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Immunology and Infection

आईएल -22 व्यक्त लिम्फोसाइटों रिपोर्टर चूहों का उपयोग कर के दृश्य

Published: January 25, 2017 doi: 10.3791/54710
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular Immunoregulation, Cancer and Inflammation Program, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Abstract

संवाददाता चूहों व्यापक रूप से लक्षित जीनों की अभिव्यक्ति के स्थानीयकरण निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस प्रोटोकॉल एक रणनीति के एक नए ट्रांसजेनिक संवाददाता माउस मॉडल स्थापित करने पर केंद्रित है। हम क्योंकि इस साइटोकाइन आंत, जहां यह सूजन से क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरम्मत के लिए योगदान करने में महत्वपूर्ण activities नहीं है इंटरल्यूकिन (IL) में 22 जीन अभिव्यक्ति कल्पना करने के लिए चुना है। रिपोर्टर सिस्टम विवो में उत्पादों की पहचान के अन्य तरीकों पर काफी लाभ प्रदान करते हैं। आईएल 22 के मामले में, अन्य अध्ययनों से पहले ऊतकों से कोशिकाओं को अलग किया था और उसके बाद इन विट्रो में कोशिकाओं को फिर से प्रेरित है। आईएल -22, जो सामान्य रूप से स्रावित होता है, कोशिकाओं के अंदर फंस गया था एक दवा का उपयोग, और intracellular धुंधला यह कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस विधि आईएल -22 के उत्पादन में सक्षम कोशिकाओं को दिखाता है, लेकिन यह तय नहीं है कि वे इन विवो में ऐसा कर रहे थे। संवाददाता डिजाइन इस तरह के एक वा में आईएल -22 जीन में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (tdTomato) के लिए एक जीन डालने शामिलY कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन और स्रावित नहीं किया जा सकता इसलिए विवो में उत्पादक कोशिकाओं के अंदर फंस रहता है। फ्लोरोसेंट उत्पादकों तो ऊतक वर्गों में या प्रवाह cytometry के माध्यम से पूर्व vivo विश्लेषण द्वारा देखे जा सकते हैं। पत्रकार के लिए वास्तविक निर्माण प्रक्रिया एक जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र कि आईएल -22 जीन निहित recombineering शामिल थे। इस इंजीनियर गुणसूत्र तो माउस के जीनोम में पेश किया गया था। होमियोस्टैटिक आईएल -22 संवाददाता अभिव्यक्ति तिल्ली, थाइमस, लिम्फ नोड्स, Peyer पैच, और आंत, विश्लेषण प्रवाह cytometry द्वारा सहित विभिन्न माउस ऊतकों में मनाया गया। कोलाइटिस टी-सेल (CD4 + CD45RBhigh) हस्तांतरण द्वारा प्रेरित किया गया था, और संवाददाता अभिव्यक्ति कल्पना की गई थी। सकारात्मक टी कोशिकाओं mesenteric लिम्फ नोड्स में पहली उपस्थित थे, और फिर वे बाहर का छोटी आंत और पेट के ऊतकों के पटल Propria अंदर जमा हुए। बेक्स का उपयोग कर रणनीति आईएल 22 अभिव्यक्ति की तुलना में दे दी अच्छा निष्ठा संवाददाता अभिव्यक्तिसायन, और यह दस्तक में प्रक्रियाओं की तुलना में आसान है।

Introduction

रिपोर्टर जीन की सेल प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति सक्रिय रूप से होमियोस्टैटिक और परेशान राज्यों तहत ऊतकों में लक्ष्य व्यक्त कोशिकाओं की पहचान के लिए उपयोगी है। यह भी इन कोशिकाओं है, जो व्यवहार्य बने हुए हैं, उनके अन्य गुणों का अध्ययन करने की शुद्धि के लिए अनुमति देता है। संवाददाता चूहों विशिष्ट साइटोकिन्स, प्रतिलेखन कारक है, और नियामक तत्वों के लिए कार्रवाई के तंत्र का वर्णन में उपयोग किया गया है। पिछला रणनीतियों 1, 2, 3 बड़े पैमाने पर माउस गुणसूत्र, एक समय लेने वाली और महंगी प्रक्रिया में लक्ष्य लोकस में रिपोर्टर दस्तक पर भरोसा किया है। इस प्रकार, संवाददाता चूहों की पीढ़ी के लिए एक सरल विधि वांछनीय है।

साइटोकिन्स छोटे, स्रावित प्रोटीन / पेप्टाइड्स कि कहनेवाला संकेत के माध्यम से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित के एक व्यापक वर्ग के हैं। इंटरल्यूकिन 22 (आईएल 22) कई के साथ एक साइटोकाइन गतिविधियों की सूचना दी, बाधा फू सहितnction, ऊतकों की मरम्मत, और सूजन 4। आईएल -22 शुरू में एक टी सेल उत्पाद के रूप में 5 की खोज की थी हालांकि, बाद में रिपोर्टों इंसानों और चूहों 6 7 में और जन्मजात लिम्फोसाइट 8 के अन्य वर्गों में प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं (एन.के.) में अपनी अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया। एंटीबॉडी के साथ दाग को आईएल -22 उत्पादक कोशिकाओं के व्यापक अवलोकन, आईएल -22 पहले से अपेक्षित पूर्व vivo उत्तेजना और permeabilization के दृश्य के बावजूद। इसलिए, उपन्यास आईएल -22 संवाददाता चूहों होमियोस्टैटिक और रोगजनक प्रक्रियाओं में आईएल 22 के समारोह में जांच करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण होगा।

यहाँ, हम vivo में इन विट्रो में आईएल -22 उत्पादक कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए एक सरल ट्रांसजेनिक संवाददाता माउस मॉडल विकसित किया है। एक बीएसी recombineering विधि 9 का उपयोग कर, हम tdTomato सीडीएनए अनुक्रम पाली के साथ एक संकेत टुकड़े आईएल -22 नियंत्रण रेखा में डालाअमेरिका और एक्सॉन 1. की जगह अन्य ग़ैर-अनुवादित क्षेत्रों, एक्सॉनों, और विनियामक तत्वों, परेशान नहीं कर रहे थे जब से हम जितना संभव हो आईएल 22 के प्राकृतिक विनियमन की नकल करना चाहते हैं। संवाददाता प्रविष्टि की साइट के संकेत अनुक्रम बाधित, उत्पादक कोशिकाओं के अंदर रिपोर्टर के संचय में जिसके परिणामस्वरूप, आईएल 22 ही है, जो तेजी से स्रावित होता है के विपरीत है। इस नई विधि को भी अन्य स्रावित प्रोटीन के लिए संवाददाता चूहों की पीढ़ी के लिए लागू किया जा सकता है।

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Protocol

सभी जानवरों की देखभाल और कैंसर अनुसंधान के लिए फ्रेडरिक राष्ट्रीय प्रयोगशाला प्रयोगशाला पशु समिति के उपयोग के लिए 2011 गाइड में उल्लिखित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के अनुसार उचित देखभाल प्राप्त किया।

1. बीएसी Recombineering द्वारा आईएल 22-tdTomato संवाददाता चूहों की पीढ़ी

नोट: चूहों बेहोश होना चाहिए और एक हानिकारक उत्तेजना के जवाब में कदम नहीं है। 70% इथेनॉल के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र जीवाणुरहित और एक गिलास मनका अजीवाणु का उपयोग कर सभी सर्जिकल उपकरणों बाँझ।

  1. बीएसी डीएनए (RP23-401E11, क्लोन लंबाई 228,391 बीपीएस) शुद्ध एक क्षारीय निष्कर्षण विधि 10, 11 का उपयोग कर। लक्ष्य जीन का सही आकार पुष्टि करने के लिए RP23-401E11 के 5 माइक्रोग्राम की SpeI पाचन द्वारा बीएसी क्लोन विशेषताएँ। नोट: बीएसी डीएनए 14 टुकड़ों में पचा गया था।
  2. PLD53SC-ए-GFP-बी शटल वेक्टर की नहीं मैं / साल मैं इस साइट में tdTomato पत्रकार जीन डालें11 और एक ही साइट में GFP जीन की जगह। फिर, एक टेम्पलेट के रूप में बीएसी RP23-401E11 का उपयोग कर, की पहली अनुवाद एक्सॉन के लिए अनुरूपता बक्से (ए और बी) बढ़ाना इल 22 (एक्सॉन 1) पीसीआर (95 डिग्री सेल्सियस से 2 मिनट, 30 के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्रों सेकंड, 30 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, और 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, और 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार)। एक 50 μl पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली में, जोड़ने के 50 एनजी (1 μl) बीएसी डीएनए, प्राइमरों के 0.5 μl (10 माइक्रोन) के, पीसीआर Supermix उच्च निष्ठा के 40 μl, और एच 2 ओ के 8 μl की
    नोट: एक बॉक्स फॉरवर्ड: 5'- टी GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG और रिवर्स: ए और बी बक्से के लिए प्राइमरों इस प्रकार हैं 5'- CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC; फॉरवर्ड बी बॉक्स: 5'- जी TTAATTAA CTGCCCGTCAACA और रिवर्स: 5'- टी GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10। प्रतिबंध एंजाइमों (एएससी मैं और पीएसी मैं) की साइटों रेखांकित कर रहे हैं।
  3. ए एस सी मैं पचा ए के 500 एनजी और पीएसी मैं पचा बी fragm के 500 एनजी ligateदस्तावेजों 1 घंटे के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर PLD53SC-ATB (tdTomato) वेक्टर के 50 एनजी में।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर बीएसी सक्षम कोशिकाओं 11 और उन्हें संस्कृति Luria-Bertani (पौंड) chloramphenicol (20 माइक्रोग्राम / एमएल) और एम्पीसिलीन (30 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ प्लेटों अगर पर में शुद्ध PLD53SC-ATB वेक्टर रूपांतरण। के दो से तीन कालोनियों उठाओ सीएच / एम्प मास्टर प्लेटों से सह एकीकृत।
  5. पौंड के 1 मिलीलीटर 20 माइक्रोग्राम / एमएल chloramphenicol के साथ पूरक में प्रत्येक कॉलोनी टीका लगाना और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे और 225 आरपीएम के लिए उन्हें सेते हैं। एक लेग अगर प्लेट पर प्रत्येक मिश्रण के 100 μl बिखरा हुआ है (Peptone 140 के 10 ग्राम, खमीर निकालने, अगर की 12 ग्राम, और पानी का 1 एल के 5 ग्राम, 7.5 पीएच) chloramphenicol और सुक्रोज की 4-4.5% के साथ पूरक। 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात संस्कृति सेते हैं।
  6. दोनों बड़े और छोटे कालोनियों उठाओ और chloramphenicol के साथ दो लेग अगर प्लेटों पर उन्हें replate। फिर, के साथ या 30 सेकंड के लिए यूवी प्रकाश के बिना प्लेटों को बेनकाब और आगे के विश्लेषण के लिए यूवी संवेदनशील कालोनियों लेने।
  7. पीसीआर द्वारा संशोधित बीएसी डीएनए tdTomato / आईएल 22 विषमयुग्मजी प्राइमर का उपयोग पहचानें (:;: टीजीटी AAT CGG GGA टीजीटी CGG सी आगे 5 '5 रिवर्स अधिनियम टीजीटी GCG एटीसी TCT Gat GGT')। thermocycler की स्थिति इस प्रकार हैं: 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 30 सेकंड, 30 सेकंड के लिए 56 डिग्री सेल्सियस, और 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्र; और 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार।
  8. बड़े प्रस्तुत करने का बीएसी डीएनए 12 के प्रत्यक्ष बीएसी अनुक्रमण द्वारा बीएसी की संशोधित क्षेत्र के अनुक्रम की पुष्टि करें।
  9. पेरिटोनियल गुहा में 0.25% tribromoethanol की एक खुराक के साथ एक प्राप्तकर्ता माउस anesthetize जब छद्म गर्भवती C57BL / 6C चूहों में microinjected युग्मनजों दाखिल।
  10. Linearize आईएल 22-tdTomato बीएसी प्रतिक्रिया प्रणाली के 100 μl में प्रतिबंध endonucleasePi-SCEI के 5 μl के साथ निर्माण (10 माइक्रोग्राम) पाचन द्वारा और pronuclear चरण 13 पर C57BL / 6 महिलाओं की निषेचित अंडे में linearized बीएसी डीएनए microinject। screमानक प्रक्रियाओं का उपयोग पूंछ बायोप्सी से अलग डीएनए के दक्षिणी धब्बा विश्लेषण द्वारा ट्रांसजेनिक चूहों एन।

Spleens, थाइमस, लिम्फ नोड्स, और Peyer के पैच से 2. एकल सेल तैयार

नोट: आईएल 22-tdTomato संवाददाता चूहों राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (NCI, फ्रेडरिक, एमडी) पर बनाए रखा गया। इच्छामृत्यु विधि इच्छामृत्यु पर सबसे हाल ही AVMA दिशा निर्देशों के अनुरूप। सभी चूहों का उपयोग सीओ 2 साँस लेना 14 euthanized थे।

  1. सीओ 2 कक्ष में एक आईएल 22-tdTomato माउस euthanize और एक साफ पैड पर डाल दिया। 70% शराब के छिड़काव से पेट त्वचा जीवाणुरहित और यह कटौती खुला। बायीं ओर में तिल्ली और उरोस्थि के पीछे थाइमस निकालें।
  2. mesentericlymph नोड्स (mesenteric ऊतकों में स्थित) और Peyer पैच (छोटी आंत का लघ्वान्त्र क्षेत्र भर में छोटे lymphoidnodules) फसल, मोती सफेद mesenteric टी नोड्स लेने के लिए बंदवह पहली बार ठीक बिंदु दाँतेदार सुझावों के साथ संदंश काटना और फिर शरीर से बाहर पूरे छोटी आंत और पेट को हटाने का उपयोग कर छोटी आंत की दीवार। बढ़ाया अंडाकार पैच (Peyer पैच) पेट के साथ पता लगाएं और उन्हें कैंची से काट। पीबीएस / 1% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) बर्फ पर बफर में एक एकल कक्ष निलंबन में इन लसीकावत् ऊतकों (लिम्फ नोड्स और Peyer पैच) को व्यक्तिगत रूप से दो पाले स्लाइड्स के बीच पीस।
  3. 2.2 कदम के रूप में तिल्ली या थाइमस ऊतकों ही विधि का उपयोग कीमा। 500 XG पर 8 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए प्लीहा निलंबन अपकेंद्रित्र। सेल छर्रों के लिए तिल्ली प्रति एसीके lysing बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  4. अच्छी तरह मिक्स और उन्हें 1 मिनट के लिए खड़े हो जाओ। प्रत्येक नमूने के लिए बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) बफर के 9 मिलीलीटर जोड़ें। 500 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए centrifugation द्वारा स्पिन लाल रक्त कोशिकाओं को हटा दें।
    नोट: थाइमस कोशिकाओं को एसीके lysing बफर न जोड़ें।
  5. पीबीएस और पी के 5 मिलीलीटर में जिसके परिणामस्वरूप ल्यूकोसाइट्स Resuspendएक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से कोशिकाओं गधा। 8 मिनट के लिए 500 XG पर centrifugation द्वारा सेल छर्रों लीजिए।
  6. RPMI मीडिया या FACS बफर के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend और 0.4% trypan नीले रंग की डाई / पीबीएस समाधान का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं की गिनती।

3. आंतों से अंतःउपकला लिम्फोसाइटों और लामिना propria कोशिकाओं के अलगाव

  1. पेट की त्वचा 2.1 कदम के रूप में, ग्रहणी से (पेट के बगल में) लघ्वान्त्र (परिशिष्ट के पास), और पूरे पेट के लिए, सही गुदा के ऊपर खुले, छोटी आंत काट दिया। अतिरिक्त वसा और mesenteric ऊतक का उपयोग संदंश निकालें। आंतों ठंडा पीबीएस में तुरंत डाल दिया।
  2. Peyer पैच (छोटे, किसी न किसी पिंड) छोटी आंत के बाहर का क्षेत्र के साथ के लिए देखो। संदंश andopen कैंची का उपयोग लंबाई आंत का उपयोग कर जनता निकालें। अच्छी तरह ठंडा पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ आंत फ्लश।
  3. पूर्व पाचन बफर (5 मिमी EDTA के 20 मिलीलीटर में ऊतकों को सेतेऔर एक प्रकार के बरतन में धीमी गति रोटेशन (50 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HbSS)) में 1 मिमी dithiothreitol। 2 incubations से प्रत्येक के बाद, उपकला सेल परत को हटाने, अंतःउपकला लिम्फोसाइटों (IELs) युक्त, तीव्र vortexing (12,000 rpm पर 30 सेकंड) से और एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से सभी ऊतकों से गुजरती हैं।
  4. नई EDTA समाधान के 20 मिलीलीटर 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए दूसरा ऊष्मायन के लिए ऊतक में जोड़े। एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम IEL अंशों पास और पिछले भागों के साथ उन्हें पूल। बर्फ पर शेष आंत टुकड़े रखने के कदम 3.9 में इलाज किया जाएगा।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 800 XG पर जमा IEL अंशों अपकेंद्रित्र। HBSS / 5% FBS की 10 मिलीलीटर के साथ जमा IEL अंशों को धो लें और उन्हें 800 XG पर 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए नीचे स्पिन।
  6. 44% कोलाइडयन सिलिका मध्यम 15 के 8 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend और उन्हें 5 से 67 मिलीलीटर% कोलाइडयन सिलिका मध्यम से मढ़ना। अपकेंद्रित्र 44% / 67.5% कमरे के तापमान पर 20 मिनट और 1500 x जी के लिए सेल मिश्रण ढाल।
  7. इंटरफेस में बैंड से IEL कोशिकाओं को ले लीजिए। सबसे पहले, सतह पर तैरनेवाला (लगभग 5 एमएल) 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर के ऊपर परत को हटा दें। फिर, कोलाइडयन सिलिका मध्यम ढाल के interphase पर फसल IELs।
  8. RPMI माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़कर IELs धो लें। 800 XG पर 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए कोशिकाओं स्पिन। कदम 3.15 के लिए RPMI के 5 मिलीलीटर में IELs Resuspend।
  9. लामिना propria लिम्फोसाइटों के अलगाव (LPLs) के लिए, कैंची का उपयोग (1 मिमी) छोटे टुकड़ों में 3.4 कदम से आंत ऊतक टुकड़े कीमा और (पाचन बफर के 10 मिलीलीटर के साथ टुकड़े को पचाने collagenase के 0.05 जी, DNaseI के 0.05 जी, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15-20 मिनट के लिए RPMI / 5% FBS में Dispase द्वितीय) का 0.3 जी।
  10. एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से मिश्रण फ़िल्टर। प्रवाह के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला जारी किया LPL शामिल हैं।
  11. पूरी तरह से कदम 3.9-3.10 दोहरा (सामान्य रूप से आंत के टुकड़े को पचाने, वे किया जाना चाहिएबार-बार 3 बार)। हर बार, LPLs युक्त supernatants पूल।
  12. 1,500 XG और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए centrifugation द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा और RPMI / 5% FBS में छर्रों resuspend। एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से उनके पास।
  13. एक 40:80 कोलाइडयन सिलिका मध्यम ढाल का 40% अंश के 10 मिलीलीटर में सेल छर्रों Resuspend और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 80% अंश के 5 मिलीलीटर पर उन्हें उपरिशायी।
  14. 1,500 XG और कमरे के तापमान 15 पर 20 मिनट के लिए centrifugation द्वारा घनत्व ढाल जुदाई प्रदर्शन करना।
  15. LPLs, 3.7 चरण में वर्णित के रूप में ले लीजिए। उन्हें पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ एक बार धोएं और पीबीएस / 1% FBS के बफर या RPMI माध्यम से 1 मिलीलीटर में छर्रों resuspend।
  16. व्यवहार्य कोशिकाओं (दोनों IELs और LPLs) 0.4% trypan नीले डाई / पीबीएस समाधान का उपयोग गिनती।

4. कोलाइटिस में आईएल 22-tdTomato की अभिव्यक्ति

  1. 1 एक्स 10 की एकाग्रता में आईएल 22-tdTomato चूहों से भी तिल्ली सेल निलंबन तैयार <sup> 7 कोशिकाओं बाँझ पीबीएस में / एमएल, कदम 2.1-2.4 में वर्णित है।
  2. माउस सीडी 4 सेल नकारात्मक अलगाव विधि का उपयोग कर 10 सीडी 4+ टी कोशिकाओं को शुद्ध। और विरोधी CD45RB-FITC (क्लोन 16A (पीबीएस / 1% FBS के बफर में क्लोन RM4-5, 0.5 μl / 1 x 10 6 कोशिकाओं) विरोधी सीडी 4-एपीसी के साथ उन्हें लेबल, 0.5 μl / 1 x 10 6 पीबीएस में कोशिकाओं / 1% FBS के बफर) ऊष्मायन से 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  3. 500 XG पर 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए कोशिकाओं स्पिन। पीबीएस / 1% FBS के बफर के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें और उन्हें पीबीएस / 1% FBS धुंधला बफर के 1 मिलीलीटर में resuspend।
  4. मशीन 16 एक प्रवाह cytometry पर लेबल टी कोशिकाओं चलाएँ। गेट एक टी सेल की आबादी पर कोशिकाओं और तरह CD4 + CD45RB उच्च डबल पॉजिटिव कोशिकाओं (तरंग दैर्ध्य 488 एनएम और 633 एनएम लेज़रों में पता चला)।
  5. 500 XG पर 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए centrifugation द्वारा हल कोशिकाओं हार्वेस्ट। 1 एक्स 10 6 में बाँझ पीबीएस बफर में सेल छर्रों Resuspend 6) इंजेक्षन।
  6. विभिन्न बिंदुओं पर समय सीओ 2 के तहत प्राप्तकर्ता चूहों बलिदान। कदम 2.1 और 2.2 में वर्णित है, mesenteric लिम्फ नोड्स और छोटी और बड़ी आंत हार्वेस्ट। प्रत्येक mesenteric लिम्फ नोड रखो और कटौती खुला आंत (कागज / आंत / कागज सैंडविच) 4% paraformaldehyde में (पीएफए, एक धूआं हुड के तहत संभाल) रातोंरात ऊतकों को ठीक करने के लिए। 16-24 घंटे के लिए 18% sucrose के साथ पीएफए ​​की जगह और फिर सेक्शनिंग के लिए ऊतकों फ्रीज।
  7. Cryostat मशीन का प्रयोग ऊतक 17, 18, 19 में कटौती करने के लिए। लगभग 60 मिनट के लिए कमरे के तापमान को गर्म ऊतक वर्गों और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए एसीटोन में उन्हें जगह है। लगभग 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर उन्हें सूखी।
  8. अधिक में FBS जोड़ने, पिपेट से इसे हटाने, और एक 1 पर विरोधी आरएफपी जोड़ें: 200 0.1% कमजोर पड़ने बीएसए / 1x पीबी एस। 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एंटीबॉडी सेते हैं।
  9. 10 मिनट के लिए 1x पीबीएस में वर्गों कुल्ला और ऊतकों को इसी माध्यमिक एंटीबॉडी (बकरी विरोधी खरगोश 568) लागू होते हैं, 1 पतला:% 300 1 में बीएसए / 1x पीबीएस, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए।
  10. 10 मिनट के लिए 1x पीबीएस में स्लाइड्स कुल्ला, उन्हें सूखी पोंछे, और coverslips जोड़ें।
  11. (: उत्तेजना फिल्टर 540-580 एनएम आरएफपी) 40x उद्देश्य का उपयोग कर लगातार रोशनी के तहत एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ सभी नमूनों कल्पना।

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Representative Results

एक murine आईएल -22 संवाददाता transgene आईएल 22 ठिकाना ले जाने के एक जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र को संशोधित करने के लिए recombineering का उपयोग कर बनाया गया था। चित्रा 1 sacBII जीन, एक सकारात्मक चयन मार्कर, और chloramphenicol एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन 11 से युक्त pBACe3.6 वेक्टर का एक चित्र से पता चलता है। एक्सॉन 1 में tdTomato शुरू करने के बाद, संकेत पेप्टाइड अनुक्रम बाधित किया गया था, के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है। इस प्रकार, tdTomato संवाददाता आईएल -22 व्यक्त कोशिकाओं के अंदर फंस गया था, प्रवाह cytometry द्वारा उनकी पहचान और अलगाव को सक्षम। homozygous चूहों संस्थापक लाइनों से पैदा किया गया और पीसीआर द्वारा जांच की है, और वे आदेश में एक आनुवांशिक पहचान के साथ संतानों के लक्ष्य को हासिल करने में backcrossing आवश्यकता नहीं किया था, के रूप में हमेशा की तरह दस्तक रणनीति में आवश्यक है। आईएल 22 पत्रकारों की निष्ठा का परीक्षण करने के लिए, इन विट्रो -generated splenocytes Th22 या तटस्थ की शर्तों के तहत सुसंस्कृत थे। इन विट्रो में Th22 कोशिकाओं में व्यक्त की गई थी, या तो प्रवाह cytometry या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया। विवो में, के रूप में चित्रा 4 में दिखाया गया है, आईएल -22 संवाददाता होमियोस्टैटिक शर्त के तहत विभिन्न माउस ऊतकों में पाया गया था। tdTomato संकेत के अधिकांश लामिना propria (एलपी) की कोशिकाओं को पेट से है, लेकिन कक्षा लिम्फ नोड (ALN), तिल्ली, या थाइमस में नहीं मिला था। / - - चूहों में सूजन के ऊतकों में tdTomato संवाददाता कल्पना करने के लिए, हम एक माउस कोलाइटिस मॉडल में Rag1 संवाददाता सीडी 4+ टी कोशिकाओं CD45Rb हाय के हस्तांतरण से प्रेरित किया करते थे। चित्रा 5 दर्शाता है कि पत्रकारों पहले mesenteric लिम्फ नोड्स में मौजूद है और फिर बाहर का छोटी आंत और पेट के ऊतकों के पटल Propria के अंदर जमा थे। साथ में ले ली, आईएल -22 संवाददाता चूहों की पीढ़ी के लिए इस उपन्यास विधि प्रभावी और समय की बचत है।


चित्रा 1: pBACe3.6 वेक्टर की साइट मानचित्र। pBACe3.6 chloramphenicol एंटीबायोटिक प्रतिरोध और एक सकारात्मक चयन मार्कर के रूप में एक sacBII जीन से युक्त होती है। पुनर्संयोजन के दौरान वांछित क्लोन सुक्रोज प्रतिरोधी उनकी sacBII जीन व्यक्त करने और, सूक्रोज युक्त मीडिया पर विकसित करने के लिए अनुमति दी जाती है जबकि नकारात्मक बीएसी कालोनियों सुक्रोज के प्रति संवेदनशील हैं के माध्यम से कर रहे हैं।

चित्र 2
चित्रा 2: संशोधित RP23-401E11 बीएसी क्लोन के योजनाबद्ध देखें। एक tdTomato पत्रकार जीन इल 22 ठिकाना है, जो एक murine जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र (बीएसी RP23-401E11) में आईएल 22 और नियामक तत्व शामिल हैं में पेश किया गया था, recombineering प्रौद्योगिकी का उपयोग। मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा, में इल 22 के संकेत पेप्टाइड के अनुक्रम बीएसी बाधित किया गया था और एक्सॉन इल 22 का 1 tdTomato पत्रकार जीन द्वारा बदल दिया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: splenocytes में आईएल 22 पत्रकारों की पहचान इन विट्रो में सुसंस्कृत। सीडी 4 टी कोशिकाओं तिल्ली से शुद्ध किया गया और फिर विरोधी CD28 के साथ प्रेरित; विरोधी CD3 (तटस्थ हालत); या विरोधी CD3, विरोधी CD28, विरोधी IFNƳ, विरोधी IL4, आईएल -6, TGF-β, और 6-Formylindolo (3,2-बी) Carbazole (FICZ) 5 दिनों के लिए। (: 100 माइक्रोन नीचे दो, पैमाने बार) आईएल 22-tdTomato से फ्लो (शीर्ष दो) और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया था। Quadrants में संख्या CD45 + कोशिकाओं का प्रतिशत संकेत मिलता है।लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: अलग माउस ऊतकों में कोशिकाओं आईएल 22-उत्पादन का दृश्य। एकल कोशिका निलंबन तिल्ली, थाइमस, लिम्फ नोड्स, आंतों (IEL और एलपी), और Peyer के पैच से तैयार थे। वे तो FITC-विरोधी CD3 के साथ सतह से सना हुआ और tdTomato अभिव्यक्ति के लिए जांच की गई। MLN: mesenteric लिम्फ नोड, ALN: कक्षा लिम्फ नोड, पीपी: Peyer पैच, IEL: छोटी आंत से अलग अंतःउपकला कोशिकाओं, एल.पी.: लामिना propria कोशिकाओं छोटी आंत से शुद्ध। Quadrants में संख्या CD45 + कोशिकाओं का प्रतिशत संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 5: टी-सेल हस्तांतरण कोलाइटिस के विकास के दौरान आईएल -22 संवाददाताओं का स्थानीयकरण। कोलाइटिस के विकास के दौरान अलग-अलग समय बिंदुओं पर विभिन्न ऊतकों में चूहों, और immunohistochemistry द्वारा tdTomato संकेतों का मूल्यांकन किया गया - / - आईएल -22 संवाददाता चूहों से CD4CD45RBHigh टी कोशिकाओं Rag1 में स्थानांतरित कर दिया गया। तीर आईएल 22-tdTomato संकेतों को इंगित करें। स्केल सलाखों = 25 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

आईएल 22 जन्मजात मेजबान रक्षा और ऊतक remodeling में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। आईएल -22 उत्पादक कोशिकाओं पूर्व vivo intracellular धुंधला द्वारा पहचान की गई है। हालांकि, यह अभी भी बगल में आईएल -22 अभिव्यक्ति ट्रैक करने के लिए, या तो सामान्य स्थिति में या भड़काऊ शर्तों में मुश्किल बनी हुई है। इस प्रोटोकॉल एक आईएल -22 संवाददाता माउस मॉडल है, जो हमें विवो में रिपोर्टर व्यक्त कोशिकाओं स्थानीयकरण करने के लिए सक्षम बनाता है विकसित करने के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन है। पत्रकार जीन एन्कोडिंग tdTomato एक साइट है कि संकेत अनुक्रम को बाधित में आईएल 22 लोकस में डाला गया था। रिपोर्टर में इस रणनीति का परिणाम आईएल -22 जो तेजी से स्रावित होता है के विपरीत उत्पादन सेल में फंसाया जा रहा है, उत्पादन, सेल के दृश्य सक्षम करने से। इंजीनियर आईएल 22-रिपोर्टर नियामक तत्वों के संरक्षण, इस प्रकार संवाददाता आईएल -22 की है कि इसी की अभिव्यक्ति की निष्ठा प्रदान करने के उद्देश्य के साथ एक बड़ी बीएसी के भीतर निहित किया गया था। ट्रांसजेनिक मीटर की आंतों के ऊतकोंबर्फ छोटी आंत के पटल Propria में सीडी 4 टी कोशिकाओं और सहज लिम्फोसाइटों में होमियोस्टैटिक संवाददाता अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया। प्रेरित कोलाइटिस में सीडी 4 टी कोशिकाओं पेट में रिपोर्टर व्यक्त किया।

भड़काऊ आंत्र रोग में आईएल -22 की भूमिका स्पष्ट नहीं किया गया है। आंतों श्लैष्मिक रक्षा और ऊतक उत्थान में भाग लेने से, आईएल 22, दोनों सुरक्षात्मक 20 के उत्पादन, 21 eliciting में सक्षम है 22 और proinflammatory मध्यस्थों (जैसे, आईएल -8), 23, 24। टी सेल संचालित कोलाइटिस के दो मॉडल पेट में आईएल -22 में बढ़ जाती है पता चला है, TCR α सहित - / - चूहों 25, 26 और CD45RB हाय हस्तांतरण मॉडल 27। भड़काऊ आंत्र रोग मॉडल की तुलना, आंत में आईएल -22 अभिव्यक्ति एक करोड़ रुपए में अधिक था/ - - अल्सरेटिव कोलाइटिस 21, 24 .Here के एक मॉडल में ohn रोग modelthan, हम Rag1 में संवाददाता चूहों से CD4CD45RBhi टी कोशिकाओं को हस्तांतरण प्राप्तकर्ताओं और Crohn रोग का रोगजनक प्रक्रिया की नकल। हमने पाया है कि, कोलाइटिस पूर्ववर्ती, आईएल -22 ने संवाददाताओं से आंतों draining लिम्फ नोड्स (मिलियन) में कल्पना थे। संकेत तो MLN में कम और कोलाइटिस के विकास के साथ, आंतों, विशेष रूप से बाहर का छोटी आंतों और कॉलन करने के लिए ले जाया गया। अधिकांश tdTomato संवाददाताओं से आंत के पटल Propria म्यूकोसा के अंदर स्थानीय थे।

आईएल 22 के लिए रिपोर्टर का एक अलग प्रकार का पहले से वर्णित किया गया है, जो कोशिकाओं को स्थायी रूप से ऐसी है कि वे और उनकी बेटियों के रिपोर्टर व्यक्त करने के लिए, या नहीं, आईएल 22 के प्रतिलेखन 28 को जारी रखा है जारी रखने के लिए चिह्नित कर रहे हैं। हमारे अध्ययन, पेट सहज लिम्फोसाइटों में के रूप में होमियोस्टैटिक की शर्तों के तहत चिह्नित किया गया है, और कोलाइटिस में, टीवह रिपोर्टर आंतों के ऊतकों को mesenteric लिम्फ नोड्स से टी कोशिकाओं में अनुवादित किया गया था।

प्रक्रियाओं इस प्रोटोकॉल में वर्णित ऐसे आईएल 17, आईएल 25 के रूप में अन्य ट्रांस्जीन संवाददाता चूहों, की स्थापना के लिए लागू होगी, और इतने पर। हालांकि, यह है, क्योंकि ट्रांसजीन बेतरतीब ढंग से माउस जीनोम में एकीकृत कर रहे हैं बाहर का नियामक तत्वों को ले जाने के रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति की निष्ठा आश्वस्त करने के लिए उपयुक्त बीएसी क्लोन का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है। संवाददाता माउस विवो में, साथ ही शुद्धि और जीवित कोशिकाओं के लक्षण वर्णन के लिए व्यक्त कोशिकाओं की पहचान के लिए अनुमति देता है। हम जीवित जानवर इमेजिंग अध्ययन के लिए उपयुक्त बनाने के लिए रिपोर्टर tdTomato, एक असाधारण चमकदार लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन का इस्तेमाल किया, एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन के रूप में।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RP23-401E11 BAC Thermo Fisher Scientific RPCI23.C Need gene ID: 50929
NucleoBond BAC 100 Takara Clontech 740579
PCR SuperMix High Fidelity Thermo Fisher Scientific 10790020
PI-SceI New England Biolabs R0696S
SpeI New England Biolabs R0133S
LB Broth Thermo Fisher Scientific 10855-001 1 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride 
Anti-mouse CD3 eBioscience 11-0031
Anti-mouse CD4 eBioscience 17-0041
Anti-mouse CD45 Thermo Fisher Scientific MCD4530
Anti-mouse CD45RB eBioscience 11-0455
Anti-mouse RFP Abcam Ab62341
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14175145 KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose
Dnase I Roche 10104159001
ACK lysing buffer Thermo Fisher Scientific A1049201
Percoll GE healthcare life sciences 17-0891-01
Collagenase D Roche 11088858001
Dispase II (neutral protease, grade II) Roche 4942078001
IX70 inverted fluorescence microscope Olympus Ask for quote
Nikon Eclipse 80i microscope Nikon Ask for quote
Dynal shaker Electron Microscopy Science 61050-10
FACSAria BD Bioscience Ask for quote
LSRII SORP/flow cytometry Becton, Dickinson and Company  Ask for quote

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 119 आईएल 22 संवाददाता चूहों अभिव्यक्ति जन्मजात लिम्फोसाइट कोशिकाओं प्रवाह cytometry immunohistochemistry सूजन आंत्र रोग।
आईएल -22 व्यक्त लिम्फोसाइटों रिपोर्टर चूहों का उपयोग कर के दृश्य
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Shen, W., Li, W., Hixon, J. A., Andrews, C., Durum, S. K. Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice. J. Vis. Exp. (119), e54710, doi:10.3791/54710 (2017).

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