Abstract
topi reporter sono stati ampiamente utilizzati per osservare la localizzazione di espressione dei geni target. Questo protocollo si concentra su una strategia per stabilire un nuovo modello di topo transgenico giornalista. Abbiamo scelto di visualizzare interleuchina (IL) 22 genica perché questa citochina ha importanti attività nell'intestino, dove contribuisce a riparare tessuti danneggiati da infiammazione. Sistemi Reporter offrono notevoli vantaggi rispetto ad altri metodi di identificazione dei prodotti in vivo. Nel caso di IL-22, altri studi avevano prima isolato cellule dai tessuti e poi ri-stimolate le cellule in vitro. IL-22, che è normalmente secreta, è stato intrappolato all'interno delle cellule usando un farmaco e la colorazione intracellulare è stato usato per visualizzarla. Questo metodo identifica le cellule capaci di produrre IL-22, ma non ne determina che facevano così in vivo. Il design giornalista comprende l'inserimento di un gene per una proteina fluorescente (tdTomato) nel IL-22 gene in tale way che la proteina fluorescente non può essere secreto e quindi rimane intrappolata all'interno delle cellule che producono in vivo. Produttori fluorescenti possono quindi essere visualizzati in sezioni di tessuto o ex vivo analisi tramite citometria a flusso. Il processo di costruzione vera e propria per il giornalista incluso recombineering un cromosoma artificiale batterico che conteneva il gene IL-22. Questo cromosoma multistrato è stato poi introdotto nel genoma del mouse. Omeostatico IL-22 espressione reporter è stato osservato in diversi tessuti di topo, tra cui la milza, timo, linfonodi, le placche di Peyer, e intestino, mediante citometria a flusso di analisi. La colite è stata indotta da cellule T (CD4 + CD45RBhigh) di trasferimento, ed espressione reporter è stato visualizzato. Le cellule T positive erano prima presenti nei linfonodi mesenterici, e quindi hanno accumulato all'interno della lamina propria delle piccole tessuti dell'intestino e del colon distale. La strategia con BAC ha dato espressione giornalista buona fedeltà rispetto a IL-22 Expressione, ed è più semplice di procedure knock-in.
Introduction
Cellule specifiche del tipo di espressione di geni reporter è utile per identificare le cellule che esprimono attivamente il target in tessuti sotto stati omeostatiche e perturbate. Permette anche per la purificazione di queste cellule, che rimangono vitali, per studiare le altre proprietà. topi reporter sono stati utilizzati nel chiarire il meccanismo di azione di specifiche citochine, fattori di trascrizione, e elementi regolatori. Strategie Precedente 1, 2, 3 sono in gran parte affidamento sul battendo il giornalista nel locus bersaglio nel topo cromosoma, una procedura che richiede tempo e costosa. Così, un metodo semplice per la generazione di topi transgenici è desiderabile.
Le citochine sono una vasta classe di piccole proteine secrete / peptidi che regolano le risposte immunitarie attraverso la segnalazione intercellulare. L'interleuchina 22 (IL-22) è una citochina con molte riferito attività, tra cui barriera function, la riparazione dei tessuti e l'infiammazione 4. Sebbene IL-22 è stato inizialmente scoperto come prodotto delle cellule T 5, rapporti successivi hanno dimostrato la sua espressione nelle cellule natural killer (NK) negli esseri umani 6 e 7 topi e in altre classi di linfociti innate 8. Nonostante vasta osservazione di cellule-22 che producono IL, visualizzazione di IL-22 in precedenza necessaria la stimolazione ex vivo e permeabilizzazione alle macchie con anticorpi. Pertanto, il romanzo IL-22 topi reporter sarebbe uno strumento molto utile per studiare la funzione di IL-22 nei processi omeostatici e patogeni.
Qui, abbiamo sviluppato un modello semplificato transgenico giornalista mouse per osservare le cellule IL-22-producono in vivo e in vitro. Utilizzando un metodo BAC recombineering 9, abbiamo inserito la sequenza tdTomato cDNA con Poly A frammenti di segnale in IL-22 locnoi e sostituito esone 1. Le altre regioni, esoni, e gli elementi normativi non tradotte non sono stati perturbati, dal momento che vorremmo imitare la regolazione naturale della IL-22, per quanto possibile. Il sito di inserimento giornalista interrompe la sequenza di segnale, con conseguente accumulo del reporter all'interno delle cellule che producono, a differenza di IL-22 stessa, che sta rapidamente secreto. Questo nuovo metodo può essere applicato anche alla generazione di topi transgenici per altre proteine secrete.
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Protocol
Tutti gli animali hanno ricevuto cure adeguate secondo le procedure sperimentali descritte nella Guida 2011 per cura e l'uso di animali da laboratorio Comitato di Federico Laboratorio Nazionale per la Ricerca sul Cancro.
1. Generazione di IL-22-tdTomato topi reporter di BAC recombineering
NOTA: I topi dovrebbero essere inconscia e non si muovono in risposta a uno stimolo nocivo. Sterilizzare l'area chirurgica con il 70% di etanolo e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici utilizzando uno sterilizzatore perle di vetro.
- Purificare BAC DNA (RP23-401E11, lunghezza clone di 228391 bps) utilizzando un metodo di estrazione alcalina 10, 11. Caratterizzare il clone BAC da SpeI digestione di 5 mg di RP23-401E11 per confermare la dimensione corretta del gene bersaglio. NOTA: Il BAC DNA è stato digerito in 14 frammenti.
- Inserire il gene TdTomato giornalista nel sito Not I / Sal I del vettore shuttle PLD53SC-A-GFP-B11 e sostituire il gene GFP nello stesso sito. Quindi, utilizzando BAC RP23-401E11 come modello, amplificare le caselle di omologia (A e B) al primo esone tradotta di Il-22 (esone 1) mediante PCR (95 ° C 2 min; 30 cicli di 95 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec e 72 ° C per 30 secondi, e una estensione finale a 72 ° C per 10 min). In un sistema di reazione PCR 50 microlitri, aggiungere 50 ng (1 ml) di BAC DNA, 0,5 ml di primer (10 mM), 40 ml di PCR Supermix alta fedeltà, e 8 ml di H 2 O.
NOTA: I primer per le caselle A e B sono i seguenti: Una casella in avanti: 5'-T GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG e Reverse: 5'-CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC; Scatola B Forward: 5'-G TTAATTAA CTGCCCGTCAACA e Reverse: 5'-T GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10. I siti degli enzimi di restrizione (Asc I e Pac I) sono sottolineate. - Legare 500 ng di Asc I-digerito A e 500 ng di Fragm B Pac I-digeritoEnt in 50 ng di PLD53SC-ATB (tdTomato) vettore a 16 ° C per 1 ora.
- Transform purificato vettoriale PLD53SC-ATB in cellule BAC-competenti 11 e li cultura su Luria-Bertani (LB) piastre di agar con cloramfenicolo (20 mg / ml) e ampicillina (30 mcg / ml) a 37 ° C. Scegli due o tre colonie di co-integrazione dalle piastre maestro Ch / Amp.
- Inoculare ogni colonia in 1 ml di LB addizionato con 20 ug / ml di cloramfenicolo e incubare per 1 ora a 37 ° C e 225 rpm. Distribuire 100 ml di ciascuna miscela su una piastra di LB-agar (10 g di Peptone 140, 5 g di estratto di lievito, 12 g di agar e 1 L di acqua; pH 7.5) addizionato con cloramfenicolo e 4-4,5% di saccarosio. Incubare la cultura durante la notte a 37 ° C.
- Scegli entrambe colonie grandi e piccoli e li replate su due piatti LB-agar con cloramfenicolo. Poi, esporre le piastre con o senza luce UV per 30 sec e raccogliere le colonie sensibili agli UV per ulteriori analisi.
- Identificare il DNA BAC modificato mediante PCR utilizzando tdTomato / IL-22 Primer eterozigote (Forward: 5 'ACT TGT GCG ATC TCT GAT GGT; Reverse: 5' TGT AAT CGG ggA TGT CGG C). Le condizioni Thermocycler sono le seguenti: 95 ° C per 2 min; 30 cicli di 95 ° C per 30 sec, 56 ° C per 30 sec e 72 ° C per 30 sec; e una estensione finale a 72 ° C per 10 min.
- Conferma la sequenza dell'area modificata del BAC BAC sequenziamento diretto di grandi prep BAC DNA 12.
- Anestetizzare un mouse destinatario con una dose di 0,25% tribromoethanol nella cavità peritoneale, quando impiantare gli zigoti microiniettati in topi / 6c C57BL pseudo-gravidanza.
- Linearizzare l'IL-22-tdTomato BAC costrutto (10 mg) mediante digestione con 5 ml di restrizione endonucleasePi-SCEI in 100 ml di sistema di reazione e microinject il DNA linearizzato BAC in uova fecondate di C57BL / 6 femmine in fase di pronuclei 13. Screit il topi transgenici con l'analisi Southern blot di DNA isolati da biopsie di coda utilizzando le procedure standard.
Preparazione 2. Single-cell da milza, timo, linfonodi, e le placche di Peyer
NOTA: topi reporter IL-22-tdTomato sono stati mantenuti al National Cancer Institute (NCI, Frederick, MD). Il metodo di eutanasia è conforme alle più recenti linee guida AVMA sull'eutanasia. Tutti i topi sono stati sacrificati con CO 2 inalazione 14.
- Euthanize un IL-22-tdTomato del mouse in una camera di CO 2 e metterlo su un tampone pulito. Sterilizzare la pelle dell'addome spruzzando il 70% di alcol e tagliarlo aperto. Rimuovere la milza nel fianco sinistro e il timo dietro lo sterno.
- Per raccogliere i nodi mesentericlymph (situato nel tessuto mesenterico) e placche di Peyer (piccoli lymphoidnodules in tutta la regione ileo dell'intestino tenue), prendere la mesenterica bianco perlato i nodi vicino alla tegli parete dell'intestino tenue con sezionare pinze con punte a punta fine seghettati e poi rimuovere l'intero intestino tenue e colon fuori dal corpo. Trova le patch ovali estesi (placche del Peyer) lungo l'intestino e tagliarli con le forbici. Macinare questi tessuti linfoidi (linfonodi e placche di Peyer) individualmente tra due vetrini smerigliati in una cella singola sospensione in PBS / 1% di siero fetale bovino (FBS) tampone sul ghiaccio.
- Tritare la milza o tessuti timo utilizzando lo stesso metodo come al punto 2.2. Centrifugare la sospensione della milza per 8 minuti a 500 xg e 4 ° C. Aggiungere 1 ml di tampone di lisi ACK per milza per i pellet cellulari.
- Mescolare bene e lasciare riposare per 1 min. Aggiungere 9 ml di tampone sterile tampone fosfato salino (PBS) per ogni campione. Centrifugare per centrifugazione per 8 minuti a 500 xg e 4 ° C per rimuovere i globuli rossi.
NOTA: Non aggiungere ACK buffer di lisi delle cellule del timo. - Risospendere le leucociti risultanti in 5 ml di PBS e pass le cellule attraverso un colino cella di 100 micron. Raccogliere il pellet di cellule per centrifugazione a 500 g per 8 minuti.
- Risospendere le cellule in 5 ml di media RPMI o tampone FACS e contare le cellule vitali utilizzando 0,4% trypan colorante blu soluzione / PBS.
3. Isolamento di intraepiteliale linfociti e lamina propria cellule dall'intestino
- Aprire la pelle addominale come al punto 2.1, tagliare l'intestino tenue, dal duodeno (accanto allo stomaco) per ileo (vicino alla appendice), e l'intero colon, proprio sopra l'ano. Rimuovere il adiposo in più e pinze dei tessuti utilizzando mesenterici. Mettere subito l'intestino in PBS ghiacciato.
- Se vuoi placche di Peyer (piccole, noduli grezzi) lungo la regione distale del piccolo intestino. Rimuovere le masse con pinza Andopen dell'intestino lunghezza con le forbici. Lavare accuratamente l'intestino con 10 ml di PBS ghiacciato.
- Incubare i tessuti in 20 ml di tampone di pre-digestione (5 mM EDTAe 1 mM ditiotreitolo in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)) per 30 minuti a 37 ° C con rotazione lenta (50 rpm) in un agitatore. Dopo ciascuna delle 2 incubazione, rimuovere lo strato di cellule epiteliali, che contiene i linfociti intraepiteliali (IELS), da un'intensa vortex (30 sec a 12.000 giri al minuto) e passare tutti i tessuti attraverso un colino cella di 100 micron.
- Aggiungere 20 ml di soluzione EDTA al tessuto per la seconda incubazione per 30 min a 37 ° C. Passare le frazioni IEL attraverso un colino cella di 100 micron e piscina con le frazioni precedenti. Mantenere i frammenti rimanenti intestino sul ghiaccio da trattare nella fase 3.9.
- Centrifugare le frazioni IEL in pool a 800 xg per 5 minuti a 4 ° C. Lavare le frazioni IEL in pool con 10 ml di HBSS / 5% FBS e spin giù per 5 min a 800 xg e 4 ° C.
- Risospendere le cellule in 8 ml di terreno 44% di silice colloidale e 15 rivestirle medio silice colloidale 5 ml di 67%. Centrifugare il 44% / 67.5% Di pendenza miscela di cellule per 20 minuti a temperatura ambiente e 1.500 x g.
- Raccogliere le cellule IEL della band a livello di interfaccia. Innanzitutto, rimuovere lo strato superiore del surnatante (circa 5 ml) con 1 ml pipetta. Poi, IELS raccolta all'interfase della colloidale medio di silice gradiente.
- Lavare le IELS con l'aggiunta di 10 ml di terreno RPMI. Spin le cellule verso il basso per 5 minuti a 800 xg e 4 ° C. Risospendere le IELS in 5 ml di RPMI per passo 3.15.
- Per l'isolamento dei linfociti della lamina propria (LPLS), sminuzzare i frammenti di tessuto dell'intestino dal punto 3.4 in piccoli pezzi con le forbici (1 mm) e digerire i pezzi con 10 ml di tampone di digestione (0,05 g di collagenasi, 0,05 g di DNasiI, e 0,3 g di dispasi II in RPMI / 5% FBS) per 15-20 minuti a 37 ° C.
- Filtrare la miscela attraverso un colino cella di 70 micron. Il supernatante flow-through contiene LPL rilasciato.
- Completamente digerire i frammenti intestino ripetendo i passaggi 3,9-3,10 (di solito, devono essereripetuto 3 volte). Ogni volta, piscina il surnatante contenente il LPLS.
- Raccogliere le cellule per centrifugazione per 5 min a 1500 xg e temperatura ambiente e risospendere il pellet in RPMI / 5% FBS. farli passare attraverso un colino cella di 40 micron.
- Risospendere le pellet cellulari in 10 ml della frazione 40% di 40:80 silice colloidale dislivello medio li sovrapporre 5 ml della frazione 80% in una provetta da 15 ml.
- Eseguire la separazione gradiente di densità per centrifugazione per 20 min a 1500 xg e temperatura ambiente 15.
- Raccogliere il LPLS, come descritto al punto 3.7. li Risciacquare una volta con 10 ml di PBS e risospendere il pellet in 1 ml di / 1% FBS tampone PBS o mezzo RPMI.
- Contare le cellule vitali (sia IELS e LPLS) con lo 0,4% trypan colorante blu soluzione / PBS.
4. L'espressione di IL-22-tdTomato in Colite
- Preparare sospensioni cellulari milza singoli da topi IL-22-TdTomato ad una concentrazione di 1 x 10 <sup> 7 cellule / ml in PBS sterile, come descritto ai punti 2.1-2.4.
- Purificare le cellule T CD4 + con il mouse CD4 cellulare Metodo di isolamento Negativo 10. Etichettarli con l'anti-CD4-APC (clone RM4-5, 0,5 ml / 1 x 10 6 cellule in PBS / 1% tampone FBS) e anti-CD45RB FITC-(clone 16A, 0,5 ml / 1 x 10 6 cellule in PBS / 1% tampone FBS) mediante incubazione a 4 ° C per 30 min.
- Spin le cellule verso il basso per 5 minuti a 500 xg e 4 ° C. Lavare le cellule con 2 ml di PBS / 1% tampone FBS e risospendere in 1 ml di / 1% FBS tampone PBS colorazione.
- Eseguire le cellule T etichettati su una macchina di citometria a flusso 16. Porta le cellule su una popolazione di cellule T e di ordinamento CD4 + CD45RB alte cellule doppio positive (la lunghezza d'onda rilevata a 488 nm e 633 nm) laser.
- Raccogliere le cellule ordinati per centrifugazione per 5 min a 500 xg e 4 ° C. Risospendere il pellet di cellule in tampone PBS sterile a 1 x 10 6 6) nel peritoneo ofeach Rag1 - Mouse destinatario - /.
- Sacrificare i topi riceventi sotto di CO 2 in vari momenti. Raccogliere i linfonodi mesenterici e intestino tenue e crasso, come descritto ai punti 2.1 e 2.2. Mettere ogni linfonodo mesenterico e cut-aperto intestino (carta / intestino / carta del panino) nel 4% paraformaldeide (PFA, gestire sotto una cappa) durante la notte per riparare i tessuti. Sostituire il PFA con il 18% di saccarosio per 16-24 ore e poi congelare i tessuti per il sezionamento.
- Utilizzare la macchina criostato per tagliare il tessuto 17, 18, 19. Riscaldare le sezioni di tessuto a temperatura ambiente per circa 60 minuti e metterli in acetone per 10 min a temperatura ambiente. li asciugare a temperatura ambiente per circa 5 minuti.
- Aggiungere FBS in eccesso, rimuoverlo dalla pipetta e aggiungere anti-RFP ad un 1: BSA 200 diluizione nel 0,1% / 1x PBS. Incubare l'anticorpo a 37 ° C per 60 min.
- Risciacquare le sezioni in 1x PBS per 10 min e applicare l'anticorpo secondario corrispondente (goat anti-rabbit 568) al tessuto, diluito 1: 300 in 1% BSA / PBS 1x, per 30 min a temperatura ambiente.
- Sciacquare i vetrini in PBS 1x per 10 min, pulire asciugare e aggiungere lamelle.
- Visualizza tutti i campioni con un microscopio a fluorescenza in presenza di luce coerente (RFP: filtro di eccitazione 540-580 nm) con l'obiettivo 40X.
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Representative Results
Un murino IL-22 giornalista transgene è stata creata usando recombineering per modificare un cromosoma artificiale batterico portando la IL-22 locus. La figura 1 mostra uno schema di pBACe3.6 vettore contenente il gene sacBII, un indicatore positivo-selezione, e cloramfenicolo antibiotico gene di resistenza 11. Dopo aver introdotto tdTomato in esone 1, la sequenza di peptide segnale è stato interrotto, come mostrato nella Figura 2. Così, il giornalista tdTomato è stato intrappolato all'interno delle cellule IL-22 che esprimono, consentendo loro individuazione e l'isolamento mediante citometria a flusso. I topi omozigoti sono stati allevati da linee fondatori e screening mediante PCR, e non richiedevano reincrocio per conseguire prole con un'identità genetica, come richiesto nel solito strategia knock-in. Per testare la fedeltà dei IL-22 giornalisti, in vitro splenociti generate da sono state coltivate in Th22 o condizioni neutre.
Figura 1: Mappa del sito del vettore pBACe3.6. pBACe3.6 è caratterizzata dal fatto di contenere cloramfenicolo resistenza agli antibiotici e un gene sacBII come marcatore positivo selezione. Durante la ricombinazione, i cloni desiderati sono saccarosio-resistenti attraverso la loro esprime il gene sacBII e sono autorizzati a crescere su supporti saccarosio-contenente, mentre le colonie negativi BAC sono saccarosio-sensibili.
Figura 2: Rappresentazione schematica del modificato clone RP23-401E11 BAC. Un gene reporter tdTomato stato introdotto nel Il-22 locus, che comprende IL-22 e regolamentari elementi in un murine bacterial artificial chromosome (RP23-401E11 BAC), utilizzando la tecnologia recombineering. Con la ricombinazione omologa, la sequenza del peptide segnale di IL-22 nella BAC è stato interrotto e esone 1 di Il-22 è stato sostituito dal gene reporter tdTomato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Identificazione di IL-22 reporter in splenociti coltivate in vitro. cellule T CD4 sono stati purificati da milza e poi stimolate con anti-CD28; anti-CD3 (condizione neutra); o anti-CD3, anti-CD28, anti-IFNƳ, anti-IL4, IL-6, TGF-β, e 6-Formylindolo (3,2-b) carbazolo (FICZ) per 5 giorni. IL-22-tdTomato è stata analizzata mediante citometria di flusso (in alto due) e la microscopia a fluorescenza (due inferiori, barra della scala: 100 micron). I numeri nei quadranti indicano la percentuale di cellule CD45 +.target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Visualizzazione di IL-22-cellule che producono in diversi tessuti di topo. cella singola sospensioni sono stati preparati dalla milza, timo, linfonodi, intestino (IEL e LP), e le placche di Peyer. Sono stati poi superficie colorati con FITC anti-CD3 ed esaminate per l'espressione tdTomato. MLN: mesenterica linfonodi, ALN: linfonodi ascellari, PP: le placche di Peyer, IEL: cellule intraepiteliali isolate dal piccolo intestino, LP: le cellule lamina propria purificato dal piccolo intestino. I numeri nei quadranti indicano la percentuale di cellule CD45 +. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: localizzazione di IL-22 giornalisti durante lo sviluppo di trasferimento T-cell colite. cellule T CD4CD45RBHigh da IL-22 topi reporter sono stati trasferiti in Rag1 - / - topi, ei segnali tdTomato sono stati valutati mediante immunoistochimica nei diversi tessuti in diversi momenti durante lo sviluppo di colite. Le frecce indicano i segnali di IL-22-tdTomato. Barre di scala = 25 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
IL-22 svolge un ruolo essenziale nella innata difesa ospite e nel rimodellamento tissutale. Cellule-22 producono IL sono stati identificati ex vivo mediante colorazione intracellulare. Tuttavia, rimane ancora difficile da monitorare l'espressione di IL-22 in situ, sia allo stato normale o in condizioni infiammatorie. Questo protocollo descrive un nuovo metodo per sviluppare un modello di topo IL-22 giornalista, che ci permette di localizzare le cellule giornalista esprimono in vivo. La codifica TdTomato gene reporter è stato inserito nel locus IL-22 in un sito che interrompe la sequenza segnale. Questo risultato strategia in reporter essendo intrappolati nella cellula producente, a differenza di IL-22 che è rapidamente secreta, permettendo la visualizzazione della cellula producente. L'IL-22-giornalista ingegnerizzato era contenuto all'interno di un grande BAC, con lo scopo di preservare gli elementi regolatori, così conferendo fedeltà di espressione del reporter corrispondente a quella di IL-22. I tessuti intestinali di m transgenicoice visualizzata espressione giornalista omeostatico nelle cellule CD4 T e linfociti innate nella lamina propria dell'intestino tenue. In colite indotta, cellule T CD4 espresso il giornalista nel colon.
Il ruolo di IL-22 nella malattia infiammatoria intestinale è stato poco chiaro. Partecipando nella rigenerazione della mucosa difesa e tessuto intestinale, IL-22 è in grado di suscitare la produzione sia di protezione 20, 21, 22 e mediatori proinfiammatori (ad esempio, IL-8) 23, 24. Due modelli di T colite cella-driven hanno mostrato un aumento di IL-22 nel colon, tra cui TCR α - / - mice 25, 26 e il trasferimento del modello CD45RB hi 27. Confrontando i modelli malattia infiammatoria intestinale, l'espressione di IL-22 nell'intestino era più alto in un Crmodelthan malattia di ohn in un modello di colite ulcerosa 21, 24 .Qui, abbiamo trasferire le cellule T CD4CD45RBhi dai topi reporter in Rag1 - / - destinatari e imitare il processo patogeno della malattia di Crohn. Abbiamo scoperto che, precedendo la colite, IL-22 giornalisti sono stati visualizzati nei linfonodi drenanti intestinali (MLN). I segnali poi diminuita nel MLN e spostati l'intestino, in particolare l'intestino tenue e colon distale, con lo sviluppo di colite. La maggior parte dei giornalisti tdTomato sono stati localizzati all'interno della mucosa lamina propria dell'intestino.
Un diverso tipo di reporter per IL-22 è stata precedentemente descritta, in cui le cellule sono assegnati in modo permanente tale che essi e le loro figlie continuano ad esprimere il reporter, se trascrizione di IL-22 o meno ha continuato 28. Come nel nostro studio, intestino linfociti innate sono stati segnati in condizioni omeostatiche, e nella colite, tsi reporter è stato localizzato nelle cellule T dai linfonodi mesenterici al tessuto intestinale.
Le procedure descritte in questo protocollo sarebbero applicabili per la creazione di altri topi transgene giornalista, come IL-17, IL-25, e così via. Tuttavia, è fondamentale scegliere adatti cloni BAC trasportano elementi regolatori distali per assicurare la fedeltà di espressione del gene reporter, dato che i transgeni sono integrati in modo casuale nel genoma del mouse. Il mouse giornalista consente l'identificazione di cellule che esprimono in vivo, così come per la purificazione e caratterizzazione di cellule vive. Abbiamo usato tdTomato, una proteina fluorescente rossa eccezionalmente brillante, come un gene reporter fluorescente a fare il giornalista adatto per gli studi di imaging di animali vivi.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
References
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