Abstract
Reporter mus har blitt mye brukt til å observere lokalisering av uttrykk for målrettede gener. Denne protokollen fokuserer på en strategi om å etablere en ny transgen reporter mus modell. Vi valgte å visualisere interleukin (IL) 22 genekspresjon fordi dette cytokinet har viktige aktiviteter i tarmen, hvor den bidrar til å reparere vev skadet ved betennelse. Rapportør systemer tilbyr betydelige fordeler i forhold til andre metoder for å identifisere produkter in vivo. I tilfellet av IL-22, hadde andre studier først isolert celler fra vev, og deretter re-stimulerte celler in vitro. IL-22, som normalt utskilles, ble fanget inne i cellene ved bruk av et medikament, og intracellulær farging ble brukt for å visualisere det. Denne metoden identifiserer celler i stand til å produsere IL-22, men det betyr ikke avgjøre om de gjorde det i vivo. Reporteren design inkluderer innsetting av et gen for en fluorescerende protein (tdTomato) inn i IL-22-gen i en slik way at den fluorescerende protein ikke kan bli utskilt, og derfor forblir innesperret i de produserende celler in vivo. Fluorescerende produsenter kan deretter visualiseres i vevssnitt eller ved ex vivo-analyse ved flowcytometri. Selve konstruksjonen Fremgangsmåte for reporter inkluderte recombineering et bakterielt kunstig kromosom som inneholdt IL-22-genet. Dette konstruerte kromosom ble deretter innført i musegenomet. Homeostatisk IL-22 reporter-ekspresjon ble observert i forskjellige muse vev, inkludert milt, thymus, lymfeknuter, Peyers lapp, og tarm, ved strømningscytometri-analyse. Kolitt ble indusert av T-celle (CD4 + CD45RBhigh) overføring, og reporter ekspresjon ble visualisert. Positive T-celler var først til stede i mesenteriske lymfeknuter, og da de samlet seg inne i lamina propria av distale tynntarm og tykktarm vev. Strategien bruker BACS ga god troskap reporter uttrykk i forhold til IL-22 expressjon, og det er enklere enn knock-in prosedyrer.
Introduction
Celletype-spesifikke uttrykk for reporter gener er nyttig å identifisere celler som aktivt uttrykker målet i vev under homeostatiske og forstyrrede stater. Den gjør det også for rensing av disse cellene, som fortsatt er levedyktig, for å studere de andre egenskapene. Rapportør mus er blitt benyttet i belyse virkningsmekanismen for spesifikke cytokiner, transkripsjonsfaktorer, og regulatoriske elementer. Tidligere strategier 1, 2, 3 er i stor grad avhengig av å banke reporteren inn i målet locus i musekromosomet, en tidkrevende og kostbar prosedyre. Således er en enklere metode for generering av rapportør mus ønskelig.
Cytokiner er en bred klasse av små, utskilte proteiner / peptider som regulerer immunresponser gjennom intercellular signalisering. Interleukin 22 (IL-22) er et cytokin med mange rapporterte aktiviteter, inkludert barriere fuksjon, reparere vev, og betennelse 4. Selv om IL-22 ble først oppdaget som en T-celle produkt 5, senere rapporter demonstrert sitt uttrykk i natural killer (NK) celler hos mennesker 6 og mus 7 og i andre klasser av medfødte lymfocytter 8. Til tross for omfattende observasjon av IL-22-produserende celler, visualisering av IL-22 tidligere krevde ex vivo stimulering og permeabilization til flekker med antistoffer. Derfor ville roman IL-22 reporter mus være et svært nyttig verktøy for å undersøke funksjonen av IL-22 i homeostatiske og patogene prosesser.
Her har vi utviklet en forenklet transgen reporter musemodell for å ta hensyn til de IL-22-produserende celler in vivo og in vitro. Ved hjelp av en BAC recombineering metode 9, innsatt vi den tdTomato cDNA-sekvensen med poly A signal-fragmenter inn i IL-22 locoss og erstattet ekson 1. De andre utranslaterte regioner, eksoner, og regulatoriske elementer ble ikke forstyrret, siden vi ønsker å etterligne den naturlige regulering av IL-22 så mye som mulig. Stedet for reporter innsettings forstyrrer signalsekvensen, noe som resulterer i akkumulering av reporter inne i produserende celler, i motsetning til IL-22 selv, som hurtig utskilles. Denne nye fremgangsmåten kan også brukes til generering av rapportør mus for andre utskilte proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr fikk forsvarlig behandling i samsvar med de eksperimentelle prosedyrene beskrevet i 2011 Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr Committee of Frederick National Laboratory for Cancer Research.
1. Generering av IL-22-tdTomato Reporter mus ved BAC Recombineering
MERK: Musene bør være bevisstløs og ikke beveger seg i respons til en skadelig stimulus. Sterilisere kirurgiske området med 70% etanol og sterilisere alle kirurgiske verktøy ved hjelp av et glass perle sterilisator.
- Rens BAC-DNA (RP23-401E11, klon lengde 228391 bps) under anvendelse av en alkalisk ekstraksjon metode 10, 11. Prege BAC klone av Spel fordøyelse av 5 mikrogram RP23-401E11 å bekrefte den korrekte størrelsen på målet genet. MERK: BAC DNA ble fordøyd i 14 fragmenter.
- Sett TdTomato reporter-genet inn i det ikke I / Sal I-setet til den PLD53SC-A-GFP-B shuttle vector11 og erstatte GFP-genet i det samme området. Deretter, ved hjelp av BAC RP23-401E11 som en mal, forsterke homologi boksene (A og B) til det første ekson av oversatte Il-22 (ekson 1) ved hjelp av PCR (95 ° C 2 minutter, 30 sykluser av 95 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sek, og 72 ° C i 30 sekunder, og en endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 minutter). I et 50 ul PCR-reaksjonssystem, tilsett 50 ng (1 mL) av BAC-DNA, 0,5 ul av primere (10 pM), 40 ul av PCR-Supermix high fidelity, og 8 ul H2O
MERK: primere for A- og B-boksene er som følger: En boks Forward: 5'T GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG og bakover: 5'CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC; B boksen Forward: 5'G TTAATTAA CTGCCCGTCAACA og bakover: 5'T GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10. Stedene av restriksjonsenzymer (Asc I og Pac I) er understreket. - Ligere 500 ng av Asc I-spaltet A og 500 ng av Pac I-spaltet B fragmentene til 50 ng av PLD53SC-ATB (tdTomato) vektor ved 16 ° C i 1 time.
- Omforme det rensede PLD53SC-ATB-vektoren inn i BAC-kompetente celler 11 og kultur dem på Luria-Bertani (LB) agarskåler med kloramfenikol (20 ug / ml) og ampicillin (30 ug / ml) ved 37 ° C. Plukk to til tre kolonier av co-integrere fra Ch / Amp mester plater.
- Inokulere hver koloni i 1 ml LB supplert med 20 ug / ml kloramfenikol og inkuber dem i 1 time ved 37 ° C og 225 rpm. Spre 100 ul av hver blanding på en LB-agarplate (10 g pepton 140, 5 g gjærekstrakt, 12 g agar, og 1 liter vann; pH 7,5) supplert med kloramfenikol og 4-4,5% sukrose. Inkuber kulturen over natten ved 37 ° C.
- Plukk både store og små kolonier og replate dem på to LB-agar plater med kloramfenikol. Deretter utsette platene enten med eller uten UV-lys i 30 sekunder og plukke UV-sensitive kolonier for videre analyse.
- Identifiser endret BAC DNA ved PCR ved bruk tdTomato / IL-22 heterozygot primer (Forward: 5 'ACT TGT GCG ATC TCT Gat GGT, Omvendt: 5' TGT AAT CGG GGA TGT CGG C). Thermocycler Betingelsene er som følger: 95 ° C i 2 minutter; 30 sykluser av 95 ° C i 30 sek, 56 ° C i 30 sek, og 72 ° C i 30 sekunder; og en endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 min.
- Bekrefte sekvensen av det modifiserte område av BAC ved direkte sekvensering av BAC i stor prep BAC DNA 12.
- Anesthetize en mottaker mus med en dose på 0,25% tribromoethanol inn i bukhulen når implantere microinjected zygotes i pseudo-gravid C57BL / 6c mus.
- Linearisere IL-22-tdTomato BAC konstruere (10 ug) ved nedbryting med 5 pl restriksjons endonucleasePi-SCEI i 100 ul av reaksjonssystemet og microinject det lineariserte BAC-DNA inn i befruktede egg av C57BL / 6 hunner ved den pronuclear trinnet 13. skrueno den transgene mus ved Southern blot-analyse av DNA isolert fra hale biopsier ved anvendelse av standardprosedyrer.
2. Single-celle klargjøring fra milt, thymus, lymfeknuter og Peyer sin Patch
MERK: IL-22-tdTomato reporter mus ble opprettholdt ved National Cancer Institute (NCI, Frederick, MD). Den dødshjelp metoden oppfyller de siste AVMA Retningslinjer for aktiv dødshjelp. Alle mus ble avlivet ved hjelp av CO 2 innånding 14.
- Avlive en IL-22-tdTomato mus i en CO 2 kammer og sette den på en ren pad. Steril magen huden ved å spraye 70% alkohol og skjær den åpen. Fjern milten i venstre flanke og thymus bak brystbenet.
- For å høste mesentericlymph noder (ligger i mesenteric vev) og Peyers patcher (små lymphoidnodules hele ileum region av tynntarmen), ta den perlehvite mesenteric noder nært til than veggen i tynntarmen ved hjelp dissekere pinsett med fin-punkt taggete tips først, og deretter fjerne hele tynntarmen og tykktarmen ut av kroppen. Finn den utvidede ovale patcher (Peyers patcher) langs gut og klippe dem med saks. Slipe disse lymfoid vev (lymfeknuter og Peyers lapper) hver for seg mellom to frosne glir inn i en enkeltcellesuspensjon i PBS / 1% føtalt bovint serum (FBS) buffer på is.
- Hakke milt eller thymus vev ved hjelp av samme metode som i trinn 2.2. Sentrifuger miltsuspensjon i 8 min ved 500 xg og 4 ° C. Tilsett 1 ml av ACK lyseringsbuffer per milt til cellepelletene.
- Bland godt og la dem stå i 1 min. Legg 9 ml steril fosfatbufret saltløsning (PBS) buffer til hver prøve. Spinne ned ved sentrifugering i 8 minutter ved 500 xg og 4 ° C for å fjerne de røde blodcellene.
MERK: Ikke legg ACK lysebuffer til thymus celler. - Resuspender de oppnådde leukocytter i 5 ml PBS og pass cellene gjennom en 100 mikrometer celle sil. Samle cellepelletene etter sentrifugering ved 500 x g i 8 min.
- Resuspender cellene i 5 ml RPMI-medium eller FACS-buffer og telle levedyktige celler ved hjelp av 0.4% trypan blått fargestoff / PBS-oppløsning.
3. Isolering av intraepitelial lymfocytter og lamina propria Celler fra tarmen
- Åpne abdominal hud som i trinn 2.1, kutte tynntarmen, fra tolvfingertarmen (ved siden av magen) til ileum (nær vedlegg), og hele tykktarmen, rett ovenfor anus. Fjern den ekstra fettvev og vev ved hjelp av tang tarmens. Sett tarmen umiddelbart i iskaldt PBS.
- Se for Peyers lapper (små, grove knuter) langs den ytre region av tynntarmen. Fjern massene ved hjelp av pinsett Andopen tarmen på langs med saks. skylle tarmen med 10 ml iskald PBS grundig.
- Inkuber vev i 20 ml av pre-fordøyelse buffer (5 mM EDTAog 1 mM ditiotreitol i Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS)) i 30 minutter ved 37 ° C med langsom rotasjon (50 rpm) i en shaker. Etter hver av 2 inkubasjoner, fjerne epitelcellelaget, inneholdende de intraepitelial lymfocytter (IELs), ved intens virvling (30 sekunder ved 12 000 rpm) og passere alle vev gjennom en 100 mikrometer celle sil.
- Tilsett 20 ml ny EDTA-løsning til vevet for andre inkubasjon i 30 minutter ved 37 ° C. Før de IEL fraksjoner gjennom en 100 mikrometer celle sil og basseng dem med de tidligere fraksjoner. Hold de rester tarmen fragmenter på is for å bli behandlet i trinn 3.9.
- Sentrifuger sammenslåtte IEL fraksjoner på 800 xg i 5 min ved 4 ° C. Vask de sammenslåtte fraksjonene IEL med 10 ml HBSS / 5% FBS og spinne dem ned i 5 minutter ved 800 xg og 4 ° C.
- Resuspender cellene i 8 ml av 44% kolloidal silika medium 15 og klæ dem med 5 ml av 67% kolloidalt silisiumoksid medium. Sentrifuger 44% / 670,5% celleblanding gradient i 20 minutter ved romtemperatur og 1500 x g.
- Samle IEL celler fra bandet på grensesnittet. Først fjerne det øverste laget av supernatanten (ca 5 ml) ved hjelp av en ml pipette. Deretter, slakte IELs på inter av kolloidalt silika medium gradient.
- Vask IELs ved tilsetning av 10 ml RPMI-medium. Spinn cellene ned i 5 min ved 800 xg og 4 ° C. Suspender IELs i 5 ml RPMI for steg 3,15.
- For isolering av lamina propria lymfocytter (LPLs), hakke tarmen vevfragmenter fra trinn 3,4 i små stykker ved hjelp av en saks (1 mm) og fordøye stykker med 10 ml fordøyelse buffer (0,05 g kollagenase, 0,05 g DNaseI, og 0,3 g av dispase II i RPMI / 5% FBS) i 15-20 minutter ved 37 ° C.
- Filtrer blandingen gjennom en 70 um celle sil. Gjennomstrømnings supernatant inneholder det frigjorte LPL.
- Fullt fordøye tarmen fragmenter ved å gjenta trinn 03.09 til 03.10 (normalt, må de væregjentatt 3 ganger). Hver gang, basseng supernatantene inneholder LPLs.
- Samle cellene ved sentrifugering i 5 min ved 1500 x g og romtemperatur og resuspender pelleten i RPMI / 5% FBS. Passere dem gjennom en 40 mikrometer celle sil.
- Resuspender cellepelletene i 10 ml av 40% fraksjonen av en 40:80 kolloidal silika medium gradient og overlappe dem på 5 ml av den 80% fraksjon i et 15 ml rør.
- Utføre densitetsgradient separasjon ved sentrifugering i 20 minutter ved 1500 xg og romtemperatur 15.
- Samle LPLs, slik det er beskrevet i trinn 3,7. Vaske dem én gang med 10 ml PBS og resuspender pelleten i 1 ml PBS / 1% FBS-buffer eller RPMI-medium.
- Telle levedyktige celler (både IELs og LPLs) med 0,4% trypan blått fargestoff / PBS løsning.
4. Uttrykk av IL-22-tdTomato i kolitt
- Fremstille enkeltmiltcellesuspensjoner fra IL-22-TdTomato mus i en konsentrasjon på 1 x 10 <sup> 7 celler / ml i steril PBS som beskrevet i trinn 2,1-2,4.
- Rense CD4 + T-celler ved hjelp av musen CD4 Cell Negativ Isolation metode 10. Merke dem med anti-CD4-APC (klon RM4-5, 0,5 ul / 1 x 10 6 celler i PBS / 1% FBS-buffer) og anti-CD45RB-FITC (klon 16A, 0,5 ul / 1 x 10 6 celler i PBS / 1% FBS-buffer) ved inkubering ved 4 ° C i 30 minutter.
- Spinn cellene ned i 5 min ved 500 xg og 4 ° C. Vask cellene med 2 ml PBS / 1% FBS-buffer og resuspender dem i 1 ml PBS / 1% FBS farging buffer.
- Kjør de merkede T-celler på en flowcytometri maskin 16. Gate cellene på en T-cellepopulasjon og sorterings CD4 + CD45RB høye dobbelt-positive celler (den bølgelengde oppdaget ved 488 nm og 633 nm lasere).
- Høste sorterte cellene ved sentrifugering i 5 minutter ved 500 xg og 4 ° C. Resuspender cellepelletene i steril PBS-buffer ved 1 x 10 6 6) inn i peritoneum ofeach Rag1 - / - mottaker mus.
- Offer mottaker mus i henhold til CO 2 ved forskjellige tidspunkter. Høste mesenteriske lymfeknuter og de små og store tarmen, som beskrevet i trinn 2.1 og 2.2. Sett hver mesenterisk lymfeknute og kutte åpne tarmen (papir / tarm / papir sandwich) i 4% paraformaldehyde (PFA, håndtere under en avtrekkshette) over natten for å fikse vev. Skift PFA med 18% sukrose for 16-24 timer og deretter fryse vev for seksjonering.
- Bruk kryostaten maskin for å skjære vevet 17, 18, 19. Varm vevssnittene til romtemperatur i ca 60 min, og plassere dem i aceton i 10 minutter ved romtemperatur. Tørke dem ved romtemperatur i ca 5 min.
- Legg FBS i overkant, fjerne den med pipette, og legge til anti-RFP på en 1: 200 fortynning i 0,1% BSA / 1x PBS. Inkuber antistoffet ved 37 ° C i 60 min.
- Skyll delene i 1 x PBS i 10 minutter og anvende den tilsvarende sekundært antistoff (geite-anti-kanin 568) til vevet, fortynnet 1: 300 i 1% BSA / 1 x PBS i 30 min ved romtemperatur.
- Skyll lysbilder i 1x PBS i 10 minutter, tørk dem tørre og tilsett Dekk.
- Visualiser alle prøvene med et fluorescerende mikroskop etter konsekvent belysning (RFP: eksitasjonsfilteret 540-580 nm) med 40X objektiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En murine IL-22 reporter transgenet ble opprettet ved hjelp recombineering å endre en bakteriell kunstig kromosom som bærer IL-22 locus. Figur 1 viser et diagram av pBACe3.6 vektor inneholdende sacBII-genet, et positiv-seleksjonsmarkør, og kloramfenikol antibiotisk resistensgen 11. Etter innføring av tdTomato inn i ekson 1, ble det signal peptidsekvens forstyrret, som vist i figur 2. Dermed ble tdTomato reporter fanget inne i IL-22-uttrykkende celler, slik at deres oppdagelse og isolering av flowcytometri. De homozygote Musene ble avlet fra grunnlegger linjer og screenet ved hjelp av PCR, og de krever ikke tilbakekryssing for å oppnå avkom med en genetisk identitet, slik det kreves ved den vanlige knock-in-strategi. For å teste kvaliteten til de IL-22 journalister, in vitro dannede splenocytes var dyrket med Th22 eller nøytrale forhold.
Figur 1: Site kart over pBACe3.6 vektor. pBACe3.6 er kjennetegnet ved at de inneholder kloramfenikol-resistens og en sacBII gen som en positiv seleksjonsmarkør. Under rekombinasjon, de ønskede klonene er sukrose-resistente gjennom deres ekspresjon av genet sacBII og får lov til å vokse på sukrose-inneholdende medium, samtidig som de negative BAC koloniene er sukrose-sensitive.
Figur 2: skjematisk riss av den modifiserte RP23-401E11 BAC-klon. En tdTomato reporter-gen ble innført i Il-22 locus, som omfatter IL-22 og regulatoriske elementer i en murin bakterielt kunstig kromosom (BAC RP23-401E11), ved hjelp av recombineering teknologi. Ved homolog rekombinasjon, sekvensen av signal-peptidet av IL-22 i BAC ble avbrutt og ekson 1 av Il-22 ble erstattet av tdTomato reporter genet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Identifisering av IL-22 journalister i splenocytter dyrket in vitro. CD4 T-celler ble renset fra milten og deretter stimulert med anti-CD28; anti-CD3 (nøytral tilstand); eller anti-CD3, anti-CD28, anti-IFNƳ, anti-IL4, IL-6, TGF-β, og 6-Formylindolo (3,2-b) karbazol (FICZ) i 5 dager. IL-22-tdTomato ble analysert ved flowcytometri (topp to) og fluorescerende mikroskopi (nederst to, skala bar: 100 mikrometer). Tallene i kvadrantene indikerer prosenten av CD45 + celler.target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Visualisering av IL-22-produserende celler i forskjellige musevev. Enkeltcellesuspensjoner ble fremstilt fra milt, thymus, lymfeknuter, tarmer (IEL og LP), og Peyers lapp. De ble deretter overflate-farget med FITC-anti-CD3 og kontrollert for tdTomato ekspresjon. MLN: mesenterisk lymfeknute, ALN: aksillær lymfeknute, PP: Peyer sin patch, IEL: intraepitelial celler isolert fra tynntarmen, LP: lamina propria celler renset fra tynntarmen. Tallene i kvadrantene indikerer prosenten av CD45 + celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Lokalisering av IL-22 reportere under utviklingen av T-celle overføring kolitt. CD4CD45RBHigh T-celler fra IL-22 rapportør mus ble overført til Rag1 - / - mus, og de tdTomato signalene ble evaluert ved immunhistokjemi i de forskjellige vev på ulike tidspunkter under utviklingen av kolitt. Pilene peker på de IL-22-tdTomato signaler. Skala barer = 25 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IL-22 spiller en avgjørende rolle i medfødt vertens forsvar og vev ombygging. IL-22-produserende celler er blitt identifisert ex vivo ved intracellulær farging. Imidlertid gjenstår det fremdeles vanskelig å spore IL-22-ekspresjon i situ, enten i normal tilstand eller i inflammatoriske tilstander. Denne protokollen beskriver en ny fremgangsmåte for å utvikle et IL-22 reporter musemodell, noe som gjør det mulig å lokalisere rapportør-uttrykkende celler in vivo. Reportergenet som koder for TdTomato ble innsatt i IL-22-locus på et sted som forstyrrer signalsekvensen. Denne metoden resulterer i reporteren være fanget i den produserende celle, i motsetning til IL-22 som raskt skilles ut, muliggjør visualisering av den produserende cellen. Den konstruerte IL-22-reporter er inneholdt i en stor BAC, med sikte på å bevare de regulatoriske elementer, således givende gjengivelse av ekspresjon av reporter tilsvarer den for IL-22. Intestinal vev av transgene mis vist homeostatisk reporter ekspresjon i CD4 T-celler og lymfocytter iboende i lamina propria i tynntarmen. I indusert kolitt, CD4 T-celler uttrykt rapportøren i tykktarmen.
Rollen av IL-22 hos pasienter med inflammatorisk tarmsykdom har vært uklar. Ved å delta i slimhinnene i tarmen forsvar og regenerering av vev, er IL-22 i stand til å fremkalle produksjonen av både beskyttende 20, 21, 22 og proinflammatoriske mediatorer (for eksempel IL-8) 23, 24. To modeller av T-celle-drevet kolitt viste økning i IL-22 i tykktarmen, herunder TCR α - / - mus 25, 26 og CD45RB hi overføring modell 27. Sammenligning av inflammatorisk tarmsykdom modeller, IL-22-ekspresjon i tarmen var høyere i et Crohn sykdom modelthan i en modell av ulcerøs kolitt 21, 24 .Her, overfører vi CD4CD45RBhi T-celler fra rapportør mus inn i Rag1 - / - mottakere og etterligne den patogene prosessen med Crohns sykdom. Vi har funnet at av de foregående kolitt, ble IL-22 reportere anskueliggjort på tarmdrenerende lymfeknuter (MLN). Signalene deretter redusert i MLN og flyttet til tarmen, spesielt de distale tynntarm og kolon, med utvikling av kolitt. De fleste tdTomato journalister ble lokalisert inne i lamina propria slimhinnen i tarmen.
En annen type av reporter for IL-22 er tidligere beskrevet, i hvilke celler er permanent merket slik at de og deres døtre fortsetter å uttrykke reporter, hvorvidt eller ikke transkripsjonen av IL-22 har fortsatt 28. Som i vår studie, gut medfødte lymfocytter ble merket i henhold homeostatiske forhold, og i kolitt, than reporter ble lokalisert i T-celler fra mesenteric lymfeknuter til tarmvevet.
Fremgangsmåtene beskrevet i denne protokollen vil være anvendelig for etablering av andre transgene rapportør mus, slik som IL-17, IL-25, og så videre. Imidlertid er det viktig å velge egnede BAC-kloner som bærer distale regulatoriske elementer for å sikre nøyaktigheten av reportergenekspresjon, ettersom transgener er tilfeldig integrert i musegenomet. Reporteren mus gir mulighet for identifisering av celler som uttrykker in vivo, så vel som for rensingen og karakteriseringen av levende celler. Vi brukte tdTomato, en usedvanlig lys rød fluorescerende protein, som et fluorescerende reporter gen for å gjøre reporteren egnet for levende dyr imaging studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
References
- Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).
- Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo. PLoS One. 7, e39750 (2012).
- Kamanaka, M., et al. Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse. Immunity. 25, 941-952 (2006).
- Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22. Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).
- Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9. J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).
- Cella, M., et al. A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity. Nature. 457, 722-725 (2009).
- Sanos, S. L., et al. RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells. Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).
- Spits, H., et al. Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature. Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).
- Mazzucchelli, R. I., et al. Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice. PLoS One. 4, e7637 (2009).
- Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice. Front Immunol. 6, 662 (2015).
- Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication. Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).
- Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments. Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).
- Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of transgenic mice. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. Chapter 19, Unit 19 11 (2009).
- Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats. Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).
- Omata, Y., et al. Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation. Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).
- Kumar, N., Borth, N. Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories. Methods. 56, 366-374 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb.prot4991 (2008).
- Hilbe, W., et al. Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120. Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).
- Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry. Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).
- Wolk, K., et al. IL-22 increases the innate immunity of tissues. Immunity. 21, 241-254 (2004).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).
- Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, de, R, Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells. Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Andoh, A., et al. Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts. Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75, 274-282 (1993).
- Powrie, F. Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).
- Ahlfors, H., et al. IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection. J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).
