IL-22 er tidligere blevet beskrevet, hvor celler mærket permanent, således at de og deres døtre fortsat udtrykke reporteren, også transkription af IL-22 eller ikke er fortsat 28. Som i vores undersøgelse, gut medfødte lymfocytter blev markeret under homeostatiske betingelser, og i colitis, than reporter blev lokaliseret i T-celler fra de mesenteriske lymfeknuder til det intestinale væv.
De er beskrevet i denne protokol procedurer ville være gældende for etablering af andre transgen reporter mus, såsom IL-17, IL-25, og så videre. Det er imidlertid afgørende at vælge egnede BAC kloner, der bærer distale regulatoriske elementer for at sikre nøjagtigheden af reportergenekspression, eftersom transgenerne tilfældigt er integreret i musegenomet. Reporter mus muliggør identifikation af celler, der udtrykker in vivo, såvel som til oprensning og karakterisering af levende celler. Vi brugte tdTomato, en usædvanlig lyse rødt fluorescerende protein, som en fluorescerende reporter gen at gøre journalisten egnet til levende dyr billeddiagnostiske undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
References
- Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).
- Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo. PLoS One. 7, e39750 (2012).
- Kamanaka, M., et al. Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse. Immunity. 25, 941-952 (2006).
- Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22. Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).
- Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9. J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).
- Cella, M., et al. A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity. Nature. 457, 722-725 (2009).
- Sanos, S. L., et al. RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells. Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).
- Spits, H., et al. Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature. Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).
- Mazzucchelli, R. I., et al. Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice. PLoS One. 4, e7637 (2009).
- Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice. Front Immunol. 6, 662 (2015).
- Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication. Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).
- Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments. Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).
- Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of transgenic mice. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. Chapter 19, Unit 19 11 (2009).
- Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats. Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).
- Omata, Y., et al. Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation. Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).
- Kumar, N., Borth, N. Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories. Methods. 56, 366-374 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb.prot4991 (2008).
- Hilbe, W., et al. Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120. Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).
- Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry. Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).
- Wolk, K., et al. IL-22 increases the innate immunity of tissues. Immunity. 21, 241-254 (2004).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).
- Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, de, R, Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells. Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Andoh, A., et al. Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts. Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75, 274-282 (1993).
- Powrie, F. Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).
- Ahlfors, H., et al. IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection. J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).
