Abstract
리포터 생쥐 널리 표적 유전자의 발현을 관찰 지역화 사용되고있다. 이 프로토콜은 새로운 유전자 변형 기자 마우스 모델을 수립하기위한 전략에 초점을 맞추고 있습니다. 우리는이 사이토 카인은 염증 조직 손상을 복구에 기여하는 부위에 중요 활동을 갖기 때문에, 인터루킨 (IL) (22)의 유전자 발현을 가시화하도록 선택. 리포터 시스템은 생체 내에서 제품을 식별하는 다른 방법에 비해 상당한 이점을 제공한다. IL-22의 경우, 다른 연구는 먼저 조직으로부터 세포를 격리 한 후, 시험관 내에서 세포를 재 자극. IL-22, 정상적으로 분비, 약물을 사용하여 균체 내에 포집하고, 세포 염색하여 시각화 하였다. 이 방법은 IL-22을 제조 할 셀을 식별하는, 그러나 생체 내에서 그렇게 한 여부를 결정하지 않는다. 리포터 설계는 이러한 WA에서 IL-22 유전자에 형광 단백질 (tdTomato)에 대한 유전자를 삽입 포함형광 단백질 따라서 분비 할 수없는 예는 생체 내에서 생산 세포 안에 갇혀 남아. 형광 제작자는 조직 절편 또는 유동 세포 계측법을 통하여 생체 외 분석에 의해 시각화 될 수있다. 리포터의 실제 구성 프로세스는 IL-22 유전자를 함유 된 세균 인공 염색체를 포함 recombineering. 이 조작 된 후 염색체 마우스 게놈에 도입 하였다. 항상성 IL-22 발현은 리포터 분석을 유동 세포 계측법에 의한 비장, 흉선, 림프절, 파이어 판 및 소장을 포함하여 다른 마우스 조직에서 관찰되었다. 대장염은 T 세포 (CD4 + CD45RBhigh) 전송에 의해 유도하고, 기자의 발현을 시각화했다. 양성 T 세포 장간막 림프절 제 존재하고 그들 선단부 소장과 결장 조직의 고유 층 내부에 축적. BAC에를 사용하는 전략은 IL-22 EXPRES에 비해 좋은 충실도 기자의 표현을 주었다시온, 그리고 노크 절차보다 간단하다.
Introduction
리포터 유전자의 세포 유형 특정 표현은 적극적으로 항상성과 교란 된 상태에서 조직의 목표를 발현하는 세포를 식별하는 데 유용합니다. 그것은 또한 다른 특성을 연구하기 위해, 생존을 유지 이러한 세포의 정제 할 수 있습니다. 리포터 생쥐 특정 사이토 카인, 전사 인자와 조절 요소에 대한 작용 기전을 밝히는데 이용 하였다. 이전 전략 1, 2, 3은 주로 마우스 염색체 시간 소모적이고 비용이 많이 드는 절차 표적 유전자좌에 리포터 노킹에 의존해왔다. 그러므로, 리포터 생쥐의 발생을위한 간단한 방법이 바람직하다.
사이토 카인은 세포 간 신호 전달을 통해 면역 반응을 조절하는 작은 분비 단백질 / 펩티드의 다양한 클래스입니다. 인터루킨 22 (IL-22)는 많은과 사이토 카인 장벽 쿵푸 등의 활동을보고있다nction, 조직 복구 및 염증 4. IL-22은 T 초기 셀 제품 5로 발견되었지만, 후속 리포트 인간 6 마우스 (7)과 선천성 림프구 (8)의 다른 클래스에서 자연 살해 (NK) 세포에서의 발현을 입증 하였다. 항체와 얼룩에 IL-22 이전에 필요한 생체 자극과 permeabilization의 광범위한 IL-22 생산 세포의 관찰, 시각화에도 불구하고. 따라서, 신규 한 IL-22 리포터 생쥐 항상성 병원성 과정에서 IL-22의 기능을 연구하기위한 유용한 도구가 될 것이다.
여기서는 생체 내 및 시험 관내에서 IL-22 생산 세포를 관찰 할 간략한 리포터 트랜스 제닉 마우스 모델을 개발 하였다. 혈중 알코올 농도를 recombineering 방법 9를 사용하여, 우리는 IL-22에 폴리 LOC의 신호 단편을 tdTomato cDNA 서열을 삽입우리와 우리는 가능한 한 IL-22의 자연 조절을 모방하고자하기 때문에 다른 번역되지 않은 지역, 엑손, 규제 요소, 교란되지 않은 엑손 1을 대체했다. 리포터 삽입 부위는 IL-22 그 자체 빠르게 분비 달리 생산 세포 내부 리포터의 축적의 결과로, 신호 서열을 방해. 이 새로운 방법은 다른 분비 단백질 리포터 생쥐의 발생에도 적용 할 수있다.
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Protocol
모든 동물 관리 및 암 연구 프레드릭 국립 연구소의 실험 동물위원회의 사용을위한 2011 가이드에 설명 된 실험 절차에 따라 적절한 치료를 받았다.
BAC Recombineering에 의한 IL-22 tdTomato 기자 마우스의 1 세대
참고 : 마우스 의식해야하며, 유해 자극에 대한 응답으로 이동하지 않습니다. 70 % 에탄올로 소독 외과 영역 및 유리 비드 멸균기를 사용하여 모든 수술 도구 살균.
- 알칼리 추출법 10, 11을 사용하여 BAC DNA (RP23-401E11 클론 228391 bps의 길이)를 정제. 표적 유전자의 정확한 크기를 확인 RP23-401E11 5 μg의의를 SpeI 소화하여 BAC 클론의 특징. 참고 : BAC DNA는 14 조각으로 절단 하였다.
- PLD53SC-A-GFP-B 셔틀 벡터의 없음 I / 샐 I 사이트에 TdTomato 리포터 유전자를 삽입(11)와 같은 사이트에서 GFP 유전자를 대체합니다. 이어서, 주형으로 BAC의 RP23-401E11를 사용하여 첫 번역 엑손에 상동 상자 (A 및 B)를 증폭하여, IL-22 (엑손 1) PCR (95 ℃, 2 분에 의해, 30 ~ 95 ° C의 30주기 초, 30 초, 55 ° C, 30 초 동안 72 ° C, 10 분간 72 ℃에서 최종 연장). 50 ㎕의 PCR 반응 시스템에서 추가 50 NG (1 μL) BAC DNA 프라이머 0.5 μL (10 μM), PCR 수퍼 믹스 고음질 40 μL 및 H 2 O 8 μL의
5'-T GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG 및 역 : 앞으로 상자를 참고 : 다음과 같이 A와 B 박스 프라이머는 5' CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC을; 앞으로 B 상자 : 5'-G TTAATTAA CTGCCCGTCAACA 및 역 : 5'-T GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10. 제한 효소 (오름차순 I와 팩맨 I)의 사이트는 밑줄로 표시됩니다. - 오름차순 I-소화 (A)의 500 NG와 팩맨 I-소화 B의 fragm 500 NG를 결찰엔트 1 시간 동안 16 ° C에서 PLD53SC - ATB (tdTomato) 벡터의 50 NG로.
- 37 ° C에서 클로람페니콜 (20 μg의 / ㎖) 및 암피실린 (30 μg의 / ㎖)와 접시 한천 루리아 - 베르 타니 (LB)에 BAC-능력 전지 (11)와 문화 그들로 정제 PLD53SC - ATB 벡터 변환. 2 ~ 3 식민지 선택은 ch / 앰프 마스터 판에서 공동-통합 할 수 있습니다.
- 20 μg의 / ㎖ 클로람페니콜 보충 LB 1 ㎖에 각 콜로니를 접종하고 37 ℃에서 1 시간, 225 rpm으로 그들을 품어. LB 아가 플레이트상에서 각각의 혼합물 100 μl를 확산 (펩톤 (140) 10g, 효모 추출물 한천 12 g을 물 1 L의 5g하여 pH 7.5) 클로람페니콜 자당 4-4.5 %로 보충. 37 ℃에서 밤새 문화를 품어.
- 모두 크고 작은 식민지를 선택하고 클로람페니콜 두 LB 한천 플레이트에 그들을 replate. 그런 다음, 또는 30 초 동안 자외선없이 하나 번호판을 노출하고 추가 분석을 위해 자외선에 민감한 식민지를 선택.
- tdTomato / IL-22 이형 프라이머 사용하여 PCR에 의해 수정 된 BAC의 DNA 식별 (정 : 5 'ACT TGT GCG ATC TCT GAT GGT을, 역 : 5'TGT AAT CGG GGA TGT CGG C를). 다음과 같은 열 순환기 조건은 2 분 동안 95 ° C; 30 초, 30 초 동안 56 ° C, 30 초 동안 72 ° C 95 ° C의 30주기; 10 분 동안 72 ℃에서 최종 연장.
- 큰 준비 BAC DNA (12)의 직접 BAC 서열에 의해 BAC의 수정 된 영역의 순서를 확인합니다.
- 의사 임신 한 C57BL / 6C 마우스에 미세 주입 접합자을 주입 할 때 복강에 0.25 %의 tribromoethanol의 용량을 가진받는 사람 마우스를 마취.
- 일리노이-22-tdTomato BAC 반응 시스템 100 ㎕에 제한 endonucleasePi-SceI 제한 효소의 5 μL와 소화에 의해 (10 μg의) 구성 및 전핵 단계 (13)에서 C57BL / 6 여성의 수정란에 선형화 된 BAC DNA를 microinject 선형화. Scre표준 절차를 사용하여 꼬리 생검에서 분리 된 DNA의 서던 블롯 분석에 의해 형질 전환 마우스 갖추고 있습니다.
비장, 흉선, 림프절 및 파이어 판 2. 단일 셀 준비
참고 : IL-22 tdTomato 기자 마우스는 국립 암 연구소 (NCI, 프레데릭, MD)에서 유지되었다. 안락사 방법은 안락사에 대한 가장 최근의 AVMA 지침을 준수합니다. 모든 마우스는 CO 2 흡입 (14)를 이용하여 안락사시켰다.
- 공동 2 챔버에서 IL-22 tdTomato 마우스를 안락사 깨끗한 패드에 넣어. 70 % 알코올을 분무하여 복부 피부를 소독 및 오픈 잘라. 왼쪽 측면에서 비장과 흉골 뒤에 흉선을 제거합니다.
- mesentericlymph 노드 (장간막 조직에 위치) 및 (소장의 회장 영역에 걸쳐 작은 lymphoidnodules) 파이어 패치를 수확, 진주 흰색 장간막은 마에 가까운 노드들이 가지고몸에서 전체 소장과 대장을 제거 먼저 미세 포인트 톱니 모양의 팁 집게를 해부하여 소장의 그는 벽. 장내 따라 확장 된 타원형 패치 (파이어 패치)를 찾아 가위로 잘라. PBS / 1 % 소 태아 혈청 (FBS) 빙냉 완충액 단일 세포 현탁액에 개별적으로 두 젖 슬라이드 사이 이러한 림프 조직 (림프절 및 파이어 패치) 연마.
- 단계 2.2에서와 동일한 방법을 사용하여 비장 또는 흉선 조직을 말하다. 500 XG에 8 분, 4 ° C를위한 비장 현탁액을 원심 분리기. 세포 펠렛에 비장 당 ACK 용균 버퍼의 1 ML을 추가합니다.
- 잘 혼합하고 1 분간 방치 할 수 있습니다. 각 샘플에 멸균 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 버퍼 9 ML을 추가합니다. 적혈구를 제거하기 위해 500 × g으로 4 ℃에서 8 분 동안 원심 분리에 의해 스핀 다운.
참고 : 흉선 세포에 ACK 용균 버퍼를 추가하지 마십시오. - PBS 및 P 5ml에 생성 된 백혈구를 재현 탁100㎛의 세포 여과기를 통하여 세포 엉덩이. 8 분 동안 500 XG에서 원심 분리하여 세포 알약을 수집합니다.
- RPMI 매체 또는 FACS 완충액 5 ml의 세포를 재현 탁 및 0.4 % 트리 판 블루 염색 / PBS 용액을 이용하여 생존 세포 수를 계산.
장내에서 상피내 림프구와 얇은 판의 propria 세포의 3. 분리
- 바로 항문 위 (가까운 부록에) 회장, 전체 대장에 십이지장에서 (옆에 위장), 단계 2.1에서와 같이 복부 피부를 열고 소장을 잘라. 여분의 지방과 장간막 조직하여 집게를 제거합니다. 얼음처럼 차가운 PBS 즉시 창자를 넣습니다.
- 소장의 말단 지역을 따라 파이어 패치 (소, 거친 결절)을 찾습니다. 집게 andopen 가위를 사용하여 세로 장을 사용하여 질량을 제거합니다. 철저하게 얼음처럼 차가운 PBS 10 mL로 장을 세척하십시오.
- 예비 분해 완충액 (5 mM의 EDTA 20ml에 조직을 인큐베이션및 통 천천히 회전 (50 RPM)와 37 ° C에서 30 분 동안 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS))에 1 mM의 디티 오 트레이 톨. 이 배양 후 각 강렬한 텍싱 (12,000 rpm에서 30 초)함으로써, 상피내 림프구 (IELs)를 포함하는, 상피 세포 층을 제거하고, 100㎛의 셀 스트레이너를 통해 모든 조직을 통과한다.
- 37 ° C에서 30 분 동안 인큐베이션 초 조직 새로운 EDTA 용액 20 ㎖를 추가한다. 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 IEL의 분수를 전달하고 이전 분수로 수영장. 얼음에 남아있는 소장의 조각을 유지 단계 3.9에서 처리한다.
- 4 ℃에서 5 분 동안 800 XG에서 풀링 된 IEL의 분수를 원심 분리기. HBSS / 5 % FBS 10 mL로 풀링 IEL의 분수를 세척하고 800 XG에 5 분, 4 ° C를 위해 그들을 스핀 다운.
- 44 % 콜로 이달 실리카 매질 (15)의 8 mL 중에 세포를 재현 탁하고 5 ㎖의 67 % 콜로 이달 실리카 매체로 오버레이. 44 % / 67 원심 분리기실온에서 20 분간 1,500 × g으로 0.5 %에 대한 세포 혼합액 구배.
- 계면에서의 주파수 대역에서 IEL 세포를 수집한다. 첫째, 1 ML의 피펫을 사용하여 상층 액 (5 ㎖)의 상단 층을 제거. 그 후, 콜로이드 실리카 매질 구배의 계면에서 수확 IELs.
- RPMI 배지 10 ㎖를 추가하여 IELs을 씻으십시오. 800 XG에 5 분, 4 ° C를위한 세포를 스핀 다운. 단계 3.15에 대한 RPMI 5 ㎖에 IELs을 재현 탁.
- 고유 층 림프구 분리 (LPLS)의 경우, (1 ㎜) 가위를 사용하여 작은 조각으로 단계 3.4로부터의 창자 조직 절편 말하다 및 (콜라게나 0.05 g, DNaseI 0.05 g을 분해 완충액 10 mL로 조각 다이제스트 37 ° C에서 15 ~ 20 분 동안 RPMI / 5 % FBS에서 디스 파제 II) 0.3 g.
- 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 혼합물을 필터링합니다. 플로우를 통해 상층 액을 방출 LPL이 포함되어 있습니다.
- 완전 정상 (단계 3.9-3.10를 반복하여 장 단편을 소화, 그들은해야합니다) 3 회 반복. 마다 LPLS을 함유하는 상등액을 풀링.
- 1,500 × g으로하고, 실온에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포를 수집하고 RPMI / 5 % FBS에 재현 탁 펠릿. 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 전달합니다.
- 40:80 콜로이드 실리카 매질 구배의 40 % 분율의 10 ml의 세포 펠렛을 재현 탁하고, 15 ㎖의 튜브에 80 % 분획 5 ㎖에 입혀.
- 1,500 × g으로하고, 실온 15 20 분 동안 원심 분리하여 밀도 구배 분리를 수행한다.
- 단계 3.7에 설명 된대로 LPLS를 수집합니다. PBS의 10 ㎖로 한 번에 씻어 PBS / 1 % FBS가 버퍼 또는 RPMI 배지 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁.
- 0.4 % 트립 판 블루 염색 / PBS 용액을 이용하여 생존 세포 (IELs 및 LPLS 모두) 개수.
대장염에서 IL-22 tdTomato 4. 식
- 1 × 10의 농도에서 IL-22 TdTomato 마우스에서 하나의 비장 세포 현탁액을 준비 <SUP> 7 세포 단계 2.1-2.4에 기재된 멸균 PBS에 / ㎖.
- 마우스 CD4 세포 제외 분리 방법 (10)을 사용하여 CD4 + T 세포를 정제 하였다. , 및 안티 CD45RB-FITC (클론 16A (PBS / 1 % FBS 버퍼에, 복제 RM4-5 0.5 μL / 1 × 10 6 세포)를 방지 CD4-APC와 PBS 0.5 μL / 1 × 10 6 세포를 라벨 30 분 동안 4 ° C에서 배양하여 / 1 % FBS 버퍼).
- 500 XG에 5 분, 4 ° C를위한 세포를 스핀 다운. PBS / 1 % FBS 버퍼의 2 ml의 세포를 세척하고 PBS / 1 % FBS 염색 버퍼 1 ㎖에서 그들을 재현 탁.
- 기계 (16) 세포 계측법 흐름에 표시된 T 세포를 실행합니다. 게이트는 A-T 세포 집단에서 세포 및 CD4 + 정렬 CD45RB 높은 이중 양성 세포 (488 nm 내지 633 nm의 레이저 파장에서 검출).
- 500 XG에 5 분, 4 ° C에 대한 원심 분리에 의해 정렬 된 세포를 수확. 1 × 10 6에 멸균 PBS 완충액으로 세포를 재현 탁 펠렛 106)를 주입한다.
- 다양한 시점에서 CO 2 하에서받는 마우스를 희생한다. 단계 2.1 및 2.2에 기술 된 바와 같이, 장간막 림프절 및 소장과 대장 수확. 조직를 해결하기 위해 밤새 각 장간막 림프절을 넣고 잘라 오픈 소장 (종이 / 장 / 종이 샌드위치)를 4 % 파라 포름 알데히드에 (흄 후드 처리 PFA). 16 ~ 24 시간 동안 18 % 자당과 함께 PFA를 교체 한 후 절편의 조직을 동결.
- 조직 17, 18, 19 잘라 저온 유지 장치 기계를 사용합니다. 약 60 분 동안 실온으로 조직 절편을 가온하고 실온에서 10 분 동안 아세톤에 배치. 약 5 분 동안 실온에서 건조한다.
- , 초과 FBS를 추가 피펫으로 제거하고, 1 항 RFP를 추가 : 200 희석 0.1의 %의 BSA / 1X PBS. 60 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션 항체.
- 10 분 동안 1X PBS의 부분을 씻어 조직에 대응하는 차 항체 (염소 항 - 토끼 (568))을 적용, 1 희석 : 300 1 %의 BSA / 1X PBS, 실온에서 30 분 동안.
- 10 분 동안 1X PBS에서 슬라이드를 씻어 그들을 건조 닦아 및 커버 슬립을 추가합니다.
- 40X 목표를 사용하여 (여기 필터 540-580 nm의 RFP) 일관된 조명 아래 형광 현미경으로 모든 샘플을 시각화합니다.
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Representative Results
쥐 IL-22 리포터 유전자는 IL-22 궤적을 운반하는 박테리아 인공 염색체를 수정 recombineering를 사용하여 만들었습니다. 도 1은 sacBII 유전자 양성 선택 마커 및 항생제 클로람페니콜 내성 유전자를 함유하는 11 pBACe3.6 벡터의도를 나타낸다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 엑손 1에 tdTomato를 도입 한 후, 신호 펩티드 서열이 중단되었다. 따라서, tdTomato 기자 유동 세포 계측법하여 탐지 및 차단을 가능하게는 IL-22 발현 세포 안에 갇혀 있었다. 동형 접합성 마우스는 설립자 라인에서 사육 PCR에 의해 상영하고, 보통의 노크에 전략 필요로 그들은 유전 적 정체성과 자손을 달성하기 위해 교잡을 필요로하지 않았다되었다. 일리노이-22 기자의 충실도를 테스트하려면, 체외 -generated 비장 세포는 Th22 또는 중성 조건에서 배양 하였다.
그림 1 : pBACe3.6 벡터의 사이트 맵. pBACe3.6는 항생제 내성 및 클로람페니콜 포지티브 선별 마커로서 sacBII 유전자를 포함하는 것을 특징으로한다. 재조합하는 동안, 원하는 클론 자당에 강한 자신이 sacBII 유전자를 발현과 음극 BAC 식민지가 자당에 민감한 반면, 자당 함유 미디어에 성장 허용을 통해입니다.
그림 2 : 수정 RP23-401E11 BAC 클론의 개략도. tdTomato 리포터 유전자 recombineering 기술을 이용하여 쥐 세균 인공 염색체 (BAC의 RP23-401E11)에 IL-22 및 조절 요소를 포함하는 IL-22의 궤적에 도입 하였다. 상동 재조합에 의해 상기에서 IL-22의 신호 펩티드 서열 BAC는 중단하고, 엑손 IL-22의 1은 tdTomato 리포터 유전자로 대체했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 비장 세포에서 IL-22 기자의 확인은 체외에서 배양. CD4 T 세포는 비장으로부터 정제 한 후 항 CD28 자극 하였다; 항 CD3 (중립 상태); 오일 또는 항 CD3, 항 CD28, 항 IFNƳ 방지 IL4, IL-6, TGF-β, 및 6- Formylindolo (3,2-b) 카르 바졸 (FICZ). (100 μm의 바닥이, 스케일 바) IL-22 tdTomato는 흐름 (이 상) 세포 계측법 및 형광 현미경으로 분석 하였다. 사분면의 숫자는 CD45 + 세포의 비율을 나타낸다.대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 다른 마우스 조직에서 세포를 IL이-22 생산의 시각화. 단일 세포 현탁액은 비장, 흉선, 림프절, 소장 (IEL과 LP) 및 파이어 판으로부터 제조 하였다. 그런 다음 FITC-항 CD3과 표면 염색 tdTomato의 발현을 조사 하였다. MLN는 : 장간막 림프절, ALN : 겨드랑이 림프절, PP : 파이어 판, IEL : 소장으로부터 격리 상피 세포는 LP : 점막 고유 세포는 소장에서 정제 하였다. 사분면의 숫자는 CD45 + 세포의 비율을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : T 세포 전송 대장염의 개발 기간 동안 IL-22 기자의 현지화. 대장염의 개발시 다른 시점에서 다른 조직에 의해 면역 된 마우스 및 tdTomato 신호 평가 - / - IL-22 리포터 생쥐 CD4CD45RBHigh T 세포 Rag1로 옮겼다. 화살표는 IL-22 tdTomato 신호를 가리 킵니다. 스케일 바는 25 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
IL-22는 타고난 호스트 방어 및 조직 리모델링에 필수적인 역할을한다. IL-22 생산 세포는 세포 내 염색 생체 확인되었다. 그러나, 여전히 정상 상태 또는 염증성 질환의 하나, 반응계에서 IL-22의 발현을 추적하는 것이 곤란 남아있다. 이 프로토콜은 생체 내에서 리포터 발현 세포 지역화 우리 가능하게하는 IL-22 리포터 마우스 모델을 개발하기위한 새로운 방법을 설명한다. 리포터 유전자 부호화 TdTomato는 신호 서열을 방해 사이트에서 IL-22 유전자좌로 삽입 하였다. 기자의이 전략의 결과를 생성하는 세포의 가시화를 가능하게, IL-22 분비 빠르게 달리 생산 세포에 포획된다. 조작 된 IL-22은 리포터 따라서, 조절 요소를 유지하는 IL-22에 대응하는 리포터의 발현 충실도를 부여하는 목적으로, 큰 BAC에 포함시켰다. 형질 m의 창자 조직얼음은 소장 점막 고유의 CD4 T 세포의 타고난 림프구 항상성 리포터 발현을 표시. 유도 성 대장염에서 CD4 T 세포는 대장에서 기자를 표명했다.
염증성 장 질환에서 IL-22의 역할은 불분명왔다. 장 점막의 방어 및 조직 재생에 참여함으로써, IL-22, 22 모두 보호막 (20)의 제조 21 유도 할 및 염증성 매개체 (예, IL-8) 23 (24). - / - 마우스 (25), (26) 및 CD45RB 안녕 전송 모델 27 T 세포 구동 대장염 두 모델의 TCR α 포함 결장에서 IL-22의 증가를 보였다. 염증성 장 질환 모델을 비교, 소장에서 IL-22의 발현은 CR 높았다- / - 궤양 성 대장염 (21) (24) 문서라도의 모델 OHN 병 modelthan, 우리 Rag1에 리포터 생쥐 CD4CD45RBhi T 세포를 전송받는 및 크론 병의 발병 과정을 모방. 우리는 대장염 앞, IL-22 기자가 장 배수 림프절 (MLN)에서 가시화 된 것을 발견했다. 신호는 다음 MLN 줄어들 대장염의 발달과 함께, 내장, 특히 말단부 소장과 결장으로 옮겼다. 대부분의 tdTomato 기자는 소장의 점막 고유 층 점막 내부 현지화되었다.
IL-22에 대한 리포터 다른 유형의 이전에있는 세포는 영구적와 딸 (28)을 계속하고 IL-22의 전사 여부 리포터 표현 계속되도록 표시되고 설명되었다. 우리의 연구, 장 타고난 림프구에서와 같이 대장염에서, t 항상성 조건으로 표시하고 있었다그 기자 창자 조직 장간막 림프절에서 T 세포에 편재되었다.
이 프로토콜에 기재된 절차 등등 같은 IL-17, IL-25과 같은 다른 유전자 리포터 생쥐의 구축에 적용 할 수 있으며, 것이다. 형질 전환 유전자가 임의로 마우스 게놈에 통합되므로 그러나, 리포터 유전자 발현의 정확도를 보장하기 위해 원위 조절 요소를 운반 적합한 BAC 클론을 선택하는 것이 중요하다. 리포터 마우스 생체 내에서뿐만 아니라, 생균의 정제 및 특성화를위한 발현 세포의 식별을 허용한다. 우리는 살아있는 동물 영상 연구를위한 기자에 적합하게 형광 리포터 유전자로, tdTomato, 예외적으로 밝은 적색 형광 단백질을 사용했다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
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References
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